Biosensor de metamaterial de terahercios totalmente metálico para la detección de proteínas

Introducción

Hoy en día, los médicos suelen recolectar suero de pacientes en el hospital para varios exámenes. Tales como la detección de tumores [1,2,3] y la detección de virus [4,5,6], etc. El método preliminar para la detección de tumores es la detección de proteínas, porque las proteínas son los componentes de muchos marcadores tumorales, y estas biomoléculas con una gran cantidad de existe información en el suero. Las albúminas séricas son las proteínas de la fracción total soluble en agua más abundantes (52-62%) en el plasma sanguíneo [7, 8]. Además, las funciones nutricionales y fisiológicas de las albúminas séricas las convierten en biomacromoléculas esenciales. Como una de las albúmina de suero más populares, la albúmina de suero bovino (BSA) se utiliza en muchos campos de investigación. Por tanto, la investigación sobre la detección de BSA es bastante importante. Hay muchos métodos para detectar y determinar la concentración de BSA, incluida la espectroscopia de impedancia electroquímica [9], la electroforesis capilar [10] y las técnicas de dispersión de la luz [11]. Pero todos tienen algunas desventajas, como procedimientos complicados, poca reproducibilidad o lentos. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos biosensores tiene una importancia considerable y tiene una gran demanda.

La onda THz se encuentra entre la onda óptica infrarroja y de microondas y en la región de transición de la electrónica a la fotónica. En comparación con las ondas de luz, la energía de los fotones en esta banda es muy baja. Esto significa que las ondas de terahercios no causarán daños por ionización por radiación a las moléculas biológicas. Muchas macromoléculas biológicas también tienen huellas dactilares únicas en la banda de terahercios [12,13,14,15]. Por lo tanto, las ondas de terahercios han recibido una atención considerable en el campo de la biodetección [16, 17].

Los metamateriales son materiales electromagnéticos artificiales compuestos por estructuras de sublongitud de onda. Su resonancia electromagnética única tiene muchas características, como un RI negativo [18, 19], transparencia inducida electromagnéticamente [20, 21] y una sensibilidad ambiental extrema [22, 23]. Los metamateriales sensibles al entorno circundante, especialmente los compuestos por estructuras metálicas de sublongitud de onda [24, 25, 26], se han utilizado ampliamente para detectar diversas biomoléculas. La combinación de ondas de terahercios y metamateriales proporciona un nuevo método de detección para las moléculas biomédicas, que no solo logra la detección sin etiquetas, sino que también actualiza el límite de resolución de los sensores existentes. Además, la detección se puede completar de forma rápida y sencilla utilizando una pequeña cantidad de analito sin reactivos químicos.

A frecuencias de THz, la producción de metamaterial generalmente se basa en métodos de procesamiento a nivel de micras. La fotolitografía [27] o la litografía por haz de electrones [28] se utiliza principalmente para transferir patrones micro-nano desde la fotorresistencia a la superficie de los materiales funcionales, y luego se requiere grabado en húmedo [29, 30] o en seco [31, 32] para completar el procesamiento final de los metamateriales. A través de los pasos anteriores, se puede lograr la construcción de gráficos finos, pero desafortunadamente, la mayoría de estos métodos exigen equipos de procesamiento costosos, entornos de operación de alto estándar y procedimientos de procesamiento engorrosos. La perforación por láser [33, 34] es la primera tecnología práctica de procesamiento por láser, y también es uno de los principales campos de aplicación del procesamiento por láser. El rayo láser está muy concentrado en el espacio y el tiempo. Al enfocar con una lente, el diámetro del punto se puede reducir a un nivel de micras y la densidad de potencia del láser de 10 ⁵ –10 ¹⁵ W / cm ² Puede ser obtenido. Con una densidad de potencia tan alta, la perforación con láser se puede realizar en casi cualquier material. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se aplica la tecnología de perforación por láser en la fabricación de biosensores de metamateriales, lo que puede reducir significativamente el costo de procesamiento de los biosensores de metamateriales y promover sus aplicaciones prácticas.

