Aptasensor fluorescente a base de óxido de grafeno para la detección de encendido de CCRF-CEM

Métodos

Reactivos

El FFAM-apt con una secuencia de 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3 'fue sintetizado por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). En este trabajo, se empleó tampón de Tris-HCl autorregulado, que incluía Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl ₂ 5 mM y NaCl 100 mM. Los aptámeros usados ​​en este experimento se disolvieron con tampón Tris-HCl. El polvo de óxido de grafeno se adquirió de Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Todas las soluciones se prepararon con agua ultrapura de 18 MΩ purificada de un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

Celdas

Las líneas celulares CCRF-CEM (líneas celulares de linfoblastos leucémicos agudos humanos), Ramos (líneas celulares de linfoma de Burkitt humano), 293T (líneas celulares de riñón embrionario humano) y H22 (líneas celulares de carcinoma hepatocelular murino) se adquirieron del Banco de células de China. Academia de Ciencias (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se cultivaron a 5% de dióxido de carbono y 37 ° C, y el medio de 1640 contiene 10% de suero fetal bovino (FBS; HyClone) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.).

Aparato

Todos los espectros de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia se midieron y registraron con un espectrofotómetro de fluorescencia F-7000 (Hitachi Company, Tokio, Japón). Se utilizó una cubeta de cuarzo de 700 μL para contener la solución de muestra. Debido a las longitudes de onda máximas características de la carboxifluoresceína (FAM), se controló la intensidad de la luminiscencia excitando la muestra a 490 nm y midiendo la emisión a 518 nm.

Todas las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) se tomaron con un microscopio SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokio, Japón).

El potencial zeta del complejo GO, FAM-apt y óxido de grafeno-aptámero (GO-apt) se determinó mediante un analizador de tamaño de nanopartículas, potencial zeta y peso molecular absoluto (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido).

Los espectros de absorbancia UV-visible de GO, FAM-apt y GO-apt se registraron en NanoDrop 2000 (Thermo, EE. UU.).

Preparación del aptasensor fluorescente GO-apt

El polvo de óxido de grafeno se disolvió y se esparció en agua purificada Milli-Q y luego se dispersó por ultrasonidos para obtener una solución negra homogénea con la concentración de 1 mg / mL. Diluyendo la solución madre con tampón Tris-HCl 20 mM, obtuvimos la concentración de FAM-apto 20 nM. Y después de eso, se mezclaron 1 μL de FAM-apto (10 μM) y 10 μL de solución de GO (1 mg / mL) como se preparó y luego se diluyeron con tampón Tris-HCl a 500 μL.

Imágenes de células

Las células CCRF-CEM y Ramos se cultivaron durante 12 h en placas de seis pocillos (5 x 10 ⁵ células por pocillo). Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y se incubaron con solución GO-apt a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. Luego, las células se lavaron tres veces y se fijaron durante 20 min con polioximetileno al 4%. Las células se lavaron de nuevo con PBS y se tiñeron con dihidrocloruro de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Life Co., EE.UU.) durante 5 min en la oscuridad. Finalmente, las células se lavaron tres veces con PBS y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia (Nikon DS-Ri1; Japón).

Detecciones de células CCRF-CEM

Las células CCRF-CEM se recolectaron por centrifugación y se suspendieron en 1 mL de PBS. Las diferentes concentraciones de células CCRF-CEM (0 a 1.0 × 10 ⁷ / mL) se incubaron con un aptasensor fluorescente GO-apt a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. Después de la incubación, las células CCRF-CEM se detectaron mediante espectroscopía de fluorescencia en el rango de longitud de onda de 560 a 500 nm. El límite de detección (LOD) se estima en base a los 3 σ / S cálculo, donde σ es la desviación estándar de la solución GO-apt ( n =10) y S es la pendiente de la ecuación lineal [33].

Ensayo de especificidad

Para investigar la especificidad del aptasensor fluorescente basado en GO, probamos el sistema con varias células diferentes, incluidas las células Ramos, las células H22 y las células 293T. Cada uno de los sistemas de reacción de 100 μL incluía 1 × 10 ⁶ células.

Análisis estadísticos

Cada experimento fue repetido tres veces. Los datos se procesaron con el software SigmaPlot 12.5 y los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). El umbral de significación en todos los análisis fue P <0,0001.

