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Un nuevo nanobiosensor magnetoelástico para la detección altamente sensible de atrazina

Resumen

A continuación, presentamos en primer lugar un nanobiosensor magnetoelástico (ME) inalámbrico, basado en materiales ME y nanopartículas de oro (AuNP), para la detección altamente sensible de atrazina empleando el inmunoensayo competitivo. En respuesta a un campo magnético variable en el tiempo, el material ME vibra longitudinalmente a su frecuencia de resonancia, lo que puede verse afectado por su carga de masa. La capa de recubrimiento de AuNPs sobre el material ME contribuye a su biocompatibilidad, estabilidad y sensibilidad. El anticuerpo atrazina se orientó inmovilizado en la superficie del material ME recubierto de AuNPs a través de la proteína A, mejorando el rendimiento del nanobiosensor. El análisis con microscopio de fuerza atómica (AFM) demostró que la inmovilización del anticuerpo contra la atrazina fue exitosa. Además, para mejorar la sensibilidad, se indujo al conjugado de atrazina-albúmina (Atr-BSA) a competir con la atrazina para unirse con el anticuerpo de la atrazina, amplificando la respuesta de la señal. El cambio de frecuencia de resonancia es inversa y linealmente proporcional al logaritmo de las concentraciones de atrazina que van desde 1 ng / mL a 100 μg / mL, con una sensibilidad de 3,43 Hz / μg mL −1 y el límite de detección de 1 ng / mL, que es significativamente más bajo que el estándar establecido por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA). Los resultados experimentales indicaron que el nanobiosensor ME mostró una fuerte especificidad y estabilidad hacia la atrazina. Este estudio proporciona un nuevo método conveniente para la detección rápida, selectiva y altamente sensible de atrazina, que tiene implicaciones para sus aplicaciones en el monitoreo de la calidad del agua y otros campos de detección ambiental.

Introducción

Con el rápido desarrollo de la industria y la agricultura, se liberaron cada vez más contaminantes ambientales en el entorno ecológico [1], lo que provocó una preocupación generalizada sobre las investigaciones pertinentes [2, 3]. En los últimos años, se han utilizado herbicidas en cantidades cada vez mayores para mejorar la calidad y el rendimiento en los campos agrícolas, pero muchos herbicidas pueden permanecer activos en el agua y el suelo durante años y causar una grave contaminación ambiental [4]. La contaminación por herbicidas ha atraído una atención considerable debido a su contaminación ecológica en el agua o en los productos agrícolas [5]. Entre los herbicidas, la atrazina (2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-1, 3, 5-triazina) es el más utilizado para el control de plantas de hoja ancha y malezas herbáceas en todo el mundo [6].

Aunque la atrazina tiene cierto efecto inhibidor sobre algunas malezas perennes, como contaminante ambiental, es altamente tóxica [7] y puede causar riesgos para la salud de los seres humanos y otras especies animales [8]. Las altas concentraciones a largo plazo de la ingesta de atrazina pueden perjudicar la salud humana o animal, como cáncer, defectos de nacimiento y daños al corazón y al hígado [9, 10]. Estados Unidos, la Unión Europea y Japón han incluido la atrazina en la lista de sustancias químicas que alteran el sistema endocrino [11]. En los EE.UU., la Agencia de Protección Ambiental (EPA) permite el límite permisible de 3 μg / L (Nivel de Asesoramiento de Salud de por Vida) de atrazina en el agua potable [12]. Por lo tanto, es necesario cuantificar con precisión la atrazina a bajas concentraciones.

Se han desarrollado muchas técnicas analíticas convencionales para la detección de atrazina, incluida la CL acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) [13], la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [14] y la cromatografía de gases acoplada también con espectrometría de masas (GC-MS ) [15], pero estos métodos también tienen algunas limitaciones, como su elevado coste, la necesidad de grandes instrumentos, la escasa selectividad y la lentitud [16].