En este estudio, se propuso un biosensor de terahercios de alta sensibilidad para la detección de proteínas basado en metamateriales totalmente metálicos, simulado teóricamente y demostrado experimentalmente. El dispositivo era sencillo de fabricar, rentable y bastante estable. Estaba compuesto de material de acero inoxidable y fabricado con tecnología de perforación por láser. En un primer momento, este sensor de metamaterial se simuló y analizó mediante el método de integral finita y se calculó la sensibilidad del índice de refracción. Luego, se fabricó y midió este biosensor de metamaterial THz. Los experimentos confirmaron la alta sensibilidad de este señor al ambiente externo. Se eligió BSA como sustancia de detección para evaluar la eficacia del biosensor. Se utilizó la fórmula de Hill para ajustar los datos experimentales. Una sensibilidad de detección de 72,81 GHz / (ng / mm ² ) y se obtuvo el límite de detección (LOD) de 0.035 mg / mL. Las mediciones se repitieron tres veces para verificar la confiabilidad del biosensor.

Diseño

La Figura 1a muestra la estructura del biosensor de terahercios metamaterial totalmente metálico propuesto. Se formó un patrón hueco con mancuernas con una disposición periódica a lo largo de las direcciones xey en una placa de acero inoxidable de 50 μm de espesor (conductividad de 1,4 × 10 ⁶ S / m). Los tamaños de período P _x y P _años de la estructura de la unidad son 500 μm y 300 μm, respectivamente. La longitud de la mancuerna hueca L y espacio H son 294 μm y 60 μm, respectivamente. El radio R de círculos en ambos extremos de la mancuerna hueca es de 60 μm. El biosensor tenía un diseño estructural totalmente metálico y no tenía un sustrato dieléctrico tradicional. La onda de terahercios es perpendicular a la superficie del biosensor del metamaterial.

un Diagrama de matriz tridimensional y diagrama de estructura celular del biosensor. Los parámetros estructurales son P _x =500 micras, P _años =300 micras, L =294 micras, H =60 micras, R =60 μm. b Transmisión simulada del biosensor

Métodos y simulación

Luego, se utilizó la simulación tridimensional de campo electromagnético de onda completa a través del método integral finito (software comercial CST) para las siguientes simulaciones. Se aplicaron condiciones de contorno periódicas en el x y y direcciones, y la capa perfectamente emparejada se utilizó en la dirección de propagación de onda de z . Como se muestra en la esquina superior derecha de la Fig. 1a, el vector de onda del campo electromagnético incidente k _z era una onda plana que se propagaba en z -eje, y los campos eléctricos y magnéticos se polarizaron a lo largo del y -axis y x -eje, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 1b, hubo un pico de transmisión de 0,48 THz.

Para estudiar el mecanismo físico de la generación de este pico de resonancia, se simularon la corriente superficial y el campo magnético del biosensor en la frecuencia del pico de resonancia. Como se muestra en el lado izquierdo de la Fig.2, las ondas electromagnéticas incidentes se polarizaron a lo largo de y eje, induciendo oscilaciones de carga en ambos extremos de la abertura, dando como resultado un dipolo eléctrico. Las oscilaciones de carga fueron acompañadas por oscilaciones de corriente contrarrotantes a lo largo de los bordes de los dos orificios circulares que comprendían las aberturas. Esto condujo a un par de dipolos magnéticos fuera del plano contraorientados. Como se muestra en el lado derecho de la Fig.2, había un par de dipolos magnéticos opuestos obvios en el z eje conectado de extremo a extremo para formar un dipolo toroidal. Por lo tanto, la respuesta del metamaterial estuvo dominada por una combinación de dipolos eléctricos y toroidales.

