Aptasensor fluorescente de óxido de grafeno de alta sensibilidad para detección rápida de células leucémicas CCRF-CEM

Resumen

Se ha desarrollado un aptasensor fluorescente conveniente, de bajo costo y alta sensibilidad para detección de leucemia basado en complejo óxido de grafeno-aptámero (GO-apt). El óxido de grafeno (GO) puede absorber aptámero Sgc8 marcado con carboxifluoresceína (FAM-apt) por apilamiento π-π y extinguir la fluorescencia mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En ausencia de células diana CCRF-CEM, la fluorescencia se extingue casi completamente. Por el contrario, cuando se añaden células CCRF-CEM, la fluorescencia extinguida se recupera rápida y significativamente. Por tanto, basándose en el cambio de señales de fluorescencia, podemos detectar el número de células CCRF-CEM en un rango amplio de 1 × 10² a 1 × 10⁷ células/mL con límite de detección (LOD) de 10 células/mL. Por lo tanto, esta estrategia de aptasensor fluorescente basado en óxido de grafeno puede ser prometedora para detección de cáncer.

Antecedentes

La leucemia es una enfermedad hematológica maligna agresiva y común, que amenaza la supervivencia y salud de los seres humanos, especialmente niños y adolescentes. Afecta no solo las células hematopoyéticas normales del cuerpo sino también la médula ósea y el sistema inmunitario. Por tanto, el diagnóstico temprano de leucemia para el tratamiento y mejora de calidad de vida de pacientes es esencial. Actualmente, el método común para detectar leucemia es tomar células sanguíneas periféricas y médula ósea, tras lo cual se realizan muchos tipos de análisis, incluyendo morfología celular, citoquímica, inmunofenotipo, inmunohistoquímica y citometría de flujo basada en aptámeros. Estos métodos pueden detectar células leucémicas, pero aún tienen muchos inconvenientes como alto costo, baja sensibilidad y complejidad. Por tanto, es muy urgente encontrar un método de bajo costo, alta sensibilidad y simple para detectar leucemia.

Los aptámeros, que son ADN monocatenario (ssDNA) o ARN cortos, se seleccionaron por cribado in vitro de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). Basados en sus estructuras terciarias especiales, los aptámeros tienen afinidad de unión robusta y alta especificidad con blancos, incluyendo pequeñas moléculas orgánicas, proteínas e incluso células. Además, los aptámeros también tienen características de ser fácilmente sintetizados y modificados, por lo que se usan ampliamente como sondas de detección de cáncer. Nanomateriales funcionalizados basados en aptámeros para detección de cáncer son también temas candentes en años recientes, como puntos cuánticos y nanopartículas de sílice.

El óxido de grafeno (GO), como novedoso nanomaterial de carbono bidimensional planar, ha recibido atención sustancial debido a sus propiedades únicas incluyendo buena solubilidad acuosa, gran área superficial específica y excelente capacidad de extinción de fluorescencia. Basado en estas propiedades, GO se considera un excelente receptor de energía en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), lo que da a GO amplias perspectivas de aplicación en aptasensor fluorescente. Además, GO puede unirse a aptámeros por interacciones de apilamiento π-π, pero no con ADN bicatenario o complejos aptámero-blanco. Por tanto, el sensor de aptámero basado en grafeno puede mejorar la estabilidad del aptámero comparado con sonda de aptámero libre.

Actualmente, muchas investigaciones reportaron que la estrategia de aptasensor fluorescente basado en GO para detección de blancos es factible. Sin embargo, pocos estudios se han llevado a cabo usando aptasensor basado en GO para células leucémicas, hasta ahora. Aquí diseñamos una nueva estrategia para detección 'encendido' de células leucémicas basada en GO y aptámero Sgc8 marcado con carboxifluoresceína (FAM-apt). GO y aptámero se usaron como extintor de fluorescencia y agente blanco, respectivamente. En ausencia de células leucémicas, GO puede interactuar con FAM-apt y extinguir casi toda la fluorescencia, y la señal de detección se apaga. Sin embargo, cuando las células blanco están presentes, los aptámeros activamente se dirigen a células y se desprenden de GO, resultando en recuperación de fluorescencia en el sistema de detección, y la señal de detección se enciende. Por tanto, la concentración de células blanco puede medirse correspondientemente según el cambio en intensidad de fluorescencia.

