Desarrollo de biocompuesto electrohilado de quitosano-óxido de polietileno / fibrinógeno para posibles aplicaciones de cicatrización de heridas

Métodos

Materiales

Ácido acético (glacial, ≥ 99,85%), CS (bajo peso molecular, 75-85% de desacetilación), PEO (PM 300.000 g / mol), Fb (tipo IS, 65-85% de proteína), 1,1,1, El 3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) y la albúmina de suero bovino (BSA, ≥ 96%) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se adquirió dimetilsulfóxido (DMSO) de EMD Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Se adquirieron fibroblastos dérmicos humanos (PCS-201-012) y reactivos de cultivo celular de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante libre de portador BB (rhPDGF-BB) se adquirió de PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Todos los reactivos eran de grado reactivo y se usaron sin más purificación o modificación.

Preparación de andamios compuestos de quitosano-óxido de polietileno / fibrinógeno electrohilado

Se prepararon soluciones madre de quitosano-PEO disolviendo CS y PEO en ácido acético al 1% con BSA (0,5% v / v ) y DMSO (10% v / v ) para obtener un contenido de polímero total de 5,5% en peso con una relación másica de CS a PEO de 2:1. Se añadió óxido de polietileno para mejorar la capacidad de electroespirar CS como se describió anteriormente [16]. Se prepararon soluciones madre de fibrinógeno (110 mg / ml) disolviendo Fb en una parte de medio esencial mínimo de Eagle 10 × (EMEM) y nueve partes de HFIP. Las soluciones madre de CS-PEO y Fb se agitaron a temperatura ambiente hasta que se disolvieron por completo. Para los armazones cargados, se mezcló PDGF en cada solución de polímero inmediatamente antes del electrohilado. Los andamios nanofibrosos compuestos de CS-PEO / Fb electrohilado se fabricaron utilizando un sistema de electrohilado de múltiples boquillas (Fig. 1). Las soluciones se cargaron individualmente y se bombearon mecánicamente al sistema utilizando una jeringa desechable, conectada a una hilera de calibre 18 y una bomba de jeringa NE-1000 (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY), a un caudal de 0,7 y 1,0 ml h ⁻¹ para CS-PEO y Fb, respectivamente. El colector de mandril, que giraba a 25 RPM, se ubicó entre las puntas de la hilera a una distancia de 22 cm para CS-PEO y 12,5 cm para Fb. Durante el proceso de fabricación, se aplicaron voltajes de CC de 28 y 22 kV a las puntas de la hilera para las soluciones de polímero CS-PEO y Fb, respectivamente. Los andamios de nanofibras fabricados se recogieron en cubreobjetos de vidrio de 18 cm para ensayos biológicos o se cortaron directamente del mandril para el análisis de permeabilidad y resistencia a la tracción. Todos los experimentos de electrohilado se realizaron a temperatura ambiente y una humedad relativa del 35 al 45% durante 3 h. Las muestras que contenían PDGF se almacenaron a -20 ° C en un desecador, mientras que los andamios descargados se almacenaron en un desecador a temperatura ambiente después de la fabricación.

Esquema de electrohilatura de hilera doble

Morfología y diámetro de nanofibras

Los andamios nanofibrosos electrohilados se recubrieron por pulverización catódica con oro y se observaron usando microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Alemania). Se tomaron veinte micrografías por armazón y se analizaron tres armazones hilados individualmente por formulación. Los diámetros medios de nanofibras se calcularon midiendo cinco puntos aleatorios por micrografía usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Se realizó un total de 100 mediciones por formulación de andamio.

Caracterización química de la superficie

Se utilizó espectrometría de masas de iones de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) para analizar la química de la superficie y las contribuciones de los componentes poliméricos en el andamio. ToF-SIMS es una metodología analítica de superficie sensible y en profundidad que evalúa la composición química de la capa nanométrica superior de un material mediante bombardeo con Bi ₃ de alta energía ²⁺ agrupaciones bajo vacío ultra alto [25, 26]. Los fragmentos de iones secundarios expulsados ​​de la superficie del material se analizan luego en función de sus relaciones de masa atómica a carga (m / z) y se utilizan para inferir la composición química general de la superficie.