Como plataforma inalámbrica sensible a la masa, el sensor magnetoelástico (ME) hecho de material ME ha sido ampliamente desarrollado para diversas aplicaciones debido a sus ventajas críticas de bajo costo, alta sensibilidad, tamaño más pequeño y facilidad de uso [17, 18]. Actualmente, los sensores ME suelen estar hechos de materiales de aleaciones ferromagnéticas amorfas, como Metglas 2826 MB (Fe 40 Ni 38 Mo 4 B 18 ) [19]. Bajo los campos magnéticos alternos y estáticos aplicados externamente, el material ME vibra longitudinalmente a su frecuencia de resonancia [20], generando una densidad de flujo magnético que puede ser detectada de forma inalámbrica por una bobina captadora sin ninguna conexión física directa [21]. Según Eq. (1) [22], la frecuencia de resonancia fundamental f 0 depende de la longitud del material L , densidad ρ , módulo de elasticidad E y la relación de Poisson v .

$$ {f} _0 =\ frac {1} {2L} \ sqrt {\ frac {E} {\ rho \ left (1- {v} ^ 2 \ right)}} $$ (1)

Una pequeña carga de masa adicional ∆m depositado en la superficie del material ME de masa M ( ∆m M ) provoca un cambio en la frecuencia de resonancia ( ∆f ), que viene dada por la Ec. (2) [23].

$$ \ frac {\ Delta f} {\ Delta m} =- \ frac {f_0} {2M} $$ (2)

Según las propiedades únicas del material ME anteriores, la frecuencia de resonancia del material ME disminuye con un aumento de la carga de masa adicional. Así, mediante su funcionalización con una película sensora, los materiales ME se han desarrollado para análisis físicos, químicos y biológicos, como la detección de estrés / presión [24], temperatura / humedad [25], dióxido de carbono [26], endotoxina [27], Salmonella typhimurium / Bacillus anthracis esporas [28] y Escherichia coli O157:H7 [29]. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha aplicado ninguna aplicación del material ME en la detección de atrazina.

En esta investigación, utilizando sus excelentes propiedades y ventajas, propusimos en primer lugar un nanobiosensor ME inalámbrico que emplea el material ME como sustrato y nanopartículas de oro (AuNP) como capa de recubrimiento, para la detección de atrazina a nivel de ppb sobre la base del inmunoensayo competitivo directo. procedimientos. En comparación con la inmovilización de anticuerpos covalente-aleatoria, la estrategia de orientación covalente es más beneficiosa para mejorar la sensibilidad del nanobiosensor. Debido a que la proteína A es una alternativa interesante para unirse específicamente con la región de inmunoglobulina Fc del anticuerpo, se empleó para la inmovilización orientada del anticuerpo atrazina [30], dando la mayor densidad de inmovilización, para exhibir una mejor eficiencia de unión al antígeno y mejorar el rendimiento del nanobiosensor. [31]. El inmunoensayo competitivo directo para atrazina se construyó mediante la inmovilización orientada del anticuerpo de atrazina contra la proteína A modificada covalentemente en la superficie del material ME recubierto de AuNP, seguido de la reacción competitiva del conjugado de atrazina-albúmina (Atr-BSA) y atrazina con el anticuerpo de atrazina. Se indujo a Atr-BSA para amplificar las respuestas de la señal, lo que a su vez aumentó significativamente la sensibilidad del nanobiosensor. Se evaluó la eficiencia del nanobiosensor ME, demostrando que se desarrolló con éxito un nuevo nanobiosensor ME para la detección de concentraciones de trazas de atrazina.

Materiales y métodos

Materiales

El anticuerpo de atrazina, el antígeno conjugado de atrazina-albúmina (Atr-BSA), la atrazina y la proteína A se compraron en EastCoast Bio (Maine, EE. UU.). Se obtuvieron simazina, prometrina y diclorodifeniltricloroetano (DDT) de Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd. Cisteamina, clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N -hidroxisulfosuccinimida (NHS), albúmina de suero bovino (BSA, 99%) y solución salina tamponada con fosfato (tampón PBS, pH =7,4) se adquirieron de Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, EE. UU.).

