Los andamios nHAC / PLGA híbridos con óxido de grafeno facilitan la proliferación de células MC3T3-E1

Resumen

Los andamios de biomateriales porosos biodegradables desempeñan un papel fundamental en la regeneración ósea. En este estudio, los andamios compuestos porosos de nanohidroxiapatita / colágeno / poli (ácido láctico-co-glicólico) / óxido de grafeno (nHAC / PLGA / GO) que contienen diferentes cantidades de GO se fabricaron mediante el método de liofilización. Los resultados muestran que los armazones sintetizados poseen una estructura porosa tridimensional. GO mejora levemente la hidrofilia de los andamios y refuerza su resistencia mecánica. El módulo de Young del andamio incorporado de GO al 1,5% en peso aumenta considerablemente en comparación con la muestra de control. Los experimentos in vitro muestran que nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) andamia significativamente la adhesión celular y la proliferación de células osteoblásticas (MC3T3-E1). Este presente estudio indica que los andamios nHAC / PLGA / GO tienen una excelente citocompatibilidad y capacidad de regeneración ósea, por lo que tienen un alto potencial para ser utilizados como andamios en el campo de la ingeniería de tejido óseo.

Antecedentes

La ingeniería de tejido óseo que combina armazones porosos tridimensionales y células óseas se ha estudiado ampliamente como un enfoque atractivo en el tratamiento del tejido defectuoso o perdido [1]. Los andamios biodegradables, que imitan la naturaleza del hueso, juegan un papel importante para alojar células, controlar la adhesión y proliferación celular y facilitar la regeneración ósea [2]. Hasta ahora, se han aplicado varios métodos, incluido el electrohilado, la integración del diseño de topología computacional (CTD) y la fabricación de forma libre sólida (SFF), y la liofilización para fabricar diferentes estructuras porosas tridimensionales (3D) [3,4,5 , 6,7]. El electrohilado es capaz de fabricar andamios nanofibrosos o microfibrosos con estructuras y composiciones complejas (alineadas, fibras en forma de resorte) [7]. Sin embargo, la eficiencia de producción es un poco baja. La integración de CTD y SFF permite el diseño de andamios anatómicos 3D con arquitectura porosa y mejor propiedad mecánica. Pero este método requiere un sólido conocimiento profesional [4]. En comparación con estos dos métodos, el método de liofilización permite fabricar estructuras porosas con un proceso mucho más simple mediante la sublimación de la fase líquida congelada al vacío para fabricar una estructura porosa [8].

Los huesos de la naturaleza poseen una arquitectura jerárquica compleja con dos componentes principales, colágeno e hidroxiapatita [9,10,11]. En la ingeniería de tejido óseo, la fabricación de una biomimetización ideal de la matriz extracelular ósea que se adapte a la adhesión y proliferación celular para el tratamiento del mal funcionamiento sigue siendo un desafío [12]. Los andamios biodegradables basados en nanohidroxiapatita / colágeno (nHAC) que imitan el hueso natural podrían proporcionar una mejor biocompatibilidad, afinidad celular y biorreabsorbibilidad [13]. Sin embargo, los inconvenientes del colágeno, incluidas las malas propiedades mecánicas y de degradación rápida, siguen siendo un obstáculo para su aplicación en la ingeniería de tejidos óseos [14]. Los polímeros alifáticos biodegradables, como el ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), con alta resistencia mecánica, excelente biocompatibilidad, biodegradabilidad y buena solubilidad en disolventes orgánicos, son materiales compensados ideales para la construcción de andamios porosos 3D para la ingeniería de tejidos óseos [15 , dieciséis]. Un andamio poroso híbrido que contiene colágeno y polímeros sintéticos combina las ventajas del colágeno y los polímeros y supera sus debilidades, que se utiliza ampliamente para la reparación y regeneración ósea [17,18,19]. Por ejemplo, Liao et al. han desarrollado un armazón óseo preparado por nHAC y poli (ácido láctico) (PLA) para promover la regeneración ósea [17]. Niu y col. han fabricado andamios compuestos de microesferas de nHAC / poli (ácido L-láctico) / quitosano para mejorar la proliferación de osteoblastos [19].