Diagrama de distribución de corriente superficial simulado y diagrama de distribución magnética (y =0 μm) a 0,48 THz

Debido a que las prestaciones del sensor se ven afectadas por los parámetros de la estructura, es necesario optimizar los parámetros estructurales durante el procedimiento de diseño. La Figura 3 muestra el efecto de los cambios de tamaño estructural en los espectros de transmisión. Como se muestra en la Fig. 3a, cuando la longitud de la mancuerna hueca aumentó de 290 a 298 μm, la frecuencia máxima de los espectros de transmisión se desplazó al rojo de 0,48 THz. Como se muestra en la Fig. 3b, cuando el espacio de la mancuerna hueca aumentó de 56 a 64 μm, la frecuencia máxima de los espectros de transmisión cambió al azul de 0,48 THz. Como L y H aumentado, el pico de resonancia comenzó a moverse hacia la frecuencia baja y alta, respectivamente. Cuando el radio del círculo varió de 56 a 64 μm y el grosor del acero inoxidable varió de 40 a 60 μm, la posición del pico de resonancia cambió ligeramente. Por lo tanto, es más fácil ajustar la frecuencia de resonancia del biosensor de metamaterial ajustando la longitud de la mancuerna hueca L y el espacio de la mancuerna hueca H.

Espectros de transmisión de a diferente longitud L , b espacio H , c radio R y d espesor de la placa de acero inoxidable

También es muy importante estudiar la influencia del ángulo de incidencia y el ángulo de polarización en los espectros de transmisión. La onda electromagnética incidió verticalmente y luego se cambiaron los ángulos de incidencia y polarización. La definición de estos ángulos se muestra en la Fig. 4a. El ángulo de incidencia significa θ _i en el plano y – z, y la polarización es θ _p en el plano x – y. Como se muestra en la Fig. 4b, cuando el ángulo de incidencia cambió de 0 ° a 15 °, la diferencia de la frecuencia del pico de resonancia fue de solo 9 GHz. Como se muestra en la Fig. 4c, cuando el ángulo de polarización aumentó de 0 ° a 15 °, la diferencia en la frecuencia de pico de resonancia fue de casi 0 GHz, pero la amplitud del pico de resonancia disminuyó en aproximadamente 0,1. Esto mostró que el biosensor era casi insensible a los cambios en los ángulos de polarización e incidencia, lo que es beneficioso para las aplicaciones prácticas de biosensor.

un Diagrama esquemático del ángulo de incidencia cambiante θ _i y ángulo de polarización θ _p . Espectros de transmisión frente a b el ángulo de incidencia y c el ángulo de polarización

Para explorar el rendimiento de detección del biosensor, se agregó una capa delgada de analito de 120 μm a este biosensor de metamaterial como se muestra en la Fig.5a, luego se simularon diferentes espectros de transmisión de este biosensor de metamaterial cuando el índice de refracción del analito cambió como se muestra en la Fig. .5b. La sensibilidad de RI S se definió como la relación entre las variaciones en la posición del pico de transmisión y la unidad RI ( S =Δ f / Δ n ). A medida que aumentaba el RI del analito, la frecuencia máxima de resonancia se desplazaba al rojo. A continuación, se recogió el cambio de frecuencia de pico de resonancia correspondiente a cada IR. Se observó buena linealidad. El resultado de ajuste de la Fig. 5c muestra que la sensibilidad al RI fue 294,95 GHz / RIU.

un Vista en sección transversal y vista superior del diagrama del modelo del biosensor de metamaterial con una capa delgada de analito de 120 μm. b Influencia de los cambios en el RI del analito en los espectros de transmisión del biosensor. c Ajuste lineal correspondiente del cambio de frecuencia del pico con el RI correspondiente

El rendimiento de la detección también se cuantificó utilizando la figura de mérito (FOM), que se definió como:

$$ {\ text {FOM}} =\ frac {S} {{{\ text {FWHM}}}} $$ (1)

donde S es la sensibilidad y FHWM es el ancho completo a la mitad del máximo del pico de resonancia. El FOM de este biosensor fue 4.03.

