Biosensor de Metamaterial Terahercio Todo Metálico Logra Ultra-Alta Sensibilidad para Detección de Proteínas

Diagrama de distribución de corriente superficial simulada y diagrama de distribución magnética (y = 0 μm) a 0.48 THz

Dado que el rendimiento del sensor se ve afectado por los parámetros estructurales, es necesario optimizar los parámetros estructurales durante el procedimiento de diseño. La Figura 3 muestra el efecto de los cambios de tamaño estructural en los espectros de transmisión. Como se muestra en la Fig. 3a, cuando la longitud de la mancuerna hueca aumentó de 290 a 298 μm, la frecuencia del pico de los espectros de transmisión se desplazó hacia el rojo desde 0.48 THz. Como se muestra en la Fig. 3b, cuando la brecha de la mancuerna hueca aumentó de 56 a 64 μm, la frecuencia del pico de los espectros de transmisión se desplazó hacia el azul desde 0.48 THz. A medida que L y H aumentaban, el pico de resonancia comenzaba a moverse hacia frecuencias bajas y altas, respectivamente. Cuando el radio del círculo varió de 56 a 64 μm y el espesor del acero inoxidable varió de 40 a 60 μm, la posición del pico de resonancia cambió ligeramente. Por tanto, es más fácil ajustar la frecuencia de resonancia del biosensor de metamaterial ajustando la longitud de la mancuerna hueca L y la brecha de la mancuerna hueca H.

Espectros de transmisión de a diferente longitud L, b brecha H, c radio R, y d espesor de placa de acero inoxidable

También es muy importante estudiar la influencia del ángulo de incidencia y el ángulo de polarización en los espectros de transmisión. La onda electromagnética incidía verticalmente, y luego se cambiaron los ángulos de incidencia y polarización. La definición de estos ángulos se muestra en la Fig. 4a. El ángulo de incidencia significa θ_i en el plano y–z, y la polarización es θ_p en el plano x–y. Como se muestra en la Fig. 4b, cuando el ángulo de incidencia cambió de 0° a 15°, la diferencia de la frecuencia del pico de resonancia fue solo 9 GHz. Como se muestra en la Fig. 4c, cuando el ángulo de polarización aumentó de 0° a 15°, la diferencia en la frecuencia del pico de resonancia fue casi 0 GHz, pero la amplitud del pico de resonancia disminuyó en aproximadamente 0.1. Esto mostró que el biosensor era casi insensible a los cambios en los ángulos de incidencia y polarización, lo cual es beneficioso para aplicaciones prácticas de biosensores.

a Diagrama esquemático del cambio de ángulo de incidencia θ_i y ángulo de polarización θ_p. Espectros de transmisión versus b el ángulo de incidencia y c el ángulo de polarización

Para explorar el rendimiento de detección del biosensor, se agregó una capa delgada de analito de 120 μm a este biosensor de metamaterial como se muestra en la Fig. 5a, luego se simularon diferentes espectros de transmisión de este biosensor de metamaterial cuando el índice de refracción del analito cambió como se muestra en la Fig. 5b. La sensibilidad RI S se definió como la relación entre las variaciones en la posición del pico de transmisión y la unidad RI (S = Δf/Δn). A medida que aumentaba el RI del analito, la frecuencia del pico de resonancia se desplazaba hacia el rojo. Luego se recogió el desplazamiento de frecuencia del pico de resonancia correspondiente a cada RI. Se observó una buena linealidad. El resultado de ajuste en la Fig. 5c muestra que la sensibilidad al RI fue 294.95 GHz/RIU.

a Vista transversal y vista superior del diagrama del modelo de biosensor de metamaterial con una capa delgada de analito de 120 μm. b Influencia de los cambios en el RI del analito en los espectros de transmisión del biosensor. c Ajuste lineal correspondiente del desplazamiento de frecuencia del pico con el RI correspondiente

El rendimiento de detección también se cuantificó usando la figura de mérito (FOM), que se definió como:

$${\text{FOM}} = \frac{S}{{{\text{FWHM}}}}$$ (1)

donde S es la sensibilidad y FHWM es el ancho a media altura del pico de resonancia. El FOM de este biosensor fue 4.03.