Recientemente, el óxido de grafeno (GO), una nueva hoja de carbono con un grosor de un átomo [20, 21], ha atraído un gran interés en el campo biológico porque posee una buena biocompatibilidad. Los andamios con hibridación GO son capaces de enriquecer tanto la propiedad mecánica del andamio como los comportamientos celulares, como la propagación y proliferación celular [22, 23]. Luo y col. informó de que la incorporación de GO en PLGA nanofibrous mejoró la proliferación y la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales (MSC) [20]. Jing y col. informó que la adición de 1,0% en peso de GO en el poliuretano termoplástico podría facilitar la proliferación de células de fibroblastos de ratón suizo [24]. En comparación con la adición de agentes químicos de reticulación (genipina, glutaraldehído, carbodiimida, etc. . ) [25, 26], que tienen cierta citotoxicidad, para mejorar las propiedades mecánicas de los armazones compuestos, la pequeña cantidad de armazones híbridos con GO muestra una buena biocompatibilidad. Por lo tanto, la hibridación de GO y nHAC / PLGA podría ser un nuevo andamio artificial para tejidos óseos.

En este estudio, los andamios porosos de nanohidroxiapatita / colágeno / poli (láctico-co-ácido glicólico) / óxido de grafeno (nHAC / PLGA / GO), que contienen diferentes proporciones de peso de GO (0.0, 0.5, 1.0 y 1.5 wt %) han sido fabricados y caracterizados. Los andamios de hibridación muestran estructuras porosas. La adición de GO modifica la propiedad hidrófila y la propiedad mecánica de los armazones de hibridación. Para investigar el efecto del andamio nHAC / PLGA / GO sobre la ingeniería de tejido óseo, se cultivaron las células MC3T3-E1 en los andamios de hibridación porosos. Los resultados muestran que los andamios de hibridación dopados con GO al 1,5% en peso facilitan la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular, lo que indica además que el andamio nHAC / PLGA / GO puede considerarse un candidato prometedor en la ingeniería de tejido óseo.

Resultados y discusión

Estructura de los andamios compuestos nHAC / PLGA / GO

La Figura 1 ilustra el proceso de fabricación de andamios nHAC / PLGA / GO. Los detalles del proceso de fabricación se muestran en la sección experimental. El nHAC se sintetizó antes de fabricar los andamios compuestos nHAC / PLGA / GO. La imagen del microscopio electrónico de barrido (SEM) del polvo nHAC muestra su nanoestructura. También se muestra el correspondiente espectro de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) de nHAC (archivo adicional 1:Figura S1), que revela la presencia de Ca, Cu, P, C y O.Las señales de cobre deben ser contribuciones de la muestras de apoyo. Por tanto, el nHAC está compuesto por Ca, P, C, O y la relación molar Ca:P del polvo de nHAC es 1,41, que es menor que la de la hidroxiapatita (HA) (1,66). Esto indica que el HA sintetizado es del tipo deficiencia de calcio [27], lo que conducirá a una reducción de la dureza, módulo elástico y tenacidad en nHAC. Para aumentar las propiedades mecánicas del armazón compuesto, se agregaron PLGA y GO al polvo de nHAC. La vista general óptica de los andamios nHAC / PLGA / GO fabricados con diferente cantidad de GO se muestra en la Fig. 2a. La muestra es un cilindro con un diámetro de 14 mm. Es evidente que los andamios compuestos sin GO son de color blanco. A medida que aumenta el GO, los andamios compuestos se vuelven cada vez más oscuros. Las morfologías detalladas de diferentes andamios nHAC / PLGA / GO se revelan por SEM (Fig. 2b-e). Muestra significativamente que todos los andamios forman estructuras porosas y las superficies de cuatro andamios diferentes son bastante rugosas. Para caracterizar la información de estos agujeros, utilizamos un probador automático de área superficial y porosidad para evaluar. Los resultados de la distribución de los agujeros se muestran en la Fig. 2f. El tamaño de los cuatro orificios del andamio está entre 0 y 200 nm. Y el número de agujeros que tienen decenas de nanómetros es mayor que los de unos pocos cientos de nanómetros en cuatro andamios. Se ha informado de que la porosidad de los andamios de biomateriales no es trivial para la formación de hueso in vitro e in vivo [28]. Para optimizar la integración en el tejido circundante, los andamios para la osteogénesis deben imitar la morfología, la estructura y la función del hueso [4]. Por lo tanto, la estructura porosa 3D de los andamios compuestos nHAC / PLGA / GO es fundamental para la regeneración ósea. También se muestran las imágenes SEM a gran escala de los cuatro andamios compuestos (archivo adicional 1:Figura S2), que ilustra la descripción general de las estructuras de diferentes superficies.