Métodos

Reactivos

El FAM-apt con secuencia 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3′ fue sintetizado por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). En este trabajo, se empleó tampón Tris-HCl autorregulador, incluyendo 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂ y 100 mM NaCl. Los aptámeros usados en este experimento se disolvieron en tampón Tris-HCl. Polvo de óxido de grafeno se compró de Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Todas las soluciones se prepararon con agua ultrapura de 18 MΩ purificada de sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

Células

Líneas celulares CCRF-CEM (linfoblastos leucémicos agudos humanos), Ramos (linfoma de Burkitt humano), 293T (riñón embrionario humano) y H22 (carcinoma hepatocelular murino) se compraron del Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se cultivaron a 5 % dióxido de carbono y 37 °C, y el medio 1640 contiene 10 % suero fetal bovino (FBS; HyClone) y 100 U/mL penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Aparatos

Todos los espectros de fluorescencia e intensidades se midieron y registraron por espectrofotómetro de fluorescencia F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Japan). Se usó cubeta de cuarzo de 700 µL para sostener solución de muestra. Debido a las longitudes de onda pico características de carboxifluoresceína (FAM), la intensidad de luminiscencia se monitorizó excitando la muestra a 490 nm y midiendo emisión a 518 nm.

Todas las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) se tomaron por microscopio SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japan).

Potencial zeta de GO, FAM-apt y complejo óxido de grafeno-aptámero (GO-apt) se determinó por analizador de tamaño de nanopartícula, potencial zeta y peso molecular absoluto (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).

Espectros de absorbancia UV-vis de GO, FAM-apt y GO-apt se registraron en NanoDrop 2000 (Thermo, USA).

Preparación del aptasensor fluorescente GO-apt

El polvo de óxido de grafeno se disolvió y dispersó en agua purificada Milli-Q y luego se dispersó por ultrasonido para obtener solución homogénea negra con concentración de 1 mg/mL. Diluir la solución stock por tampón Tris-HCl 20 mM, obtuvimos concentración de 20 nM FAM-apt. Y después, 1 µL FAM-apt (10 µM) y 10 µL solución GO (1 mg/mL) como se prepararon se mezclaron y luego diluyeron con tampón Tris-HCl a 500 µL.

Imagen celular

Células CCRF-CEM y Ramos se cultivaron 12 h en placas de seis pozos (5 × 10⁵ células por pozo). Las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS) frío e incubaron con solución GO-apt a 4 °C en oscuridad por 30 min. Luego, las células se lavaron tres veces y fijaron 20 min con 4 % polioximetileno. Las células se lavaron de nuevo con PBS y tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI; Life Co., USA) por 5 min en oscuridad. Finalmente, las células se lavaron tres veces con PBS y examinaron por microscopía de fluorescencia (Nikon DS-Ri1; Japan).

Detección de células CCRF-CEM

Células CCRF-CEM se colectaron por centrifugación y suspendieron en 1 mL PBS. Diferentes concentraciones de células CCRF-CEM (0 a 1,0 × 10⁷/mL) se incubaron con aptasensor fluorescente GO-apt a 4 °C en oscuridad por 30 min. Tras incubación, las células CCRF-CEM se detectaron por espectroscopía de fluorescencia en rango de longitud de onda 560-500 nm. El límite de detección (LOD) se estimó basado en cálculo 3σ / S, donde σ es desviación estándar para solución GO-apt (n = 10) y S es pendiente de ecuación lineal.

Ensayo de especificidad

Para investigar especificidad del aptasensor fluorescente basado en GO, probamos el sistema con varias células diferentes, incluyendo células Ramos, H22 y 293T. Cada sistema de reacción de 100 µL incluyó 1 × 10⁶ células.