Fabricación de nanobiosensor ME

Preparación de la plataforma de nanosensores ME

Cintas de material ME compuestas de aleación Metglas 2826 (Fe 40 Ni 38 Mo 4 B 18 ) se adquirieron de Honeywell Corporation (Morristown, Nueva Jersey, EE. UU.) y se cortaron en 5 mm x 1 mm x 0,028 mm utilizando una máquina de corte por láser controlada por ordenador. Para eliminar la película orgánica y los residuos, las cintas ME se limpiaron ultrasónicamente en acetona y etanol cada una durante 10 minutos y se enjuagaron en agua desionizada, luego se secaron en una corriente de nitrógeno (Fig. 1a). Se pulverizó una capa de nanopartículas de cromo de ~ 100 nm de espesor en ambos lados de la superficie de la cinta ME para mejorar la adhesión entre las AuNP y la superficie de la cinta. Posteriormente, ambos lados de la superficie de la cinta ME revestida con cromo se pulverizaron con AuNP para mejorar la biocompatibilidad y proteger la cinta de la oxidación y la corrosión. La imagen del microscopio electrónico de barrido (SEM) de la Fig. 1 mostró que las AuNP revestidas en la cinta ME tenían un tamaño esférico. AuNPs y -SH pueden formar fácilmente el enlace Au-S. Además de sus atractivas ventajas de bajo precio, no corrosión, biocompatibilidad y no toxicidad [32], los AuNP pueden proporcionar una interfaz excelente para la modificación de elementos químicos o de bioreconocimiento [33, 34]. Posteriormente, las cintas ME se recocieron en un horno de vacío a 200 ° C durante 2 h para aliviar la tensión interna residual y promover la adhesión de la capa de AuNPs a las cintas ME. Luego, las plataformas de nanosensores ME se terminaron y estuvieron listas para la inmovilización de anticuerpos contra la atrazina (Fig. 1b).

La representación esquemática de los procedimientos de funcionalización de nanobiosensores ME:( a ) la cinta ME desnuda; ( b ) el revestimiento de AuNPs; ( c ) la capa SAM; ( d ) la inmovilización de proteína A; ( e ) la modificación del anticuerpo; ( f ) Bloqueo de BSA; ( g ) atrazina y Atr-BSA combinados de forma competitiva con el anticuerpo; Imagen SEM de la superficie del nanosensor recubierta de AuNPs

Inmovilización de anticuerpo de atrazina

Las plataformas de nanosensores recubiertas de AuNP se limpiaron ultrasónicamente con acetona, isopropanol, agua desionizada y etanol cada una durante 5 min, y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. Luego, las plataformas de nanosensores se sumergieron en solución de cisteamina (10 mM) durante 12 ha temperatura ambiente para obtener una monocapa autoensamblada (SAM) (Fig. 1c). La proteína A (1 mg / ml) se activó con 4 mg / ml de EDC-4 mg / ml de NHS durante 30 min a temperatura ambiente. Después de eso, la proteína A activada se incubó en los nanosensores modificados con SAM durante 30 min a 37 ° C y se enjuagó con tampón PBS (Fig. 1d). A continuación, las plataformas de nanosensores se incubaron con anticuerpo de atrazina durante 50 min y se lavaron con tampón PBS (Fig. 1e). Para evitar la adsorción inespecífica, los nanosensores recubiertos con anticuerpo de atrazina se trataron adicionalmente con BSA al 0,5% durante 30 min, y luego se enjuagaron con tampón PBS para eliminar cualquier BSA no unido y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. Finalmente, los nanobiosensores ME se fabricaron para la detección de atrazina (Fig. 1f).

Medición de señal

La frecuencia de resonancia del nanobiosensor ME se midió utilizando una bobina captadora enrollada alrededor de un vial, junto con un analizador de redes vectoriales (AV3620A, el 41st Institute of CETC, Qingdao, China), como se representa esquemáticamente en la Fig. 2. Para generar una alternancia campo magnético, el analizador de red conectado con la bobina captadora se hizo funcionar en el S 11 modo para proporcionar una señal de frecuencia de barrido a la bobina, y puede monitorear la señal reflejada de la bobina. Además, se aplicó un campo magnético estático generado por una barra magnética para mejorar el comportamiento de resonancia. Los nanobiosensores se insertaron de forma vertical e inalámbrica (sin conexiones de cables con el sistema de medición) en el vial que contenía 30 μL de soluciones de muestra para analizar. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C) en un sistema disolvente PBS (0,1 M, pH 7,4). La frecuencia de resonancia del nanobiosensor se puede determinar mediante la medición del S 11 parámetro, que fue monitoreado y registrado cada 5 min.