Resultados y discusión

Principio del aptasensor fluorescente GO-apt para la detección de CCRF-CEM

En este estudio, se utilizaron GO y FAM-apt para diseñar un aptasensor fluorescente para detectar células CCRF-CEM. El principio del sensor fluorescente para la detección de células CCRF-CEM se muestra en la Fig. 1. En ausencia de células CCRF-CEM, los aptámeros modificados con FAM se adsorben en la superficie GO mediante π - π apilado. Dado que GO y el fluoróforo están demasiado cerca de la transferencia de energía, entonces, como extintor, GO apaga la fluorescencia de FAM. En presencia de células CCRF-CEM, la fuerza de unión débil del aptámero GO permite que el aptámero se desprenda de la superficie GO y se una a las células, provocando la restauración de la fluorescencia. Por lo tanto, el número de células CCRF-CEM se puede detectar de manera correspondiente de acuerdo con la recuperación de la intensidad de fluorescencia de FAM.

Ilustración esquemática del aptasensor fluorescente GO-apt para la detección de células CCRF-CEM

Apagado y recuperación de fluorescencia

Este proceso continuo de apagar la fluorescencia de GO y devolver la fluorescencia en presencia de células CCRF-CEM puede observarse mediante un espectrofotómetro de fluorescencia. El proceso completo de detección basado en aptámeros de fluorescencia GO se muestra en la Fig. 2a. El espectro de fluorescencia de FAM-apt en tampón Tris-HCl 25 nM presenta una fuerte intensidad de fluorescencia gracias a la presencia de FAM (Fig. 2a, curva a). Sin embargo, tras la adición de GO, la intensidad de la fluorescencia se redujo notablemente (Fig. 2a, curva b), lo que indica que GO fue capaz de apagar eficazmente la fluorescencia cuando GO y los aptámeros estaban cerca uno del otro y adsorbidos juntos. Sorprendentemente, cuando 5 × 10 ⁶ Se añadieron células CCRF-CEM, la fluorescencia apagada pudo recuperarse con el tiempo (Fig. 2a, curva c). Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de FAM-apt sin conjugación GO no tiene ningún cambio obvio cuando se añadieron células CCRF-CEM (Fig. 2a, curva d). CCRF-CEM es una célula no fluorescente (Fig. 2a, curva e); por lo tanto, la recuperación de la fluorescencia se debe principalmente a la disociación del aptámero de la superficie del grafeno y a la exposición del grupo fluorescente. Estos experimentos de extinción y recuperación de la fluorescencia ilustraron claramente que el complejo CCRF-CEM-aptámero (CEM-apt) puede evitar que FAM-apto se apague por GO, y CEM tiene una afinidad de unión más fuerte a su aptámero que GO. Gracias a la diferencia de estructura entre el aptámero monocatenario y el complejo CEM-aptámero, los aptámeros en la superficie GO pueden interactuar con CEM y luego transformarse en el complejo CEM-aptámero. Este fenómeno también indica claramente que la unión del complejo CEM-aptámero al aptámero es más débil que la de GO, lo que permite que el aptámero caiga de la superficie de GO. Dado que el FAM-apt está ubicado lejos de la superficie GO y se reduce la eficiencia de transferencia de energía, se restaura la fluorescencia. El análisis estadístico de los espectros de emisión de fluorescencia del aptámero Sgc8 marcado con FAM y CCRF-CEM se realizó en diferentes condiciones (Fig. 2b).

Viabilidad de la detección Go-apt de células CEM. un Espectros de emisión de fluorescencia de células FAM-apt y CCRF-CEM en diferentes condiciones:(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM y (e) CCRF-CEM; Apto para FAM (20 nM); GO (25 μg / mL); CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ células). Excitación 490 nm. b Análisis estadístico de los espectros de emisión de fluorescencia de FAM-apt y CCRF-CEM en diferentes condiciones. NS no significativo. **** P <0,0001