Análisis estadísticos

Cada experimento se repitió tres veces. Los datos se procesaron con software SigmaPlot 12.5, y análisis estadísticos se realizaron usando GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Umbral de significancia en todos los análisis fue P < 0,0001.

Resultados y Discusión

Principio del aptasensor fluorescente GO-apt para detección de CCRF-CEM

En este estudio, GO y FAM-apt se usaron para diseñar un aptasensor fluorescente para detectar células CCRF-CEM. El principio del sensor fluorescente para detección de CCRF-CEM se muestra en Fig. 1. En ausencia de células CCRF-CEM, los aptámeros modificados con FAM se adsorben en superficie de GO por apilamiento π-π. Dado que GO y el fluoróforo están demasiado cerca para transferencia de energía, GO, como extintor, extingue la fluorescencia de FAM. En presencia de células CCRF-CEM, la débil fuerza de unión de GO-aptámero permite que el aptámero se desprenda de superficie de GO y se una a las células, causando restauración de fluorescencia. Por tanto, el número de células CCRF-CEM puede detectarse correspondientemente según la recuperación de intensidad de fluorescencia de FAM.

Ilustración esquemática del aptasensor fluorescente GO-apt para detección de células CCRF-CEM

Extinción y recuperación de fluorescencia

Este proceso continuo de extinción de fluorescencia de GO y retorno de fluorescencia en presencia de células CCRF-CEM puede observarse por espectrofotómetro de fluorescencia. Todo el proceso de detección basado en aptámeros de fluorescencia GO se muestra en Fig. 2a. El espectro de fluorescencia de FAM-apt en tampón Tris-HCl 25 nM presenta fuerte intensidad de fluorescencia gracias a la presencia de FAM (Fig. 2a, curva a). Sin embargo, tras adición de GO, la intensidad de fluorescencia se redujo notablemente (Fig. 2a, curva b), indicando que GO pudo extinguir eficientemente fluorescencia cuando GO y aptámeros estaban cerca y adsorbidos juntos. Sorprendentemente, cuando se añadieron 5 × 10⁶ células CCRF-CEM, la fluorescencia extinguida pudo recuperarse a tiempo (Fig. 2a, curva c). No obstante, la intensidad de fluorescencia de FAM-apt sin conjugación GO no tuvo cambio obvio cuando se añadieron células CCRF-CEM (Fig. 2a, curva d). CCRF-CEM es célula no fluorescente (Fig. 2a, curva e); por tanto, recuperación de fluorescencia se debe principalmente a disociación del aptámero de superficie de grafeno y exposición del grupo fluorescente. Estos experimentos de extinción y recuperación de fluorescencia ilustran claramente que complejo CCRF-CEM-aptámero (CEM-apt) puede mantener FAM-apt de ser extinguido por GO, y CEM tiene mayor afinidad de unión a su aptámero que GO. Gracias a la diferencia estructural entre aptámero monocatenario y complejo CEM-aptámero, aptámeros en superficie de GO pueden interactuar con CEM y transformarse en complejo CEM-aptámero. Este fenómeno también indica claramente que la unión del complejo CEM-aptámero al aptámero es más débil que la de GO, permitiendo que el aptámero se desprenda de superficie de GO. Dado que FAM-apt se ubica lejos de superficie GO y la eficiencia de transferencia de energía se reduce, la fluorescencia se restaura. Análisis estadístico de espectros de emisión de fluorescencia de aptámero Sgc8 marcado con FAM y CCRF-CEM se realizó en diferentes condiciones (Fig. 2b).

Factibilidad de detección de células CEM por Go-apt. a Espectros de emisión de fluorescencia de FAM-apt y células CCRF-CEM en diferentes condiciones: (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, y (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 µg/mL); CCRF-CEM (1 × 10⁶ células). Excitación 490 nm. b Análisis estadístico de espectros de emisión de fluorescencia de FAM-apt y CCRF-CEM en diferentes condiciones. NS no significativo. ****P < 0,0001

