Andamios nHAC/PLGA integrados con óxido de grafeno promueven proliferación de osteoblastos y regeneración ósea

Resumen

Los andamios porosos biodegradables son fundamentales en la ingeniería de tejido óseo. En este estudio, nano-hidroxiapatita/colágeno (nHAC) mezclado con ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) y cantidades variables de óxido de grafeno (GO) se fabricaron por liofilización. Los compuestos resultantes exhibieron una red porosa tridimensional continua. El GO mejoró ligeramente la hidrofilicidad y aumentó significativamente el módulo de Young, con la muestra de 1,5 % p/p GO alcanzando 10,20 ± 1,28 GPa comparado con 7,53 ± 1,25 GPa para el andamio sin GO. In vitro, osteoblastos MC3T3-E1 mostraron adhesión y proliferación marcadamente mayores en el andamio con 1,5 % GO, confirmado por ensayos CCK-8 e imágenes SEM. Estos hallazgos demuestran que los andamios nHAC/PLGA/GO combinan excelente citocompatibilidad con rendimiento mecánico superior, posicionándolos como candidatos prometedores para aplicaciones de regeneración ósea.

Introducción

Los andamios porosos tridimensionales que emulan la matriz extracelular ósea son esenciales para la reparación ósea exitosa. Las técnicas convencionales de fabricación —electrohilado, diseño topológico computacional (CTD) combinado con fabricación de forma libre sólida (SFF) y liofilización— ofrecen grados variables de control estructural y escalabilidad. La liofilización, en particular, proporciona una ruta directa para generar poros altamente interconectados por sublimación de un disolvente congelado bajo vacío.

El hueso nativo consiste en un ensamblaje jerárquico de colágeno e hidroxiapatita (HA). Los compuestos nano-hidroxiapatita/colágeno (nHAC) imitan esta arquitectura natural, proporcionando biocompatibilidad y biorreabsorción favorables. Sin embargo, la fragilidad intrínseca del colágeno y su rápida degradación limitan su uso. El ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) aporta robustez mecánica y tasas de degradación ajustables, mientras que el GO ofrece propiedades fisicoquímicas únicas —alta área superficial, refuerzo mecánico y grupos funcionales que pueden modular el comportamiento celular.

Trabajos previos han mostrado que andamios mejorados con GO mejoran la diferenciación osteogénica y proliferación celular. Aquí evaluamos sistemáticamente cómo la carga incremental de GO (0,0; 0,5; 1,0 y 1,5 % p/p) afecta el rendimiento estructural, mecánico, hidrofílico y biológico de compuestos nHAC/PLGA.

Resultados y Discusión

Estructura de andamios compuestos nHAC/PLGA/GO

El proceso de fabricación involucró disolver colágeno tipo I en ácido acético, co-precipitar iones Ca y P para formar nHAC, mezclar con PLGA y GO disperso, seguido de liofilización. La microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló una arquitectura altamente porosa con poros interconectados de 0 a 200 nm. La distribución de poros se cuantificó mediante un analizador automático de área superficial (Fig. 2f), confirmando predominio de poros sub-100 nm, rango propicio para la infiltración de osteoblastos.

Caracterización fisicoquímica y mecánica

La difracción de rayos X en polvo (XRD) confirmó la presencia de HA hexagonal; las señales de GO no fueron discernibles debido a su baja carga. Los espectros FT-IR mostraron bandas amida características del colágeno y picos de fosfato, con desplazamientos sutiles indicando interacción química entre colágeno, HA, PLGA y GO.

Mediciones nano-mecánicas cuantitativas por AFM (QNM-AFM) revelaron un aumento monótono del módulo de Young con el contenido de GO: 7,53 ± 1,25 GPa (0 %), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5 %), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0 %) y 10,20 ± 1,28 GPa (1,5 %). El andamio con 1,5 % GO mostró una ventaja de rigidez estadísticamente significativa sobre el sin GO, reflejando el efecto reforzador del GO.

Las mediciones de ángulo de contacto mostraron una disminución gradual de 125,1° (sin GO) a 101,4° (1,5 %), indicando mejor mojabilidad superficial debido a los grupos funcionales hidrofílicos del GO (Fig. 4f).

Cultivo celular y citotoxicidad

Osteoblastos MC3T3-E1 sembrados en los andamios exhibieron actividad metabólica creciente durante 7 días (ensayo CCK-8). Si bien la proliferación temprana en andamios con 0,5 % y 1,0 % GO fue ligeramente menor que el control sin GO, el andamio con 1,5 % GO igualó y superó al control en días 3, 5 y 7 (Fig. 5). Imágenes SEM confirmaron extensión celular extensa y formación de redes, con células en andamios con GO mostrando morfologías más grandes y aplanadas (Fig. 6).

Fibroblastos NIH-3T3 expuestos a suspensiones de andamios por 24 h no mostraron citotoxicidad significativa; la viabilidad permaneció above 97 % en todas las cargas de GO, affirmando la biocompatibilidad de los compuestos (Fig. 7).

Conclusiones

La liofilización permitió fabricar andamios nHAC/PLGA/GO con porosidad interconectada, rigidez mecánica mejorada e hidrofilicidad mejorada. El andamio con 1,5 % GO demostró adhesión y proliferación superiores de osteoblastos manteniendo excelente citocompatibilidad, subrayando su potencial como andamio para ingeniería de tejido óseo.

Métodos

Materiales

Colágeno tipo I, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GO y reactivos de cultivo celular se obtuvieron de proveedores establecidos. Osteoblastos MC3T3-E1 y fibroblastos NIH-3T3 se obtuvieron de bancos de células reputados.

Preparación de andamios

El colágeno se disolvió en ácido acético 0,5 M (4 g L⁻¹). Soluciones de calcio y fosfato (Ca/P = 1,66) se añadieron gota a gota a 100 gotas min⁻¹, se agitó y tituló a pH 9 con amoníaco a 37 °C. Tras 24 h, el precipitado se recogió, liofilizó y molió para producir polvo nHAC.

El GO se dispersó en dioxano (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 g L⁻¹) mediante ultrasonicación, luego se mezcló con PLGA (10 % m/v) y agitó 12 h. Se añadió nHAC en ratio de peso 1:1 a PLGA, seguido de 4 h ultrasonicación. La mezcla se congeló a –20 °C overnight y liofilizó para obtener los andamios finales.

Caracterización

SEM, AFM (modo QNM), FT-IR, XRD, ángulo de contacto y mediciones de porosidad se realizaron con protocolos estándar. Todos los datos se recogieron en triplicado.

Cultivo celular y ensayos

Células MC3T3-E1 se sembraron a 2,5 × 10⁴ células mL⁻¹ en discos de andamio y cultivaron en DMEM +10 % FBS +3 % antibióticos a 37 °C, 5 % CO₂. La proliferación se evaluó por CCK-8 en días 1, 3, 5 y 7. Para SEM, las células se fijaron con 4 % paraformaldehído, deshidrataron, secaron por punto crítico y recubrieron con oro.

Prueba de citotoxicidad

Células NIH-3T3 se expusieron a 100 mg mL⁻¹ suspensiones de andamios por 24 h, seguido de ensayo CCK-8. La viabilidad celular se calculó relativa a cultivos control.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± DE. Se aplicó prueba t de Student; p < 0,05 se consideró significativo.