Caracterizaciones del aptasensor fluorescente GO-apt

Para verificar el diseño se obtuvo un GO uniforme y descentralizado. De la Fig. 3a, sabemos que una hoja GO con un grosor de 1,17 nm posee una apariencia bidimensional típica por AFM. Sin embargo, GO-apt con un grosor de 1,94 nm mostró que FAM-apt se ha absorbido con éxito en la superficie GO. El potencial zeta de FAM-apt y GO fue - 11,35 y - 23,90 mV, respectivamente, pero cuando GO interactúa de forma no convalente con FAM-apt, el valor absoluto del potencial zeta aumentó (Fig. 3b). Estos resultados indicaron que los aptasensores se han construido con éxito. De la Fig. 3c, sabemos que GO mostró una fuerte absorción a 234 nm que se atribuye a la π - π * transiciones de enlaces aromáticos C =C. FAM-apt se caracteriza por bandas de absorción de la secuencia de ADN (260 nm) y FAM (503 nm), mientras que la adición de GO a la solución de FAM-apt provoca un desplazamiento hacia el rojo y aumenta la absorbancia de FAM a 503 nm. La posible razón es que FAM-apt se adsorbe en la superficie GO, lo que indica interacciones electrónicas entre los dos π sistemas de GO y los tintes en el estado fundamental. Por lo tanto, los resultados indicaron que GO-apt se ha construido con éxito.

Caracterización de GO-apt. un Imágenes AFM de GO y CEM-apt. b Potencial zeta de superficie de FAM-apt, GO y CEM-apt. Las barras de error indican ± SD ( n =3). c Espectros de absorbancia UV-visible de (a) GO, (b) FAM-apt y (c) GO-apt

Microscopía de fluorescencia de células

Para visualizar directamente la especificidad de la unión caída de FAM-apt a nivel celular, incubamos células CCRF-CEM y Ramos con Go-apt y luego las analizamos usando microscopía de fluorescencia. De acuerdo con los experimentos espectrales de fluorescencia, FAM-apt puede caer de Go-apt y luego unirse a las células CCRF-CEM para la tinción fluorescente, pero no a las células de Ramos (Fig. 4).

Micrografías de fluorescencia de células CCRF-CEM y Ramos después de mezclar con GO-apt. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las barras de escala indican 25 μm

Optimización de condiciones experimentales para la detección de CCRF-CEM

Para obtener el excelente rendimiento del aptasensor fluorescente, se optimizó el tiempo de extinción y recuperación de la fluorescencia. Los comportamientos cinéticos de FAM-apt y GO, así como de FAM-apt en solución GO homogénea con células CCRF-CEM, se investigaron controlando la intensidad de fluorescencia en función del tiempo de extinción y recuperación (Fig. 5a, b). Como se muestra en la Fig. 5a, se puede observar la extinción de la fluorescencia de FAM-apt en función del tiempo de incubación en presencia de GO. El FAM-apt se adsorbe rápidamente a la superficie del GO y, después de eso, se somete a transferencia de energía y, al mismo tiempo, la intensidad de la fluorescencia se reduce significativamente y tiende a disminuir después de 2 min. Por el contrario, se forma CEM-apt y la liberación de la superficie GO es más lenta. La intensidad de la fluorescencia alcanzó una plataforma cuando el tiempo de incubación fue superior a 30 min (Fig. 5b). Estos experimentos dependientes del tiempo muestran que GO, como un excelente extintor, apaga rápidamente la fluorescencia apta para FAM y recupera gradualmente la fluorescencia en presencia de CEM.

Optimización de condiciones experimentales. un Apagado de la fluorescencia de FAM-apt (20 nM) en tampón Tris-HCl por GO en función del tiempo. b Restauración de fluorescencia de FAM-apt en solución GO por CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ) en función del tiempo. c Efecto de la concentración de GO sobre la intensidad de fluorescencia de FAM-apt en ausencia (curva a) y en presencia (curva b) de 1 × 10 ⁶ Células CCRF-CEM. d La tasa de intensidad de fluorescencia ( F / F ₀ ) de FAM-apt en 1 × 10 ⁶ Células CCRF-CEM en función de la concentración de GO. Excitación 490 nm