Para la mayoría de estructuras de metamaterial, suelen usar materiales dieléctricos como sustratos. Sin embargo, este biosensor de metamaterial propuesto en este artículo se basaba en un metamaterial todo metálico con un diseño todo de acero inoxidable y el aire se usaba como sustrato. Comparado con materiales dieléctricos tradicionales, como tereftalato de polietileno (PET), cuarzo y silicio, el aire tiene el RI más bajo. Para evaluar el papel del sustrato, estos biosensores de metamaterial se simularon nuevamente usando diferentes sustratos, y se calcularon posteriormente las sensibilidades al índice de refracción y los valores FOM. Como se muestra en la Fig. 6, a medida que aumentaba el RI del sustrato, la sensibilidad RI del sensor y el FOM comenzaban a disminuir. Este resultado indicó que el biosensor con un RI de sustrato menor tenía un mejor rendimiento de detección.

Las sensibilidades y FOMs cuando se usan diferentes sustratos

Para investigar más el principio de detección del biosensor, se simularon diagramas de distribución de campo eléctrico, como se muestra en la Fig. 7. Las vistas superior y lateral de la distribución simulada de campo eléctrico demostraron que la energía del campo eléctrico se concentraba principalmente en parte de los orificios del acero inoxidable. Por tanto, es crucial asegurar que el analito se agregue en los orificios.

Distribuciones simuladas de campo eléctrico. a Vista superior, b vista lateral (y = 0 μm)

La Tabla 1 resume la sensibilidad RI y el FOM del sensor propuesto, y los compara con otros estudios reportados [35,36,37]. Los otros sensores THz están todos basados en procesos tradicionales de fotolitografía. Se puede ver que el biosensor de metamaterial de acero inoxidable que diseñamos tenía un excelente rendimiento de detección usando tecnología de taladrado láser barata.

Experimento

Materiales y Preparación de Muestras

Luego, para demostrar la capacidad de biosensores del sensor de metamaterial THz propuesto, se realizó detección de proteínas en el experimento. BSA y tampón PBS se compraron ambos en Sigma-Aldrich. La solución de BSA se formuló en tampón PBS (pH = 7.4).

Una imagen microscópica del biosensor de metamaterial fabricado se muestra en la Fig. 8. El tamaño total del biosensor de metamaterial era 12 mm × 12 mm.

Micrografía de la muestra de biosensor fabricada

Las concentraciones de la solución de BSA formulada fueron 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL, 2.0 mg/mL y 4.0 mg/mL. El analito se agregó a la superficie del biosensor mediante método de deposición líquida. Cada vez, 150 μL de solución BSA se transfirieron a la superficie del biosensor con una pipeta, y el biosensor se secó en una mesa de calentamiento a 40 ℃. Cuando el biosensor se calentaba a 40 ℃, la película de proteína se formaba más rápido y uniformemente. Cada vez antes de cambiar diferentes concentraciones de solución BSA, la lámina de acero inoxidable se puso en agua desionizada y vibró en un vibrador ultrasónico para asegurar que la película de proteína del proceso anterior se eliminara y la superficie de este biosensor de metamaterial estuviera limpia. La Figura 9 mostró las imágenes y las microfotografías del proceso de agregar y secar la proteína. Como se muestra en la Fig. 9a, la lámina de acero inoxidable estaba limpia, y luego como se muestra en la Fig. 9b, la solución BSA de una concentración se agregó a la superficie de la lámina de acero inoxidable, y la solución permaneció en la superficie de este biosensor y no pasó a través de los orificios debido al efecto de la tensión superficial del agua. Después de calentar y secar, se formó una capa delgada de película BSA como se muestra en la Fig. 9c.