Diagrama esquemático del proceso de fabricación de andamios nHAC / PLGA / GO

un Imagen óptica de los andamios nHAC / PLGA / GO sintetizados con diferente cantidad de GO. b - e Imágenes SEM de b nHAC / PLGA, c nHAC / PLGA / GO (0,5% en peso), d nHAC / PLGA / GO (1,0% en peso) y e Andamios nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso). f Distribución de huecos de nHAC / PLGA / GO (0, 0.5, 1.0 y 1.5% en peso)

Caracterizaciones fisicoquímicas y mecánicas de andamios compuestos nHAC / PLGA / GO

El mecanismo del proceso de síntesis puede ser revelado por los espectros de difracción de rayos X (XRD) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) de varios compuestos y sustancias individuales (Fig. 3). Como se indica en la Fig. 3a, la fase inorgánica se determinó como HA de acuerdo con el archivo de difracción de polvo (tarjeta PDF nº 09–0432) ya que no había picos de otros materiales de Ca-P presentes en el patrón XRD. En comparación con nHA, los picos de difracción más amplios de nHAC implicaron un tamaño de grano pequeño y baja cristalinidad. Similar a nHAC, el patrón de nHAC / PLGA / GO con diferente cantidad de GO también tuvo baja cristalinidad. Sin embargo, el pico de GO no apareció en los compuestos nHAC / PLGA / GO, lo que podría deberse a la poca cantidad de GO en comparación con el volumen. La Figura 3b muestra los espectros FT-IR de varios compuestos y sustancias individuales. En la Fig. 3b, se pueden observar las bandas típicas del colágeno, como el estiramiento N – H a 3336 cm ⁻¹ para la amida A; C – H estiramiento a 3079 cm ⁻¹ para amida B; C =O estiramiento a 1656 cm ⁻¹ para la amida I; Deformación N – H a 1548 cm ⁻¹ para la amida II y el pico de absorción a 1238 cm ⁻¹ para amida III. A medida que se forma nHAC, la amida A se mueve de 3336 cm ⁻¹ a unos 3411 cm ⁻¹ , la amida B se debilitó, la amida I, amida II, amida III se mueven de 1656, 1548 y 1238 cm ⁻¹ a 1654, 1542 y 1240 cm ⁻¹ , respectivamente. Por lo tanto, confirma la reacción química entre el colágeno y el HA. Además, los picos a 1033, 601 y 563 cm ⁻¹ son los picos típicos para (PO4) ³⁻ grupo, que indica la nueva formación de HA en el colágeno debido a que el HA comercializado solo posee picos característicos de (PO4) ³⁻ a 1033, 603 y 565 cm ⁻¹ . Los picos caracterizados de PLGA alrededor de 2996 y 2944 cm ⁻¹ fueron asignados a −CH ₂ , 1752 cm ⁻¹ fue asignado a C =O, 1183 y 1093 cm ⁻¹ fueron asignados a C – O, se ven claramente. En comparación con el andamio PLGA, los picos del andamio nHAC / PLGA se mueven de 1752 a 1183 cm ⁻¹ a 1760 y 1187 cm ⁻¹ , respectivamente, que demuestran la reacción química entre la energía PLGA y nHAC. En comparación con el andamio nHAC / PLGA, los picos de los andamios nHAC / PLGA dopados con GO se movieron de 1760 a 1762 cm ⁻¹ ; se produjo un corrimiento al rojo que demuestra la reacción química entre GO y nHAC / PLGA.