El análisis de ToF-SIMS fue realizado por Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) utilizando un ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Alemania) con una pistola de iones de metal líquido de bismuto (30 kV). El instrumento se hizo funcionar en un modo de microsonda de iones en el que se adquirieron tres espectros de iones positivos y negativos de cada muestra. Los iones positivos y negativos seleccionados se mapearon en un área ráster de 50 × 50 μm con una resolución de imagen de 2048 × 2048 píxeles para proporcionar un mapeo de componentes poliméricos de los andamios. Se informó una intensidad normalizada, definida como el recuento de cada ión secundario dividido por el recuento total de iones registrados multiplicado por 10.000, para cada fragmento. Se analizó la media de tres ubicaciones diferentes en la superficie de seis muestras fabricadas de forma independiente ( n =6). La distribución de polímero CS-PEO y Fb analizada por ToF-SIMs fue representativa de todo el andamio.

Los ángulos de contacto con el agua de los andamios CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb se determinaron de acuerdo con las Normas estadounidenses para métodos de prueba (ASTM) D7334-08. Se electrohilaron andamios nanofibrosos sobre cubreobjetos de vidrio. Se aplicó una sola gota de agua destilada (2 μL) a la superficie del andamio y se midió el ángulo de contacto en 30 s utilizando el analizador de forma de gota Krüss DSA10 MK2 (Krüss, Hamburgo, Alemania). Las mediciones se repitieron tres veces en diferentes ubicaciones para cada muestra y se calculó el ángulo de contacto medio. Se analizaron seis andamios electrohilados de forma independiente ( n =6).

Resistencia a la tracción uniaxial mecánica

Las propiedades mecánicas de los andamios electrohilados se midieron a temperatura ambiente utilizando un Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA) equipado con una celda de carga de 250 N a una velocidad de deformación de 1 mm min ⁻¹ . El espesor de las muestras se midió en seis posiciones aleatorias con el microscopio de barrido láser 3D Keyence VK-200 (Keyence, Itasca, IL). El espesor de los andamios utilizados para las pruebas de tracción fue de 93,8 ± 7,4 μm. Antes de la prueba, los andamios se cortaron en muestras rectangulares de 40 × 25 mm. Los datos obtenidos se informaron y trazaron como curvas de tensión-deformación, donde la tensión de tracción se definió como la relación entre la fuerza y ​​el área de la sección transversal de la muestra y donde la deformación se definió como el cambio de longitud sobre la longitud original. Los cálculos de los módulos de Young, la tensión de tracción y la deformación al rotura se obtuvieron a partir de las curvas de tensión-deformación de un promedio de diez muestras por formulación.

Tasa de transferencia de vapor de agua

La tasa de transferencia de vapor de agua de los andamios CS-PEO / Fb se midió según el método desecante ASTM E96 / E96M. Se prepararon un total de seis muestras electrohiladas independientemente por formulación y se colocaron en la abertura de los recipientes de prueba que contenían desecante de gel de sílice reutilizable a temperatura ambiente y una humedad relativa media de 58,2 ± 5,2%. La tasa de transmisión de vapor de agua (WVTR) se calculó a partir del peso de los contenedores de prueba medidos en diferentes puntos de tiempo durante 48 h:

donde G representa el cambio de peso del recipiente de prueba, t es el tiempo transcurrido y A es el área de la sección transversal del andamio.

Viabilidad celular in vitro

La citotoxicidad indirecta de los andamios se evaluó sobre la base de un enfoque adaptado del método de prueba estándar ISO10993-5 [27, 28]. Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos a 37 ° C y 5% de CO ₂ en medio de fibroblastos sin suero y se actualiza cada 3 días. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se tripsinizaron y se sembraron en placas de 12 pocillos (10.000 células / ml). Al día siguiente, se repusieron los medios y se introdujeron armazones nanofibrosos. La proliferación celular se controló durante 120 h usando un ensayo de proliferación celular de 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio sódico (WST-1).

Visualización de fibroblastos

Se tripsinizaron fibroblastos dérmicos humanos y se sembraron sobre armazones de CS-PEO, Fb y CS-PEO / Fb. Después de 24 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO ₂ , las células se lavaron y se tiñeron con el kit de viabilidad celular LIVE / DEAD ™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Además, se evaluó la adhesión y fijación de fibroblastos humanos al andamio mediante tinción con Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich y dihidrocloruro de 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se observaron imágenes y tomada con un microscopio confocal invertido (Nikon C1, C1EZ, Melville, NY, EE. UU.).