La representación esquemática del sistema de medición nanobiosensor inalámbrico ME

Resultados y discusión

Caracterización de la morfología de la superficie del nanobiosensor

Se realizó la observación con microscopio de fuerza atómica (AFM, ND-100, Park System, Corea) de la superficie del nanobiosensor para examinar el efecto de inmovilización del anticuerpo contra la atrazina. Las imágenes AFM del nanobiosensor recubierto de AuNP y la superficie del nanobiosensor modificado con anticuerpo se presentan en la Fig. 3a, b, respectivamente. Está claro que el aumento de la rugosidad de la superficie se debe al anticuerpo atrazina inmovilizado covalentemente. El análisis exhaustivo de la topografía de las secciones transversales de AFM muestra que el nanobiosensor recubierto de AuNPs tiene una variación de altura de 13,421 nm; sin embargo, el valor aumentó a 28,425 nm después de la modificación del anticuerpo. Como es bien sabido que el diámetro del anticuerpo molecular es de aproximadamente 15 nm, obviamente se concluye que la inmovilización del anticuerpo atrazina es exitosa.

Imágenes AFM de ( a ) los recubiertos de AuNP y ( b ) superficie nanobiosensor modificada con anticuerpos

Optimización para la concentración de anticuerpo de atrazina

La concentración de inmovilización del anticuerpo tiene una influencia importante en la sensibilidad del nanobiosensor. Por lo tanto, fue necesario evaluar la respuesta de frecuencia de resonancia del nanobiosensor con diferentes concentraciones de inmovilización de anticuerpo atrazina (25 μg / mL, 50 μg / mL, 75 μg / mL, 100 μg / mL). En la Fig. 4, podemos ver que el cambio de frecuencia de resonancia alcanzó un máximo de 50 μg / mL. Cuando la concentración de anticuerpo atrazina subió a 75 μg / mL, la respuesta comenzó a declinar debido al impedimento estérico y la repulsión electrostática [35]. Es decir, el anticuerpo de atrazina de 50 μg / ml puede alcanzar una inmovilización relativamente saturada. Por lo tanto, 50 μg / mL fue la concentración óptima de anticuerpo atrazina para la inmovilización.

La respuesta de frecuencia del nanobiosensor ME con diferentes concentraciones de inmovilización de anticuerpo atrazina (0 μg / mL, 25 μg / mL, 50 μg / mL, 75 μg / mL, 100 μg / mL)

Optimización para la concentración de Atr – BSA

En la inmunorreacción, la atrazina y Atr-BSA compitieron por el número limitado de sitios de anticuerpos de atrazina en la superficie del nanobiosensor. Por lo tanto, con la concentración óptima de anticuerpo de atrazina para la inmovilización, la concentración de trabajo de Atr-BSA, como factor importante, afecta la sensibilidad del nanobiosensor. El proceso de optimización se investigó determinando la respuesta de frecuencia de resonancia del nanobiosensor ME a Atr-BSA de diferentes concentraciones (20 μg / mL, 40 μg / mL, 60 μg / mL, 80 μg / mL). Como se indica en la Fig. 5, la respuesta máxima se observó a 40 μg / mL. Por tanto, se utilizaron 40 μg / ml de Atr-BSA en la siguiente determinación.

La respuesta de frecuencia del nanobiosensor ME a Atr – BSA de diferentes concentraciones (20 μg / mL, 40 μg / mL, 60 μg / mL, 80 μg / mL)