un XRD y b Espectros FT-IR de diferentes componentes

La nanoestructura y la propiedad mecánica de los andamios nHAC / PLGA / GO con diferentes cantidades de GO se caracterizaron mediante un microscopio de fuerza atómica nanomecánica cuantitativa (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], que es capaz de proporciona la morfología y la rigidez de forma espontánea y se utiliza ampliamente para detectar las propiedades mecánicas de varios materiales, incluidos el hueso [30], los dientes [35], la córnea [36], etc. La figura 4a-d muestra la tomografía de cuatro tipos de composite andamios. Debido a la limitación de las áreas de escaneo, las imágenes AFM solo muestran la estructura de la superficie local. Por tanto, la estructura porosa no es obvia. Sin embargo, las imágenes AFM también muestran una morfología de superficie rugosa similar a las imágenes SEM. La rugosidad tiene un efecto importante sobre la proliferación y diferenciación celular. La superficie con superficie rugosa fue beneficiosa para la proliferación y diferenciación celular [37,38,39]. Los perfiles de línea (Fig. 4e-h) derivados de la morfología (Fig. 4a-d) muestran las diferencias máximas de altura por sí solas en diferentes direcciones de línea. Se muestra claramente que las diferencias máximas de altura oscilan entre ~ 200 y ~ 600 nm. La distribución de rigidez correspondiente (Fig. 4i) muestra que el módulo de Young de cuatro andamios diferentes es 7.53 ± 1.25, 8.34 ± 1.00, 9.15 ± 0.85 y 10.20 ± 1.28 GPa, respectivamente. Para mostrar claramente las diferencias de rigidez, también se proporciona el gráfico de barras correspondiente (Fig. 4j). Aunque el módulo de Young de los andamios nHAC / PLGA / GO con una pequeña diferencia de cantidad de GO no es significativamente diferente, por ejemplo, el nHAC / PLGA / GO con la cantidad de GO de 0.0 y 0.5% en peso (7.53 ± 1.25 y 8.34 ± 1.00 GPa), de 0.5 y 1.0% en peso (8.34 ± 1.00 y 9.15 ± 0.85 GPa), de 1.0 y 1.5% en peso (9.15 ± 0.85 y 10.20 ± 1.28 GPa), el módulo de Young de los andamios nHAC / PLGA / GO con un La gran diferencia de cantidad de GO (0,0% en peso y 1,5% en peso) son significativamente diferentes (7,53 ± 1,25 y 10,20 ± 1,28 GPa). Esto indica que la propiedad mecánica del andamio nHAC / PLGA / GO aumenta con el aumento de la cantidad de GO.

Imágenes AFM de a nHAC / PLGA, b nHAC / PLGA / GO (0,5% en peso), c nHAC / PLGA / GO (1,0% en peso) y d Andamios nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso). e - h Perfiles de línea derivados de las imágenes morfológicas. yo Distribución de la rigidez de los cuatro diferentes andamios medidos por QNM-AFM. j El gráfico de barras del módulo de Young frente a la cantidad de GO. k Los ángulos de contacto correspondientes de cuatro tipos de andamios medidos por el método de caída sésil

La hidrofilia de los andamios juega un papel clave en la interacción con las células. La adición de GO no solo aumenta la propiedad mecánica de los andamios compuestos, sino que también cambia la hidrofobicidad de cuatro tipos de andamios. La Figura 4f muestra los ángulos de contacto de diferentes andamios nHAC / PLGA / GO. Los ángulos de contacto de los andamios nHAC / PLGA fueron ~ 125,1 °, mientras que para nHAC / PLGA / GO con diferente cantidad de GO (0,5, 1,0 y 1,5% en peso) son ~ 113,4 °, ~ 103,4 ° y ~ 101,4 °, respectivamente. A medida que aumenta la cantidad de GO, los ángulos de contacto de los andamios compuestos disminuyen ligeramente debido tanto a los grupos hidroxilo como a los grupos cargados negativamente, como los grupos de ácido carboxílico en la superficie GO [40]. Por lo tanto, GO puede proporcionar una bioactividad notable a los andamios 3D nHAC / PLGA.