Para la mayoría de las estructuras de metamateriales, generalmente utilizan materiales dieléctricos como sustratos. Sin embargo, este biosensor de metamaterial propuesto en este artículo se basó en un metamaterial totalmente metálico con un diseño totalmente de acero inoxidable y se utilizó aire como sustrato. En comparación con los materiales dieléctricos tradicionales, como el tereftalato de polietileno (PET), el cuarzo y el silicio, el aire tiene el IR más bajo. Para evaluar el papel del sustrato, se volvieron a simular estos biosensores de metamateriales utilizando diferentes sustratos, y posteriormente se calcularon las sensibilidades del índice de refracción y los valores de FOM. Como se muestra en la Fig. 6, a medida que aumentaba el RI del sustrato, la sensibilidad del RI y la FOM del sensor comenzaron a disminuir. Este resultado indicó que el biosensor con un RI de sustrato más bajo tenía un mejor rendimiento de detección.

Las sensibilidades y FOM cuando se utilizan diferentes sustratos

Para investigar más a fondo el principio de detección del biosensor, se simularon los diagramas de distribución del campo eléctrico, como se muestra en la Fig. 7. Las vistas superior y lateral de la distribución del campo eléctrico simulado demostraron que la energía del campo eléctrico se concentraba principalmente en parte del acero inoxidable. agujeros. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que el analito se haya agregado a los orificios.

Distribuciones de campo eléctrico simuladas. un Vista superior, b vista lateral ( y =0 μm)

La Tabla 1 resumió la sensibilidad RI y FOM del sensor propuesto, y las comparó con otros estudios reportados [35,36,37]. Los otros sensores de THz se basan todos en procesos de fotolitografía tradicionales. Se puede ver que el biosensor de metamaterial de acero inoxidable que diseñamos tenía un rendimiento de detección excelente utilizando tecnología de perforación láser barata.

Experimento

Materiales y preparación de muestras

Luego, con el fin de demostrar la capacidad de biodetección del sensor de metamaterial de THz propuesto, se realizó la detección de proteínas en el experimento. El tampón BSA y PBS se adquirieron de Sigma-Aldrich. La solución de BSA se formuló en tampón PBS (pH =7,4).

En la figura 8 se muestra una imagen de microscopio del biosensor de metamaterial fabricado. El tamaño total del biosensor de metamaterial fue de 12 mm × 12 mm.

Micrografía de la muestra de biosensor fabricada

Las concentraciones de la solución de BSA formulada fueron 0,2 mg / ml, 0,5 mg / ml, 2,0 mg / ml y 4,0 mg / ml. El analito se añadió a la superficie del biosensor mediante el método de deposición líquida. Cada vez, se transfirieron 150 μL de solución de BSA a la superficie del biosensor con una pistola de pipeta, y el biosensor se secó en una mesa de calentamiento a 40 ℃. Cuando el biosensor se calentó a 40 ° C, la película de proteína se formó más rápida y uniformemente. Cada vez, antes de cambiar diferentes concentraciones de solución de BSA, la hoja de acero inoxidable se colocó en agua desionizada y se hizo vibrar en un vibrador ultrasónico para asegurar que la película de proteína del proceso anterior se despeja y la superficie de este biosensor de mmetamaterial está limpia. La Figura 9 mostró las imágenes y las imágenes microscópicas del proceso de adición y secado de la proteína. Como se muestra en la Fig. 9a, la hoja de acero inoxidable estaba limpia y luego, como se muestra en la Fig. 9b, se añadió la solución de BSA de una concentración a la superficie de la hoja de acero inoxidable, y la solución permaneció en la superficie de este biosensor y no pasar a través de los orificios debido al efecto de la tensión superficial del agua. Después de calentar y secar, se formó una capa delgada de la película de BSA como se muestra en la Fig. 9c.

