Andamios electrohilados de quitosano-polietileno óxido/fibrinógeno para liberación sostenida de PDGF y curación de heridas mejorada

Resumen

La curación de heridas es un proceso multifacético gobernado por factores de crecimiento, migración celular y remodelación de matriz extracelular. Si bien los apósitos bioactivos han avanzado, solo unos pocos llegan a la práctica clínica debido a desafíos de administración. Diseñamos un andamio nanofibroso compuesto de quitosano (CS), óxido de polietileno (PEO) y fibrinógeno (Fb) usando una plataforma de electrohilado de doble boquilla. El compuesto CS-PEO/Fb resultante mostró fibras a escala nanométrica, distribución uniforme de polímeros e integridad mecánica favorable. La incorporación de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) se logró sin pérdida de bioactividad, y estudios de liberación revelaron un perfil bifásico entregando 21,6 % de PDGF en la primera hora seguido de liberación sostenida durante 48 h. Ensayos de migración de fibroblastos in vitro confirmaron que el PDGF liberado del andamio igualó la eficacia de una dosis única de 50 ng mL⁻¹, mientras que el componente Fb solo promovió modestamente la migración. La tasa de transferencia de vapor de agua del compuesto (≈807 g m⁻² día⁻¹) y resistencia a tracción (≈0,3 MPa) se alinean con estándares de apósitos para heridas clínicos. En conjunto, estos datos demuestran que los andamios electrohilados CS-PEO/Fb proporcionan una plataforma robusta y bioactiva para administración sostenida de factor de crecimiento y curación de heridas acelerada.

Antecedentes

A pesar de avances en cuidado de heridas, la traducción de apósitos bioactivos a la clínica sigue limitada. La cascada de curación de heridas depende de una interacción coordinada de citocinas, células inmunes y proteínas de matriz. Los factores de crecimiento, aunque potentes, sufren de eliminación rápida y vida media corta, necesitando dosificación repetida que es gravosa para pacientes. Un apósito capaz de administración sostenida y localizada mejorarían dramáticamente resultados y adopción.

PDGF es un agente quimiotáctico fundamental que moviliza neutrófilos, monocitos y fibroblastos, y modula deposición de matriz y formación de cicatriz. El gel Regranex® aprobado por FDA (2,2 µg cm⁻²) acelera curación ~30 % en úlceras diabéticas, sin embargo su aplicación diaria es inconveniente. Así, un sistema de liberación sostenida es deseable.

El electrohilado ofrece una ruta versátil para producir esteras nanofibrosas que emulan la matriz extracelular nativa. Polímeros naturales como colágeno, elastina y fibrinógeno tienen bioactividad inherente y afinidad por factores de crecimiento. Sin embargo, el fibrinógeno solo carece de resistencia mecánica requerida para aplicaciones de apósito a largo plazo. El quitosano, derivado desacetilado de quitina, proporciona actividad antimicrobiana y puede electrohilarse cuando se mezcla con PEO. La naturaleza policatiónica de CS complica la mezcla con Fb cargado negativamente, pero un electrohilador de doble boquilla supera incompatibilidades electrostáticas, permitiendo formación uniforme del compuesto.

Métodos

Materiales

Todos los reactivos (ácido acético, CS, PEO, Fb, HFIP, BSA, DMSO) y líneas celulares (fibroblastos dérmicos humanos PCS-201-012) se compraron de Sigma-Aldrich o ATCC y se usaron tal como se recibieron. PDGF-BB humano recombinante se obtuvo de PeproTech.

Fabricación del andamio

Soluciones CS-PEO (5,5 % p/p, CS:PEO = 2:1) se prepararon en ácido acético 1 % con 0,5 % BSA y 10 % DMSO. Fb se disolvió en mezcla 1:9 (v/v) HFIP/10× EMEM a 110 mg mL⁻¹. PDGF se añadió inmediatamente antes de hilar. Electrohilado de doble boquilla (bomba de jeringa NE-1000, agujas 18-gauge) empleó flujos de 0,7 mL h⁻¹ (CS-PEO) y 1,0 mL h⁻¹ (Fb), voltajes de 28 kV y 22 kV, y mandril rotativo a 25 RPM a 22 cm (CS-PEO) y 12,5 cm (Fb). Escaneo realizado por 3 h a 35-45 % HR.

Morfología

Imágenes FESEM (Zeiss Sigma VP-40) de muestras recubiertas de oro cuantificaron diámetros de fibra (n = 100 por andamio) vía ImageJ. Fibras CS-PEO/Fb promediaron 202 ± 113 nm, más finas que CS-PEO (270 ± 68 nm) y Fb (351 ± 102 nm) solos.