En general, los andamios para la ingeniería de tejidos no solo requieren la exhibición de morfología y propiedades biocompatibles, sino también una estructura porosa y resistencia física [41]. Los armazones 3D nHAC / PLGA / GO liofilizados poseen una estructura porosa debido a la sublimación del solvente. Los grupos funcionales, que incluyen las especies hidroxilo (OH), epoxi (C-O-C) y carboxilo (COOH) en las superficies de los armazones [40] inducen una buena hidrofilia. La adición de PLGA y GO proporciona suficiente fuerza física. Por lo tanto, los andamios 3D nHAC / PLGA / GO podrían ser un candidato prometedor para la ingeniería de tejidos.

Cultivo celular

Es bien sabido que los andamios utilizados para el tejido óseo deben ser biocompatibles, proliferativos de células y exclusivos de la respuesta inmunitaria [21]. El nHAC / PLGA / GO, que contiene los componentes del hueso natural (colágeno y HA) y posee propiedades mecánicas e hidrofilia adecuadas, debería ser un candidato ideal para la ingeniería de tejido óseo. Para investigar la proliferación celular de estos andamios, en este trabajo se cultivaron las células osteoblásticas MC3T3-E1. La Figura 5 muestra la viabilidad celular frente al tiempo de cultivo evaluado mediante el ensayo del kit de recuento de células 8 (CCK-8). La proliferación de células aumentó constantemente durante todo el período de cultivo para todos los grupos. Más específicamente, la proliferación celular de MC3T3-E1 en andamios nHAC / PLGA / GO (0,5 y 1,0% en peso) se reduce significativamente en el día 1, mientras que en los andamios nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) es similar a la de Andamios nHAC / PLGA. A medida que aumenta el tiempo, la proliferación celular de MC3T3-E1 en andamios nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) aumenta significativamente en los días 3, 5 y 7. Sin embargo, la proliferación celular de MC3T3-E1 en nHAC / PLGA / GO (0,5 y 1,0% en peso) los andamios no son significativamente diferentes en comparación con los andamios nHAC / PLGA.

Comparación de las células MC3T3-E1 en diferentes superficies de andamios; los asteriscos dobles indican p <0.01, número de muestras N =4

La evidencia de crecimiento celular, proliferación en diferentes andamios también fue capturada por SEM. La Figura 6 muestra la morfología de la superficie de las células de osteoblastos en cuatro armazones diferentes después de haber sido cultivadas durante 1, 3, 5, 7 días, respectivamente. En el día 1, todas las células están distribuidas uniformemente y aisladas en cuatro andamios diferentes. A medida que pasa el tiempo (días 3, 5 y 7), todos los grupos de células crecen, proliferan y comienzan a integrarse en diferentes andamios, formando una gran capa de células. En comparación con las morfologías celulares en diferentes andamios, las células en las superficies de los andamios nHAC / PLGA / GO eran mucho más grandes y estiradas que las de la superficie de los andamios nHAC / PLGA. No hay una diferencia significativa en la situación de la propagación de las células, la adhesión entre las células en nHAC / PLGA / GO con diferente cantidad (0,5, 1,0 y 1,5% en peso) de acuerdo con las imágenes SEM.

un - p Imágenes SEM de células MC3T3-E1 cultivadas en cuatro andamios diferentes durante 1, 3, 5 y 7 días. Las barras de escala son de 50 μm en todas las imágenes. El asterisco blanco representa las células osteoblásticas MC3T3-E1

Prueba de citotoxicidad

La citotoxicidad del GO es una preocupación fundamental, para su aplicación en el campo de la biología. Entonces evaluamos la citotoxicidad de los cuatro andamios en el tiempo de 24 h. Los resultados se muestran en la Fig. 7. La vitalidad celular de las células de fibroblastos (NIH-3T3) en nHAC / PLGA contienen 0.5,1, y 1.5% de GO es 99,101.11, y 97.86% se relacionan con nHAC / PLGA, que no tienen una diferencia significativa que nHAC / PLGA, lo que indica que el aumento de óxido de grafeno es seguro entre 0 y 1,5%.