Detección de atrazina

La Figura 6 muestra la respuesta de frecuencia en tiempo real del nanobiosensor ME medido en la mezcla de muestra de 15 μL de Atr-BSA (40 μg / mL) y 15 μL de atrazina con diferentes concentraciones (0 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL, 1000 ng / mL, 10 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL). Como se muestra en la Fig. 1g, la atrazina y Atr-BSA se combinaron de manera competitiva con el anticuerpo inmovilizado en la superficie del nanobiosensor, lo que a su vez conduce a un aumento de la carga de masa en la superficie del nanobiosensor, provocando en consecuencia una disminución de la frecuencia de resonancia con la incubación hora. A partir de la Fig. 6 se desprende claramente que la respuesta de estado estable se alcanza generalmente en aproximadamente 50 min. Se fijaron la concentración de Atr-BSA y el número de sitios de anticuerpos de atrazina, por lo que la cantidad de Atr-BSA enlazada en el nanobiosensor fue inversamente proporcional a la concentración de atrazina en solución. El peso molecular de Atr-BSA es mayor que el de la atrazina. Por tanto, la frecuencia de resonancia del nanobiosensor cambia inversamente a la concentración de atrazina en solución. Como se muestra en la Fig. 6, la velocidad y la magnitud del cambio de frecuencia de resonancia disminuyeron con el aumento de las concentraciones de atrazina, y una concentración más alta de atrazina puede inducir un cambio de frecuencia de resonancia más pequeño. La curva de la Figura 6 * representa una respuesta de fondo del sensor de control en blanco (sin inmovilización de anticuerpo de atrazina) a Atr-BSA, que es aproximadamente 48 Hz mucho menor que la señal de detección, lo que indica que la adsorción no específica puede ignorarse. Por lo tanto, la concentración de atrazina se puede detectar a través del cambio de frecuencia de resonancia del nanobiosensor inalámbrico ME, con una relación inversamente proporcional.

Respuestas de frecuencia en tiempo real a diferentes concentraciones de atrazina que van desde 0 a 100 μg / mL. * La respuesta de control en blanco (sin inmovilización de anticuerpos contra atrazina) a Atr – BSA

La curva de calibración estándar para la detección de atrazina en el nanobiosensor ME durante los primeros 50 minutos se muestra en la Fig. 7. Para cada concentración, los experimentos de calibración del nanobiosensor se realizaron cinco veces en condiciones idénticas. Se encuentra que el cambio de frecuencia de resonancia es lineal con el valor logarítmico de las concentraciones de atrazina que van desde 1 ng / mL a 100 μg / mL, que puede ser representado por ∆f =54,717 log C Atrazina - 442,45 ( R 2 =0,971). La sensibilidad se calcula en 3,43 Hz / μg mL −1 . Es evidente a partir de la Figura 7 que el límite de detección (LOD) es 1 ng / mL, que es significativamente más bajo que el límite superior permisible para atrazina de 3 μg / L dado en la EPA de los EE. UU., Cumpliendo con el estándar actualmente disponible. Además, el límite de detección es evidentemente más bajo que el de los métodos informados anteriormente [36, 37]. Se ha demostrado que se estableció con éxito un nanobiosensor inalámbrico, de bajo costo y altamente sensible para la detección de atrazina en tiempo real.

Curva de calibración:el cambio de 50 min en la frecuencia de resonancia en función de diferentes concentraciones de atrazina

Dado que la atrazina es la molécula pequeña, se empleó un método de inmunoensayo competitivo directo para mejorar la sensibilidad del nanobiosensor ME. En el inmunoensayo competitivo directo, el anticuerpo se modifica en la superficie del sensor y la respuesta de la señal resulta de la unión de la molécula Atr-BSA. Por el contrario, en el inmunoensayo competitivo indirecto, Atr-BSA se inmoviliza en la superficie del sensor y la respuesta resulta de la unión de la molécula de anticuerpo. Según las investigaciones de la literatura [38] y nuestros resultados, el inmunoensayo competitivo directo es factible para el seguimiento de moléculas pequeñas. El inmunoensayo competitivo indirecto es muy sensible a la muestra de analito con trazas de concentración [39]. Aunque el inmunoensayo competitivo indirecto tiene una mayor sensibilidad [40, 41], puede ser complicado de operar y difícil de implementar para un uso confiable repetido [36]. Sin embargo, el inmunoensayo competitivo directo es muy rápido, fácil de usar y autónomo; no se necesitan reactivos adicionales [36]. Por lo tanto, para el desarrollo futuro, el inmunoensayo competitivo directo puede ser el método más prometedor.