Imágenes del acero inoxidable en diferentes pasos de prueba:el biosensor de metamaterial después de a limpieza y secado por ultrasonidos, b agregando 150 μL de solución de BSA (0.2 mg / mL) y c el secado; Fotografías de microscopio de la d de la lámina de acero inoxidable pared lateral y e superficie antes de agregar BSA; Fotografías microscópicas de la f de la lámina de acero inoxidable pared lateral y g superficie después de agregar y secar la solución de BSA (0.2 mg / mL)

Para observar la situación dentro de los agujeros del acero inoxidable, se cortó un lado del acero inoxidable, de modo que un lado de los agujeros se reveló y se observó con un microscopio. Como se muestra en la Fig. 9d-g, cuando la solución de BSA se goteó y se secó, se agregó una capa delgada de BSA en los orificios del acero inoxidable, lo que se debe principalmente a que el diámetro de los orificios es mucho mayor que el tamaño del Proteínas BSA. Esto prueba que el analito que se va a detectar puede entrar en la región sensible a la detección de nuestro biosensor, lo que puede aumentar en gran medida la sensibilidad de este biosensor de metamaterial.

Medidas espectrales

Todas las mediciones espectrales se realizaron utilizando un sistema de espectroscopía THz de onda continua (TeraScan 1550, Toptica Photonics AG). El sistema constaba de electrónica inteligente de control de láser dual (DLC), dos láseres de retroalimentación distribuida (DFB), dos fotomezcladores de InGaAs acoplados a fibra y cuatro espejos parabólicos fuera del eje de 90 ° como se muestra en la Fig. 10. Las ondas THz se colimaron y enfocado en la muestra a través de los espejos parabólicos fuera del eje de 90 °. Todos los espectros de transmisión se obtuvieron escaneando entre 50 y 1220 GHz en tamaños de paso de 40 MHz con un tiempo de integración de 10 ms operando en el modo de escaneo rápido para reducir el tiempo de escaneo. La polarización de la onda de terahercios fue a lo largo de la dirección de apertura del anillo con mancuernas.

Diagrama esquemático del espectrómetro THz de onda continua utilizado en nuestros experimentos

Resultados del experimento y discusión

Los experimentos de detección de proteínas del biosensor de metamaterial se llevaron a cabo con cuatro concentraciones de las soluciones de BSA. A lo largo de los experimentos, se agregó cada grupo de soluciones de BSA en orden de menor a mayor. Todas las mediciones se repitieron tres veces.

Como se muestra en la Fig. 11a, a medida que aumentaba la concentración de las soluciones de BSA, la frecuencia de pico de resonancia se desplazaba al rojo. Esta tendencia es consistente con los resultados de la simulación. La disminución en la intensidad de la resonancia se debió a la absorción de la onda de terahercios por la proteína BSA.

un Espectros medidos con diferentes concentraciones de BSA. b Ajuste de colina del experimento BSA

La relación entre el cambio de frecuencia y la concentración de las soluciones de BSA no es lineal, lo que es común en los experimentos biológicos [38, 39]. El modelo de Hill puede caracterizar la capacidad de unión entre nuestro biosensor de metamaterial y biomoléculas. Por lo tanto, se utilizó el modelo de Hill [40] para ajustar los datos experimentales, como se muestra en la Fig. 11b. La ecuación de Hill se describe a continuación:

$$ \ Delta f =\ Delta f _ {{\ max}} \ cdot \ frac {{[{\ text {BSA}}] ^ {n}}} {{\ left \ {{K _ {{\ text {D }}} + [{\ text {BSA}}] ^ {n}} \ right \}}} $$ (2)

donde el cambio de frecuencia pico máximo Δ f _máx es el valor de saturación, [BSA] es la concentración de la solución de BSA, n es el coeficiente de Hill y K _D es la constante de disociación.

Usando la curva de ajuste como se muestra en la Fig. 11b, el coeficiente de Hill n se calculó en 0,83, y la constante de disociación K _D se calculó en 2,87 mg / ml. Además, Δ f _máx fue de aproximadamente 166 GHz, lo que indica el cambio de frecuencia pico máximo en la concentración de saturación. Los resultados del ajuste de Hill del pico de frecuencia resonante confirmaron la confiabilidad y precisión del experimento.