La actividad relativa de las células HIH-373 en nHAC / PLGA (0,5, 1, 1,5% en peso) se relaciona con nHAC / PLGA

La Tabla 1 resumió las propiedades mecánicas y las propiedades del cultivo celular de cuatro tipos de armazones compuestos. A medida que aumenta el GO, el módulo de Young de los andamios aumenta en consecuencia. Sin embargo, solo las propiedades mecánicas de nHAC / PLGA y nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) son claramente diferentes. La viabilidad celular de cuatro tipos de andamios muestra la misma tendencia con la propiedad mecánica, es decir, los valores de DO de todos los grupos aumentan con el aumento del tiempo de cultivo celular, pero solo el nHAC / PLGA y nHAC / PLGA / GO (1.5 p. %) los grupos muestran una diferencia significativa. Esto indica que la propiedad mecánica de los armazones está estrechamente relacionada con la propiedad del cultivo celular. Los resultados pueden deberse a que las células de los tejidos pueden sentir y responder a la rigidez de sus sustratos [42,43,44,45]. El ajuste de las propiedades mecánicas de los sustratos puede promover respuestas celulares que afectan las interacciones de la superficie celular junto con el crecimiento y la viabilidad celular [46,47,48,49]. Haugh y col. encontraron que la rigidez de los andamios mejoraba la actividad de las células MC3T3-E1 (proliferación y migración celular) [50]. Engler y col. demostraron que un factor físico importante en la respuesta de muchos tipos de células era la rigidez del sustrato [51]. Descubrieron que las células del músculo liso se derivan de la aorta de rata (línea A7R5), al igual que otras células dependientes del anclaje, se extienden más y organizan su citoesqueleto y adherencias focales mucho más en sustratos "rígidos" que en sustratos "blandos". La propiedad mecánica no solo afecta el comportamiento de las células sino también las actividades de los tejidos. Duncan y col. estudiaron la mecanotransducción y la tensión mecánica de la respuesta funcional en el hueso. Descubrieron que la carga mecánica puede inhibir la resorción ósea y aumentar la formación ósea in vivo [52]. Por lo tanto, los andamios nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) más rígidos podrían promover la proliferación de células MC3T3-E1.

La citotoxicidad de GO es una preocupación fundamental para su aplicación en el campo de la biología. Hasta ahora, han surgido dos argumentos. Una afirmación que el GO induciría citotoxicidad y su efecto depende de la concentración. Por ejemplo, Chatterjee, et al. informó la respuesta tóxica con dependencia de dosis diferencial para GO [53]. Pinto y col. informó de que sólo las concentraciones bajas de GO pueden incorporarse de forma segura en PLA para facilitar la adhesión y la proliferación celular [6]. Los otros afirman que una cantidad aún mayor de GO tendría una buena biocompatibilidad y mejoraría tanto las propiedades mecánicas de los sustratos como los comportamientos celulares. Shin y col. estudiaron que los mioblastos esqueléticos C2C12 se mejoraron en matrices híbridas PLGA-GO-colágeno que en matrices PLGA, PLGA-colágeno [54]. Y Luo, et al. informó que los andamios de nanofibras de PLGA dopados con GO pueden mejorar la diferenciación osteogénica de las CMM [22]. En este estudio, el GO fue seleccionado con base en el primer argumento. La cantidad limitada se agrega a los armazones compuestos para no citotoxicidad y propiedades mecánicas mejoradas. La conjugación de GO en andamios nHAC / PLGA mejoró significativamente el crecimiento y la proliferación celular. Aunque el número de células en nHAC / PLGA y nHAC / PLGA con una pequeña cantidad de GO, por ejemplo, nHAC / PLGA / GO (0,5% en peso), es más o menos el mismo, el número de células en nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) del andamio fue mayor que el de los andamios nHAC / PLGA. Estos resultados indican que los andamios nHAC / PLGA / GO son biofuncionales con la capacidad de mejorar el crecimiento y la proliferación de células MC3T3-E1. Por lo tanto, la excelente biocompatibilidad y biofuncionalidad permite que nHAC / PLGA / GO se empleen como andamios efectivos para la regeneración ósea.