Caracterización del aptasensor fluorescente GO-apt

Para verificar el diseño, se obtuvo GO uniforme y descentralizado. De Fig. 3a, sabemos que una lámina GO con espesor de 1,17 nm posee apariencia bidimensional típica por AFM. Sin embargo, GO-apt con espesor de 1,94 nm mostró que FAM-apt ha sido absorbido a superficie GO exitosamente. El potencial zeta de FAM-apt y GO fue -11,35 y -23,90 mV, respectivamente, pero cuando GO interactúa no covalentemente con FAM-apt, el valor absoluto de potencial zeta aumentó (Fig. 3b). Estos resultados indicaron que aptasensores se construyeron exitosamente. De Fig. 3c, sabemos que GO mostró absorción fuerte a 234 nm atribuida a transiciones π-π* de enlaces aromáticos C=C. FAM-apt se caracteriza por bandas de absorción de secuencia de ADN (260 nm) y FAM (503 nm), mientras que adición de GO a solución de FAM-apt causa corrimiento al rojo y absorbancia de FAM a 503 nm aumenta. La posible razón es que FAM-apt se adsorbe en superficie GO, indicando interacciones electrónicas entre los dos sistemas π de GO y colorantes en estado fundamental. Por tanto, resultados indicaron que GO-apt se construyó exitosamente.

Caracterización de GO-apt. a Imágenes AFM de GO y CEM-apt. b Potencial zeta superficial de FAM-apt, GO y CEM-apt. Barras de error indican ± DE (n = 3). c Espectros de absorbancia UV-vis de (a) GO, (b) FAM-apt, y (c) GO-apt

Microscopía de fluorescencia de células

Para visualizar directamente la especificidad de FAM-apt desprendido uniéndose a nivel celular, incubamos células CCRF-CEM y Ramos con Go-apt y luego analizamos usando microscopía de fluorescencia. Consistente con experimentos espectrales de fluorescencia, FAM-apt puede desprenderse de Go-apt y luego unirse a células CCRF-CEM para tinción fluorescente, pero no a células Ramos (Fig. 4).

Micrografías de fluorescencia de células CCRF-CEM y Ramos tras mezclar con GO-apt. Núcleos teñidos con DAPI. Barras de escala indican 25 µm

Optimización de condiciones experimentales para detección de CCRF-CEM

Para obtener excelente rendimiento del aptasensor fluorescente, se optimizaron tiempos de extinción y recuperación de fluorescencia. Los comportamientos cinéticos de FAM-apt y GO, así como FAM-apt en solución GO homogénea con células CCRF-CEM, se investigaron monitorizando intensidad de fluorescencia en función de tiempo de extinción y recuperación (Fig. 5a, b). Como se muestra en Fig. 5a, la extinción de fluorescencia de FAM-apt en función de tiempo de incubación en presencia de GO puede observarse. FAM-apt se adsorbe rápidamente a superficie de GO y, tras eso, sufre transferencia de energía, y al mismo tiempo, intensidad de fluorescencia se reduce significativamente y tiende a ralentizar después de 2 min. En contraste, CEM-apt se forma y la liberación de superficie GO es más lenta. La intensidad de fluorescencia alcanzó meseta cuando tiempo de incubación fue mayor a 30 min (Fig. 5b). Estos experimentos tiempo-dependientes muestran que GO, como excelente extintor, extingue rápidamente fluorescencia de FAM-apt y gradualmente recupera fluorescencia en presencia de CEM.

Optimización de condiciones experimentales. a Extinción de fluorescencia de FAM-apt (20 nM) en tampón Tris-HCl por GO en función de tiempo. b Restauración de fluorescencia de FAM-apt en solución GO por CCRF-CEM (1 × 10⁶) en función de tiempo. c Efecto de concentración GO en intensidad de fluorescencia de FAM-apt en ausencia (curva a) y presencia (curva b) de 1 × 10⁶ células CCRF-CEM. d Tasa de intensidad de fluorescencia (F/F₀) de FAM-apt por 1 × 10⁶ células CCRF-CEM en función de concentración GO. Excitación 490 nm