Degradación in vitro

La degradación de los armazones nanofibrosos CS-PEO / Fb se realizó en medio basal de fibroblastos (FBM, ATCC) a 37 ° C y 5% CO ₂ . Los andamios se sumergieron en FBM y se incubaron durante 1, 6, 24 o 48 h. Se anotó el peso seco inicial de cada andamio; en cada momento, los armazones se lavaron, se liofilizaron y se volvieron a pesar. La degradación del andamio se calculó a partir de la siguiente fórmula:

donde W ₀ es el peso inicial del andamio y W _t es el peso del andamio en el momento respectivo.

Liberación y detección de PDGF

Los eluidos, recolectados de puntos de tiempo específicos durante el experimento de degradación in vitro, se ensayaron usando un kit ELISA específico para rhPDGF-BB (R&D System, Minneapolis, MN). Los valores de absorbancia detectados se compararon con un estándar, según lo especificado por las instrucciones del fabricante para la determinación de la concentración de PDGF. La cantidad de PDGF detectada se normalizó al peso (mg) del andamio correspondiente utilizado.

Propiedad migratoria del factor de crecimiento derivado de plaquetas liberado

La migración de fibroblastos dérmicos humanos se evaluó usando el kit de ensayo de migración celular ORIS ™ (Platypus Technologies, Madison, WI) para evaluar la bioactividad de PDGF. Brevemente, los fibroblastos tratados con mitomicina C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se tripsinizaron y se sembraron en placas de 96 pocillos que contenían tapones proporcionados por el fabricante y se incubaron a 37 ° C y 5% CO ₂ durante la noche. Al día siguiente, se retiraron los tapones creando zonas de migración a las que se añadieron 100 μL de eluidos recogidos en varios puntos de tiempo y se incubaron durante 24 h más. 50 ng mL recién preparados ⁻¹ Se utilizaron PDGF y medios de fibroblastos basales como controles positivos y negativos, respectivamente. La migración de fibroblastos se expresó como un cambio de veces, en comparación con la migración provocada por 50 ng mL ⁻¹ Tratamiento con PDGF. Los estudios se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes para tres concentraciones de carga (2, 4 y 8 μg / mL).

Análisis estadístico

Los datos continuos se expresaron como medias ± desviaciones estándar. Las diferencias entre las medias de los grupos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Se utilizó la prueba de comparación múltiple de Tukey para determinar qué medias entre un grupo de medias eran estadísticamente diferentes. La significancia estadística se estableció en α =0,05. Todos los datos se analizaron con GraphPad Prism (San Diego, CA, EE. UU.).

Resultados y discusión

Se ha demostrado que la combinación de varios polímeros mejora significativamente las propiedades del compuesto resultante [29, 30]. Los sistemas de polímeros combinatorios permiten efectivamente la modulación de la resistencia, la flexibilidad, la biodegradación y la cinética de liberación del fármaco del andamio, que son parámetros importantes para las aplicaciones de apósitos para heridas. Sin embargo, la creación de compuestos únicos puede verse limitada por interacciones químicas intrínsecas entre los polímeros constituyentes. Por ejemplo, se observó que se formaba un precipitado de polímero al mezclar Fb cargado negativamente y CS cargado positivamente; esta observación está bien documentada para moléculas con fuertes interacciones electrostáticas en diversas condiciones de disolvente [31, 32, 33]. En consecuencia, la fabricación de un andamio compuesto de polímero CS-Fb requirió el uso de una técnica de electrohilado de extrusión dual, como se describió anteriormente [34].

Morfología de nanofibras CS-PEO / Fb

Los diámetros medios de las fibras para los andamios CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb fueron 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 y 351,1 ± 101,7 nm, respectivamente (Fig. 2). Curiosamente, los andamios compuestos CS-PEO / Fb exhibieron nanofibras más delgadas que los andamios CS-PEO o Fb. La disminución en el tamaño del diámetro de la fibra podría deberse a fuerzas electrostáticas adicionales generadas por chorros de polímero cargados simultáneamente [35,36,37]. Por tanto, la repulsión de los chorros de polímero entre sí provocada por estas fuerzas podría aumentar tanto la distancia entre hileras como el tiempo de deposición. El tiempo de deposición prolongado resultante se correlaciona con un aumento de las inestabilidades de flexión que se sabe que provocan el alargamiento de las fibras y la formación de fibras más delgadas.