Química superficial

ToF-SIMS (Bi₃²⁺, 30 kV) mapeó iones característicos (CNO⁻, CN⁻, C₂H₅O⁺) en rasters 50 × 50 µm, confirmando distribución uniforme de CS-PEO y Fb.

Ángulo de contacto con agua

Medido según ASTM D7334-08 con 2 µL agua destilada. CS-PEO/Fb exhibió ángulo hidrofílico de 61,4 ± 7,6°, intermedio entre CS-PEO (44,2 ± 5,1°) y Fb (115,7 ± 16,2°).

Pruebas mecánicas

Pruebas de tracción uniaxial (Instron E3000, 1 mm min⁻¹) en tiras 40 × 25 mm (espesor 94 ± 7 µm) produjeron curvas tensión-deformación. CS-PEO/Fb alcanzó tensión pico de 0,31 ± 0,02 MPa, superando a Fb solo (0,12 ± 0,01 MPa).

Tasa de transferencia de vapor de agua

WVTR se determinó según ASTM E96 usando desecantes de gel de sílice; CS-PEO/Fb logró 806,5 ± 56,1 g m⁻² día⁻¹, dentro del rango clínicamente deseable (≈2000 g m⁻² día⁻¹).

Citotoxicidad

Ensayos WST-1 indirectos (ISO 10993-5) sobre 120 h mostraron sin inhibición significativa de proliferación a 48 h, aunque surgió declive modesto a 72 h, probablemente debido al grado de acetilación de CS.

Adhesión celular

Tinción Live/Dead y faloidina-DAPI de fibroblastos en superficies de andamio revelaron morfología saludable y adhesión robusta comparable a controles recubiertos de fibronectina.

Degradación

Andamios incubados en FBM (37 °C, 5 % CO₂) mostraron pérdida de masa lineal tras ráfaga inicial de 1 h, manteniendo integridad ≥48 h.

Liberación de PDGF

ELISA cuantificó liberación acumulada: 1,8 ± 0,7, 4,4 ± 1,8 y 11,4 ± 4,8 ng mg⁻¹ a cargas de 2, 4 y 8 µg mL⁻¹, respectivamente. Patrón bifásico liberó 21,6 % en la primera hora.

Migración de fibroblastos

Ensayo de migración ORIS™ demostró que eluidos de andamios cargados con PDGF igualaron migración inducida por dosis única de 50 ng mL⁻¹ PDGF, con efectos sostenidos hasta 48 h. Fb solo también promovió modestamente migración.

Resultados y Discusión

El electrohilado de doble boquilla fusionó exitosamente CS-PEO y Fb en matriz nanofibrilar homogénea, superando incompatibilidades electrostáticas. La reducción de diámetro de fibra en el compuesto se atribuye a mayor repulsión de chorro, extendiendo tiempo de deposición e induciendo inestabilidades de flexión que producen fibras más finas.

Mapeo ToF-SIMS confirmó composición superficial uniforme, y ángulos de contacto de agua indicaron superficie hidrofílica que desalienta adhesión bacteriana mientras soporta adsorción de proteínas. Pruebas mecánicas mostraron que integración de CS-PEO restaura resistencia a tracción adecuada para apósito de herida, abordando debilidad inherente de Fb.

Medidas WVTR situaron CS-PEO/Fb dentro de ventana terapéutica para ambientes de herida húmeda, equilibrando manejo de exudado y permeabilidad a oxígeno. Ensayos de citotoxicidad sugirieron que cualquier HFIP residual o concentraciones altas de DA de CS fueron mínimas; el perfil de seguridad biológica del andamio es aceptable para traducción clínica.

Perfiles de liberación de PDGF exhibieron patrón bifásico deseable: ráfaga temprana entregando ~21 % de dosis, seguida de liberación controlada lineal sosteniendo concentraciones biológicamente relevantes sobre 48 h. Esta administración sostenida elimina necesidad de cambios diarios de apósito requeridos por Regranex®, potencialmente mejorando adherencia del paciente.

Ensayo funcionales confirmaron que PDGF liberado retuvo actividad quimiotáctica, logrando migración de fibroblastos equivalente a tratamiento único de alta dosis. El efecto aditivo de propiedades quimiotácticas intrínsecas de Fb mejora aún más reclutamiento celular, sugiriendo mecanismo sinérgico.

Conclusión

Los andamios nanofibrosos electrohilados CS-PEO/Fb combinan ventajas antimicrobianas y mecánicas del quitosano con bioactividad de fibrinógeno, permitiendo administración sostenida y funcional de PDGF. Su arquitectura nanométrica, WVTR apropiado y robustez mecánica los convierten en candidatos prometedores para apósitos de heridas de próxima generación que pueden acelerar reclutamiento de fibroblastos y curación sin la inconveniencia de aplicaciones repetidas de factor de crecimiento.