Imágenes del acero inoxidable en diferentes pasos de prueba: el biosensor de metamaterial después de a limpieza y secado ultrasónico, b agregando 150 μL solución BSA (0.2 mg/mL), y c secado; Microfotos de la d pared lateral y e superficie de la lámina de acero inoxidable antes de agregar BSA; Microfotos de la f pared lateral y g superficie de la lámina de acero inoxidable después de agregar y secar la solución BSA (0.2 mg/mL)

Para observar la situación dentro de los orificios del acero inoxidable, se cortó un lado del acero inoxidable, de modo que un lado de los orificios quedó revelado y se observó con un microscopio. Como se muestra en la Fig. 9d–g, cuando la solución BSA se goteó y secó, una capa delgada de BSA se agregó en los orificios del acero inoxidable, lo cual se debe principalmente a que el diámetro de los orificios es mucho mayor que el tamaño de las proteínas BSA. Esto prueba que el analito a detectar puede entrar en la región sensible de detección de nuestro biosensor, lo que puede aumentar enormemente la sensibilidad de este biosensor de metamaterial.

Mediciones Espectrales

Todas las mediciones espectrales se realizaron usando un sistema de espectroscopía THz de onda continua (TeraScan 1550, Toptica Photonics AG). El sistema consistía en electrónica inteligente de control de doble láser (DLC), dos láseres de realimentación distribuida (DFB), dos fotomixadores InGaAs acoplados a fibra, y cuatro espejos parabólicos fuera de eje de 90° como se muestra en la Fig. 10. Las ondas THz se colimaron y enfocaron en la muestra a través de los espejos parabólicos fuera de eje de 90°. Todos los espectros de transmisión se obtuvieron escaneando entre 50 y 1220 GHz en tamaños de paso de 40 MHz con un tiempo de integración de 10 ms operando en modo de escaneo rápido para reducir el tiempo de escaneo. La polarización de la onda terahercio estaba a lo largo de la dirección de la abertura del anillo de mancuerna.

Diagrama esquemático del espectrómetro THz de onda continua usado en nuestros experimentos

Resultados y Discusión del Experimento

Los experimentos de detección de proteínas del biosensor de metamaterial se realizaron con cuatro concentraciones de soluciones BSA. Durante los experimentos, cada grupo de soluciones BSA se agregó en orden de baja a alta. Todas las mediciones se repitieron tres veces.

Como se muestra en la Fig. 11a, a medida que aumentaba la concentración de las soluciones BSA, la frecuencia del pico de resonancia se desplazaba hacia el rojo. Esta tendencia es consistente con los resultados de simulación. La disminución en la intensidad de la resonancia se debió a la absorción de la onda terahercio por la proteína BSA.

a Espectros medidos con diferentes concentraciones de BSA. b Ajuste de Hill del experimento BSA

La relación entre el desplazamiento de frecuencia y la concentración de las soluciones BSA no es lineal, lo cual es común en experimentos biológicos [38, 39]. El modelo de Hill puede caracterizar la capacidad de unión entre nuestro biosensor de metamaterial y biomoléculas. Por tanto, se usó el modelo de Hill [40] para ajustar los datos experimentales, como se muestra en la Fig. 11b. La ecuación de Hill se describe como sigue:

$$\Delta f = \Delta f_{{\max }} \cdot \frac{{[{\text{BSA}}]^{n} }}{{\left\{ {K_{{\text{D}}} + [{\text{BSA}}]^{n} } \right\}}}$$ (2)

donde el desplazamiento máximo de frecuencia del pico Δf_max es el valor de saturación, [BSA] es la concentración de la solución BSA, n es el coeficiente de Hill, y K_D es la constante de disociación.

Usando la curva de ajuste como se muestra en la Fig. 11b, el coeficiente de Hill n se calculó en 0.83, y la constante de disociación K_D se calculó en 2.87 mg/mL. Además, Δf_max fue aproximadamente 166 GHz, lo que indicaba el desplazamiento máximo de frecuencia del pico a la concentración de saturación. Los resultados de ajuste de Hill del pico de frecuencia resonante confirmaron la fiabilidad y precisión del experimento.