Micrografías representativas de FESEM de andamios electrohilados. un CS-PEO, diámetro medio 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO / Fb, diámetro medio 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, diámetro medio 351,1 ± 101,7 nm ( n =100)

Caracterización química de la superficie mediante ToF-SIMS y ángulo de contacto con el agua

Los espectros de ToF-SIMS de los andamios CS, Fb y PEO se muestran en la Fig. 3. Normalmente, se pueden usar especies de huellas dactilares químicas únicas para distinguir componentes poliméricos individuales. Sin embargo, debido a las similitudes químicas entre CS y Fb, hubo una serie de especies que contienen nitrógeno (C ₃ H ₆ NO ⁺ , CH ₄ N ⁺ , CN ^- y CNO ^- ) presentes en ambos espectros, lo que dificulta la distinción de los polímeros entre sí. Sin embargo, cuando Fb se incorporó al andamio, el número total de CN ^- y CNO ^- especies aumentaron mientras que los otros fragmentos permanecieron sin cambios o disminuyeron. Por lo tanto, examinar los cambios en CN ^- y CNO ^- Las intensidades de los fragmentos permitieron la detección indirecta de Fb. Del mismo modo, el aumento de C ₂ H ₅ O ⁺ Se utilizaron iones (45 m / z) para identificar los fragmentos de óxido de etileno del PEO en los armazones compuestos.

Representante a positivo y b espectros de iones negativos ToF-SIMS para CS prístino (arriba), Fb (medio) y PEO (abajo). Los fragmentos de iones en círculos se utilizaron como huella digital única para identificar el compuesto

Para dilucidar la presencia y distribución de componentes Fb dentro de los andamios compuestos, CNO ^- y CN ^- Los iones se mapearon en un ráster de 50 × 50 μm de los andamios prístinos y compuestos para obtener mapas de calor (Fig. 4a, b). Se realizó la misma técnica de mapeo en C ₂ H ₅ O ⁺ para determinar la distribución de PEO (Fig. 4c). El aumento de la intensidad del mapa de calor se correlacionó con un mayor contenido de polímero de Fb o PEO. Observamos que las intensidades de CNO ^- , CN ^- y C ₂ H ₅ O ⁺ se distribuyeron uniformemente a lo largo del área ráster de 50 × 50 μm de los andamios compuestos. Debido al grosor de los andamios (93,8 ± 7,4 μm) y la deposición de fibras capa por capa, se espera que la composición de la superficie sea representativa de todo el andamio. Por lo tanto, los datos de ToF-SIM sugieren que cuando los andamios nanofibrosos CS-PEO / Fb se fabrican mediante electrohilado de hilera doble, los componentes individuales se depositan uniformemente en todo el andamio compuesto.

Mapeo ToF-SIMS de a CNO ^- , b CN ^- y c C ₂ H ₅ O ⁺ fragmentos de iones en varios andamios en un área ráster de 50 × 50 μm

Se determinó que los ángulos de contacto con el agua de los andamios fibrosos CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb electrohilados eran 44,2 ° ± 5,1 °, 61,4 ° ± 7,6 ° y 115,7 ° ± 16,2 °, respectivamente (Fig. 5). Basándose en los ángulos de contacto con el agua, los andamios CS-PEO y CS-PEO / Fb eran hidrófilos (> 90 °), mientras que los andamios Fb eran hidrófobos (<90 °). Los ángulos de contacto con el agua de los andamios compuestos de CS-PEO / Fb demostraron características de superficie que estaban entre las de sus componentes, lo que sugiere que CS-PEO y Fb se depositaron de manera homogénea durante la fabricación. Las características superficiales de las superficies poliméricas juegan un papel importante en la deposición de proteínas y factores de adhesión. Específicamente, se sabe que importantes factores de adhesión bacteriana ocurren más fácilmente en superficies hidrófobas, lo que promueve la colonización bacteriana [38]. Como tal, la naturaleza hidrófila de CS-PEO / Fb podría ser beneficiosa para disuadir la adhesión bacteriana.

Comportamiento del agua desionizada en la superficie de un sustrato de vidrio, andamios CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb

Resistencia a la tracción uniaxial mecánica de andamios CS-PEO / Fb

La prueba de tracción uniaxial se realizó en andamios nanofibrosos con un espesor medio de 93,8 ± 7,4 μm. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados, y en la Fig. 6 se muestran las correspondientes curvas de tensión-deformación. Generalmente, las propiedades mecánicas de los materiales compuestos están correlacionadas con su componente más débil. Los resultados sugieren que los andamios de solo Fb no tendrían propiedades mecánicas ideales para aplicaciones de apósitos para heridas. Esto enfatiza la importancia de incorporar CS-PEO para obtener un producto mecánicamente más estable.