La sensibilidad S del biosensor se dedujo de la siguiente manera [41]:

$$ S =\ frac {{\ Delta f _ {{\ max}}}} {{\ delta _ {{\ max}}}} $$ (3)

donde Δ f _máx es 166 GHz y δ _máx es la densidad de superficie de BSA. δ _máx fue determinada por [41]:

$$ \ delta _ {{\ max}} =\ frac {{M _ {{{\ text {BSA}}}}}} {{N _ {{\ text {A}}} \ veces P _ {{{\ text {BSA}}}} ^ {2}}} $$ (4)

donde M _BSA =66,430 g / mol es la masa molecular estimada de BSA [42], N _A =6,02 × 10 ²³ mol ⁻¹ es el número de Avogadro y P _BSA =6,96 nm [43] es la longitud media de una molécula de BSA. δ _máx fue de 2,28 ng / mm ² y la sensibilidad de detección de BSA del biosensor fue de 72,81 GHz / (ng / mm ² ).

K _D obtenido usando el modelo de Hill mostró que la constante de disociación estaba fuertemente relacionada con el BSA, y el límite de detección (LOD) C _lim de la BSA se calculó utilizando la siguiente ecuación [44]:

$$ C _ {{\ lim}} =K _ {{\ text {D}}} \ times \ frac {{S _ {{\ text {f}}}}} {{\ Delta f _ {{\ max}} - S _ {{\ text {f}}}}} $$ (5)

donde S _f es la resolución espectral de 2 GHz. La ecuación (5) muestra que una constante de disociación más pequeña resultó en un límite de detección más bajo. Por lo tanto, C _lim se calculó en 0,035 mg / ml.

La Tabla 2 muestra el rendimiento de detección de BSA de nuestro biosensor en comparación con los estudios informados. En el experimento, la concentración más baja de la solución de BSA fue de 0,2 mg / mL y se obtuvo un cambio de frecuencia de 10,8 GHz. Comparado con las Refs. [45, 46, 47], se logró un cambio de frecuencia relativamente mayor con la misma concentración de BSA. La fórmula de Hill se aplicó para analizar los datos del biosensor de metamaterial. El LOD calculado de 0,035 mg / ml fue significativamente mejor que el de la Ref. [45]. Todo esto predice que nuestro biosensor de metamaterial THz totalmente metálico propuesto tendrá un rendimiento excelente en muchas aplicaciones biológicas y químicas.

Basado en el excelente rendimiento de detección del biosensor de acero inoxidable, el biosensor de acero inoxidable se puede modificar con un anticuerpo específico para lograr una detección de antígeno específico en el futuro. Y el grosor del biosensor de acero inoxidable es de solo 50 μm. Con el desarrollo de la tecnología de microfluidos y la espectroscopia de terahercios, es esperanzador aplicar la medición en tiempo real in vivo en el futuro.

Conclusión

En conclusión, se utilizó un biosensor de terahercios basado en un metamaterial totalmente metálico para medir las concentraciones de proteínas. El biosensor se fabricó en acero inoxidable y se preparó mediante tecnología de perforación por láser. La sensibilidad máxima de RI y FOM calculadas con el software de simulación electromagnética CST son 294,95 GHz / RIU y 4,03, respectivamente. La muestra se caracterizó utilizando un espectrómetro de THz de onda continua. Los resultados experimentales mostraron que, para la solución de analito BSA, la sensibilidad de detección y el límite de detección son 72,81 GHz / (ng / mm ² ) y 0,035 mg / ml, respectivamente. Este biosensor tiene ventajas de forma pequeña, alta sensibilidad de detección, límites de detección bajos, reutilización, fácil de fabricar y rentable. Estos resultados de investigación son de considerable importancia para futuras aplicaciones en la detección biomolecular y el diagnóstico de enfermedades.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricciones.

Abreviaturas

THz:

Terahercios

RI:

Índice de refracción

FOM:

Figura de mérito

BSA:

Albúmina de suero bovino

PET:

Tereftalato de polietileno

DLC:

Control de doble láser

DFB:

Comentarios distribuidos

LOD:

Límite de detección

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