Especificidad del nanobiosensor ME

La especificidad del nanobiosensor ME para la atrazina se investigó determinando las respuestas del nanobiosensor a algunos otros pesticidas, como prometrina, simazina y DDT, como se muestra en la Fig. 8. En la Fig. 8 era evidente que el nanobiosensor ME mostraba pocas respuestas a estos las interferencias debidas a la absorción no específica y las respuestas a la prometrina y la simazina fueron ligeramente mayores que las del DDT, que tuvo un nivel de respuesta similar a la solución en blanco. Puede deberse al hecho de que tanto la prometrina como la simazina tienen estructuras similares con la atrazina, que pertenece a los plaguicidas de triazina; sin embargo, el DDT es un tipo de insecticidas organoclorados. Los resultados indicaron que la atrazina se reconoció eficazmente y se combinó específicamente con el anticuerpo inmovilizado en la superficie del nanobiosensor. Por lo tanto, el nanobiosensor ME mostró una fuerte especificidad para la detección de atrazina.

Respuesta de frecuencia de resonancia del nanobiosensor ME a otras interferencias con la concentración de 100 μg / mL

Estabilidad del nanobiosensor ME

La Figura 9 muestra la estabilidad del nanobiosensor ME hacia la detección de atrazina. Se prepararon seis de los mismos nanobiosensores ME y se almacenaron a 4 ° C, cada uno de los cuales se probó con respecto a 10 ng / ml de atrazina en días alternos hasta 6 días. Cada ciclo de detección solo probó un nanobiosensor durante 50 min. Está claro que las respuestas de frecuencia de resonancia de los nanobiosensores permanecen casi constantes y se calcula que la desviación estándar relativa (RSD) es del 1,8%. El resultado demuestra que el nanobiosensor ME exhibe una excelente estabilidad para la detección de atrazina.

Mediciones de estabilidad de 10 ng / mL de atrazina en el nanobiosensor ME

Conclusiones

Se desarrolló con éxito un nanobiosensor inalámbrico ME basado en materiales ME y AuNP para la detección en tiempo real y altamente sensible de atrazina empleando el inmunoensayo competitivo. La inmovilización orientada del anticuerpo atrazina a través de la proteína A mejoró el rendimiento del nanobiosensor. Atr-BSA con masa molecular pesada y atrazina combinada competitivamente con anticuerpo de atrazina en la superficie del nanobiosensor, amplificando las respuestas de la señal, lo que a su vez mejoró la sensibilidad. El cambio de frecuencia de resonancia inducido principalmente por la unión Atr-BSA es inversamente proporcional a la concentración de atrazina objetivo. Además, las concentraciones de trabajo de anticuerpo atrazina y Atr-BSA se optimizaron para ser 50 μg / mL y 40 μg / mL, respectivamente. En condiciones óptimas, el nanobiosensor ME muestra rangos de determinación ampliamente lineales para atrazina desde 1 ng / mL a 100 μg / mL, con una sensibilidad satisfactoria de 3,43 Hz / μg mL −1 y el límite de detección de 1 ng / mL, que es suficiente para los requisitos legislativos y es más bajo que otros métodos informados. Las imágenes de AFM verificaron que el anticuerpo de atrazina se inmovilizó con éxito en la superficie del nanobiosensor de manera orientada. Los resultados experimentales demuestran que el nanobiosensor ME tiene una alta especificidad y estabilidad hacia la atrazina. Beneficiándose de sus efectos sobre los límites de detección, la simplicidad, la propiedad desechable y la naturaleza inalámbrica, el estudio no solo propuso un nuevo método para la detección altamente sensible de atrazina, sino que también indicó su viabilidad potencial para la detección de otros contaminantes ambientales y el monitoreo de la calidad del agua.

Abreviaturas

AFM:

Microscopio de fuerza atómica

Atr – BSA:

Antígeno conjugado de atrazina-albúmina

AuNPs:

Nanopartículas de oro

BSA:

Albúmina de suero bovino

DDT:

Diclorodifeniltricloroetano

EDC:

Clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida

YO:

Magnetoelástico

NHS:

N -Hidroxisulfosuccinimida

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

SAM:

Monocapa autoensamblado

SEM:

Microscopio electrónico de barrido

EPA de EE. UU .:

Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos


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