Para hacer el aptasensor fluorescente más sensible a detección de CCRF-CEM, el sistema de reacción usado para optimizar concentración GO se vuelve indispensable. Figura 5c, que ilustra claramente nuestra estrategia, muestra efecto de diferentes concentraciones de GO en intensidad de fluorescencia de FAM-apt en ausencia (Fig. 5c, curva a) y presencia (Fig. 5c, curva b) de CCRF-CEM. Como vimos en Fig. 5c, tras adición de GO, la señal de fondo de fluorescencia se reduce significativamente. Figura 5d muestra fluorescencia restaurada de FAM-apt por 1 × 10⁶ células CEM en función de concentración GO. De Fig. 5d, encontramos que cuando concentración GO es 20 µg/mL, la razón F/F₀ (donde F₀ y F son intensidades de fluorescencia de FAM a 518 nm en ausencia y presencia de CCRF-CEM, respectivamente) obtiene el valor más alto, 13,0354. Por tanto, 20 µg/mL se consideró concentración óptima de GO.

Detección de CCRF-CEM con aptasensor fluorescente GO-apt

Para obtener buenos resultados experimentales, se usaron condiciones experimentales óptimas para detectar CCRF-CEM. Figura 6a muestra que con aumento de número de CCRF-CEM de 0 a 1 × 10⁷, la intensidad de fluorescencia también aumenta correspondientemente. Además, F/F₀ muestra clara dependencia lineal con número de CCRF-CEM en rango 1 × 10²–1 × 10⁷ (Fig. 6b). Ecuación de regresión lineal es Y(F/F₀) = 3,2608 × log C − 5,1892 (donde C es número de CCRF-CEM) con coeficiente de regresión R² = 0,9922. El límite de detección se considera menor a diez células. Por tanto, detección por aptámero de fluorescencia basado en GO tiene amplio rango de detección para ser usado como biosensor ideal para detectar CCRF-CEM. Comparado con otros métodos, este método tiene mayor sensibilidad (Tabla 1).

Detección de células CEM por Go-apt. a Espectros de emisión de fluorescencia de aptasensor fluorescente GO-apt en presencia de diferentes concentraciones de células CCRF-CEM. b Relación lineal entre tasa de intensidad de fluorescencia (F/F₀) y concentración de células CCRF-CEM

Especificidad del aptasensor fluorescente GO-apt

Para investigar especificidad de adaptadores fluorescentes GO-apt, se usaron varias células diferentes para probar el sistema, como células Ramos, H22 y 293T. Cada sistema de reacción de 100 µL incluyó 1 × 10⁶ células. Figura 7 muestra que CCRF-CEM obtiene mayor intensidad de fluorescencia que otros grupos control. Resultados también indicaron claramente que el aptasensor fluorescente diseñado es altamente específico.

Especificidad del aptasensor fluorescente para CEM. Tasa de intensidad de fluorescencia (F/F₀) de aptasensor fluorescente GO-apt en presencia de células CEM, Ramos, H22 y 293T, respectivamente (1 × 10⁶), donde F₀ y F son intensidades de fluorescencia sin y con células de detección a 518 nm. Excitación 490 nm

Conclusiones

Hemos desarrollado un aptasensor fluorescente conveniente, de bajo costo y alta sensibilidad para detección de células CCRF-CEM. Esta estrategia usa inteligentemente la interacción de enlace no covalente por apilamiento π-π entre grafeno y ADN monocatenario y el rendimiento superior de extinción de fluorescencia de grafeno. Comparado con aptámero, la unión del complejo CEM-aptámero a GO es débil, por lo que la fluorescencia extinguida por grafeno puede restaurarse gradualmente. Bajo condiciones optimizadas, el límite de detección se considera menor a 100 células. Por tanto, basado en su excelente rendimiento, el aptasensor fluorescente tiene amplias perspectivas en detección de células tumorales.

Historial de cambios

Abreviaturas

AFM

Microscopía de fuerza atómica

CEM-apt

Complejo CCRF-CEM-aptámero

FAM-apt

Aptámero Sgc8 marcado con FAM

FRET

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia

GO

Óxido de grafeno

GO-apt

Complejo óxido de grafeno-aptámero

PBS

Tampón fosfato salino