La sensibilidad S del biosensor se dedujo como sigue [41]:

$$S = \frac{{\Delta f_{{\max }} }}{{\delta _{{\max }} }}$$ (3)

donde Δf_max es 166 GHz y δ_max es la densidad superficial de BSA. δ_max se determinó por [41]:

$$\delta _{{\max }} = \frac{{M_{{{\text{BSA}}}} }}{{N_{{\text{A}}} \times P_{{{\text{BSA}}}}^{2} }}$$ (4)

donde M_BSA = 66,430 g/mol es la masa molecular estimada de BSA [42], N_A = 6.02 × 10²³ mol⁻¹ es el número de Avogadro, y P_BSA = 6.96 nm [43] es la longitud promedio de una molécula de BSA. δ_max fue 2.28 ng/mm² y la sensibilidad de detección de BSA del biosensor fue 72.81 GHz/(ng/mm²).

K_D obtenido usando el modelo de Hill mostró que la constante de disociación estaba fuertemente relacionada con la BSA, y el límite de detección (LOD) C_lim de la BSA se calculó usando la siguiente ecuación [44]:

$$C_{{\lim }} = K_{{\text{D}}} \times \frac{{S_{{\text{f}}} }}{{\Delta f_{{\max }} - S_{{\text{f}}} }}$$ (5)

donde S_f es la resolución espectral de 2 GHz. La ecuación (5) muestra que una constante de disociación menor resultó en un límite de detección menor. Así, C_lim se calculó en 0.035 mg/mL.

La Tabla 2 muestra el rendimiento de detección de BSA de nuestro biosensor comparado con estudios reportados. En el experimento, la concentración más baja de la solución BSA fue 0.2 mg/mL y se obtuvo un cambio de frecuencia de 10.8 GHz. Comparado con Refs. [45,46,47], se logró un cambio de frecuencia relativamente mayor a la misma concentración de BSA. Se aplicó la fórmula de Hill para analizar los datos del biosensor de metamaterial. El LOD calculado de 0.035 mg/ml fue significativamente mejor que el de Ref. [45]. Todo esto predice que nuestro biosensor de metamaterial THz todo metálico propuesto tendrá un excelente rendimiento en muchas aplicaciones biológicas y químicas.

Basado en el excelente rendimiento de detección del biosensor de acero inoxidable, el biosensor de acero inoxidable puede modificarse con anticuerpos específicos para lograr detección de antígenos específicos en el futuro. Y el espesor del biosensor de acero inoxidable es solo 50 μm. Con el desarrollo de la tecnología microfluídica y la espectroscopía terahercio, es esperable aplicar medición en tiempo real in vivo en el futuro.

Conclusión

En conclusión, se usó un biosensor terahercio basado en un metamaterial todo metálico para medir concentraciones de proteínas. El biosensor estaba hecho de acero inoxidable y preparado mediante tecnología de taladrado láser. La máxima sensibilidad RI y FOM calculados usando el software de simulación electromagnética CST son 294.95 GHz/RIU y 4.03, respectivamente. La muestra se caracterizó usando un espectrómetro THz de onda continua. Los resultados experimentales mostraron que, para la solución analito BSA, la sensibilidad de detección y el límite de detección son 72.81 GHz/(ng/mm²) y 0.035 mg/mL, respectivamente. Este biosensor tiene ventajas de tamaño pequeño, alta sensibilidad de detección, bajos límites de detección, reutilizable, fácil de fabricar y rentable. Estos resultados de investigación son de considerable importancia para futuras aplicaciones en detección de biomoléculas y diagnóstico de enfermedades.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricción.

Abreviaturas

THz:

Terahercio

RI:

Índice de refracción

FOM:

Figura de mérito

BSA:

Albúmina sérica bovina

PET:

Tereftalato de polietileno

DLC:

Control de doble láser

DFB:

Realimentación distribuida

LOD:

Límite de detección