Para hacer que el aptasensor fluorescente sea más sensible a la detección de CCRF-CEM, el sistema de reacción utilizado para optimizar la concentración de GO se vuelve indispensable. La Figura 5c, que ilustra claramente nuestra estrategia, muestra el efecto de diferentes concentraciones de GO sobre la intensidad de fluorescencia de FAM-apt en ausencia (Fig.5c, curva a) y en presencia (Fig.5c, curva b) de CCRF -CEM. Como hemos visto en la Fig. 5c, tras la adición de GO, el fondo de la señal de fluorescencia se reduce significativamente. La Figura 5d muestra la fluorescencia restaurada del FAM-apt en 1 × 10 ⁶ Células CEM en función de la concentración de GO. De la Fig. 5d, podemos encontrar que cuando la concentración de GO es de 20 μg / mL, la relación de F / F ₀ (donde F ₀ y F son las intensidades de fluorescencia de FAM a 518 nm en ausencia y presencia de CCRF-CEM, respectivamente) obtiene el valor más alto, que es 13.0354. Por lo tanto, se consideró que 20 μg / mL era la concentración óptima de GO.

Detección CCRF-CEM con aptasensor fluorescente GO-apt

Con el fin de obtener buenos resultados experimentales, se utilizaron condiciones experimentales óptimas para detectar CCRF-CEM. La Figura 6a muestra que con el número creciente de CCRF-CEM de 0 a 1 × 10 ⁷ , la intensidad de la fluorescencia también aumenta en consecuencia. Además, la F / F ₀ muestra una clara dependencia lineal del número de CCRF-CEM en el rango de 1 × 10 ² –1 × 10 ⁷ (Figura 6b). La ecuación de regresión lineal es Y ( F / F ₀ ) =3,2608 × log C - 5.1892 (donde C es el número de CCRF-CEM) con el coeficiente de regresión R ² =0,9922. El límite de detección se considera inferior a diez células. Por lo tanto, la detección de aptámeros de fluorescencia basada en GO tiene un amplio rango de detección, por lo que puede usarse como un biosensor ideal para detectar CCRF-CEM. En comparación con los otros métodos, este método tiene una mayor sensibilidad (Tabla 1) [34,35,36,37,38,39].

Detección apta de células CEM. un Espectros de emisión de fluorescencia de aptasensor fluorescente GO-apt en presencia de diferentes concentraciones de células CCRF-CEM. b Relación lineal entre la tasa de intensidad de fluorescencia ( F / F ₀ ) y la concentración de células CCRF-CEM

Especificidad del Aptasensor fluorescente GO-apt

Para investigar la especificidad de los adaptadores fluorescentes GO-apt, se utilizaron varias células diferentes para probar el sistema, como las células Ramos, las células H22 y las células 293T. Cada uno de los sistemas de reacción de 100 μL incluía 1 × 10 ⁶ células. La Figura 7 muestra que CCRF-CEM obtiene una mayor intensidad de fluorescencia que los otros grupos de control. Los resultados también indicaron claramente que el aptasensor fluorescente diseñado era altamente específico.

Especificidad del aptasensor fluorescente para CEM. La tasa de intensidad de fluorescencia ( F / F ₀ ) de aptasensor fluorescente GO-apt en presencia de células CEM, células Ramos, células H22 y células 293T, respectivamente (1 × 10 ⁶ ), donde F ₀ y F son la intensidad de fluorescencia sin y con células de detección a 518 nm. Excitación 490 nm

Conclusiones

Hemos desarrollado un aptasensor fluorescente conveniente, de bajo costo y altamente sensible para la detección de células CCRF-CEM. Esta estrategia utiliza inteligentemente la interacción de enlace no covalente por el π - π apilamiento entre grafeno y ADN monocatenario y el rendimiento superior de la fluorescencia que apaga el grafeno. En comparación con el aptámero, la unión del complejo CEM-aptámero a GO es débil, por lo que la fluorescencia apagada por el grafeno se puede restaurar gradualmente. En condiciones optimizadas, el límite de detección se considera inferior a 100 células. Por lo tanto, basado en su excelente desempeño, el aptasensor fluorescente tiene una amplia perspectiva en la detección de células tumorales.

Historial de cambios

Abreviaturas

AFM:

Microscopía de fuerza atómica

CEM-apt:

Complejo CCRF-CEM-aptámero

FAM-apt:

Aptámero Sgc8 etiquetado con FAM

FRET:

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia

GO:

Óxido de grafeno

GO-apt:

Complejo de óxido de grafeno-aptámero

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

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