Curvas de tensión-deformación de los andamios CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb. Los datos son representativos de diez andamios producidos de forma independiente

Tasa de transferencia de vapor de agua de los andamios CS-PEO / Fb

WVTR juega un papel vital en el mantenimiento de una humedad ideal del ambiente de la herida, lo que impacta positivamente en la granulación y epitelización celular [39, 40]. Los valores más altos de WVTR se correlacionan con la deshidratación rápida de la herida debido a la evaporación y la exudación, que pueden disminuir negativamente la temperatura corporal y aumentar el metabolismo. Por el contrario, los valores extremadamente bajos de WVTR se correlacionan con la acumulación de exudado, la inhibición de la cicatrización y un mayor riesgo de infección. Lamke y col. informó el WVTR para piel normal como 204 ± 12 g m ⁻² día ⁻¹ y entre 279 y 5138 g m ⁻² día ⁻¹ para la piel lesionada, dependiendo del estado de la herida [41, 42]. Para la epitelización de heridas y la mejora de la cicatrización, un WVTR ideal de 2028,3 ± 237,8 g m ⁻² día ⁻¹ se ha informado [43]. Los WVTR de los andamios CS-PEO y Fb fueron 693,2 ± 95,7 y 686,1 ± 44,17 g m ⁻² día ⁻¹ , respectivamente. Aunque más cerca del WVTR ideal que los andamios prístinos, los andamios CS-PEO / Fb (806,5 ± 56,1 g m ⁻² día ⁻¹ ) todavía caía por debajo del WVTR ideal (Fig. 7). Las manipulaciones de los parámetros físicos del andamio podrían mejorar los WVTR para imitar mejor las tasas ideales informadas.

Tasas de transferencia de vapor de agua de los andamios CS-PEO, CS-PEO / Fb y Fb electrohilados. Las barras de error representan la desviación estándar ( n =6, * p <0.05 en comparación con los andamios CS-PEO / Fb)

Viabilidad celular in vitro de fibroblastos dérmicos humanos

Los armazones de quitosano-PEO / Fb no exhibieron un efecto proliferativo significativo sobre los fibroblastos humanos durante las 48 h iniciales (Fig. 8); sin embargo, la exposición prolongada a las 72 h produjo una reducción estadísticamente significativa en la proliferación en comparación con el control sin andamio. Los resultados sugieren que existe una inhibición de la proliferación celular exhibida por el andamio, que puede acumularse con el tiempo.

Comparación de la proliferación de fibroblastos dérmicos humanos cuando se exponen al andamio electrohilado de Fb y CS-PEO / Fb ( n =9, * p <0,05 comparación realizada con "sin control de andamio" en cada momento)

La disminución de la capacidad proliferativa puede deberse al grado de acetilación (DA) asociado con el CS, que ha demostrado tener fuertes interacciones celulares a través de sus cargas positivas [44]. Younes y col. demostraron que las células de carcinoma de vejiga tratadas con CS (> 50% DA) redujeron significativamente la viabilidad después de 24 h, lo que sugiere que la citotoxicidad del CS está directamente relacionada con su DA que puede afectar la proliferación [45]. Este efecto también puede aislarse en condiciones experimentales in vitro; Estudios anteriores han demostrado que el CS no es tóxico in vivo, ya que sus productos de biodegradación podrían eliminarse a través de vías metabólicas [46]. El HFIP residual del proceso de electrohilado también puede contribuir a la citotoxicidad observada. Sin embargo, no se observó la misma citotoxicidad en el andamio Fb puro electrohilado, que también se preparó en HFIP. El HFIP probablemente se eliminó de los andamios electrohilados durante el proceso de fabricación debido a su alta volatilidad. Una disminución observable en la viabilidad celular sería evidente si el HFIP residual incorporado al sistema de fibra se liberara durante la exposición programada a fibroblastos dérmicos humanos.

Ensayo LIVE / DEAD y conexión celular

La Figura 9a-c muestra la distribución y viabilidad de los fibroblastos dérmicos sembrados en la superficie de vidrio recubierto de fibronectina, andamios CS-PEO / Fb descargados y andamios CS-PEO / Fb cargados con PDGF (4 μg / mL). Después de 24 h en cultivo, se observaron células muertas mínimas en comparación con las células vivas. No se observaron diferencias apreciables entre los andamios cargados y descargados de PDGF.

Micrografías confocales de fibroblastos sembrados en a , d vidrio recubierto de fibronectina; b , e andamio CS-PEO / Fb descargado; y c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

Abreviaturas

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Platelet-derived growth factor

PEO:

Óxido de polietileno

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate

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