La naturaleza del biomaterial y el proceso de fabricación son muy importantes para las propiedades del andamio [28]. Hasta ahora, los biomateriales se han estudiado ampliamente, incluidos metales [55], cerámica [56], vidrio [57], polímeros sintetizados químicamente [58], polímeros naturales [59] y combinaciones de estos materiales para formar compuestos [60]. . Cambiar los componentes de los andamios compuestos inducirá la propiedad de los andamios. Por ejemplo, para fabricar el andamio biomímico de hueso natural, en este estudio se ha utilizado el colágeno tipo I. Actualmente, la familia del colágeno incluye más de 20 tipos diferentes de colágeno existentes en la piel, hueso, cartílago, etc. Reemplazando el colágeno tipo I por otros tipos, es posible fabricar diferentes andamios compuestos para diferentes propósitos. Por ejemplo, el colágeno tipo II es uno de los colágenos formadores de fibrillas y el tipo de colágeno predominante en el cartílago. La coordinación del colágeno tipo II en los andamios puede facilitar la regeneración del cartílago óseo [61]. Además, el colágeno con el recocido adecuado puede fortalecer aún más los andamios, lo que puede inducir un nuevo material compuesto con estructuras funcionales. Además de la naturaleza de los biomateriales, el procesamiento también determina la funcionalidad de los andamios, como los diferentes métodos de procesamiento. La química y el procesamiento del material determina las propiedades funcionales máximas, así como la forma en que las células interactúan con el andamio. Los andamios de propiedades y requisitos en la ingeniería de tejidos óseos se han investigado ampliamente, incluida la degradación [62], las propiedades mecánicas [63], la liberación de citocinas [64] y las combinaciones de andamios y células [65].

Conclusiones

En resumen, los andamios nHAC / PLGA / GO con diferentes cantidades de GO (0,0, 0,5, 1,0 y 1,5% en peso) se fabricaron mediante el método de liofilización. Los andamios nHAC / PLGA / GO fabricados muestran una estructura porosa. Además, la propiedad mecánica y la hidrofilia de los armazones se mejoran debido a la adición de PLGA y GO. El estudio in vitro muestra que los andamios porosos facilitan la adsorción, el crecimiento y la proliferación celular. Estos andamios nHAC / PLGA / GO podrían ser un candidato prometedor para aplicaciones de tejido óseo.

Métodos

Materiales

El colágeno de tipo 1 liofilizado purificado se obtuvo de Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. Se compró PLGA con una relación láctido:glicólido de 75:25 y un Mw de 95.000 g / mol de Shandong Medical Appliance Factory (China). El GO se adquirió de la bioquímica Aladdin de Shanghai Polytron Technologies Inc. Las células de osteoblastos MC3T3-E1 fueron proporcionadas por el banco de células de la Academia China de Ciencias de Shanghai. Se obtuvo acceso al suero fetal bovino (FBS), antibiótico-antimicótico, CCK-8 y medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) de Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-dioxano, solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0.1 M, PH 7,4), y todos los demás productos químicos eran de grado analítico y se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional.

Preparación de los andamios compuestos nHAC Power y nHAC / PLGA / GO

El método de composición de polvo de nHAC se ha informado anteriormente [66,67,68]. Brevemente, se disolvió colágeno en ácido acético (0,5 mol / L) formando una solución con una concentración de 4 g / L. El CaCl ₂ y H ₃ PO ₄ (Ca / P =1,66) las soluciones se añadieron luego por separado mediante gotas. La tasa de caída es de 100 gotas por minuto. La solución se agitó suavemente y se tituló a 37ºC con una solución de amoniaco a pH 9. Después de 24 h, la deposición de nHAC se recogió mediante centrifugación y liofilización. Para la preparación de andamios compuestos de nHAC / PLGA / GO, GO se dispersó uniformemente en dioxano usando una trituradora de células ultrasónica, formando una concentración final de 0.0, 0.5, 1.0 y 1.5 g / L, respectivamente. A continuación, se añadió el PLGA a las soluciones de GO, formando una concentración final del 10% (m / v). Las soluciones de GO / PLGA se agitaron luego suavemente a temperatura ambiente durante 12 h. La solución final se formó añadiendo la energía de nHAC a la solución de GO / PLGA en una relación en peso de nHAC:PLGA de 1:1. A continuación, la solución de nHAC / PLGA / GO formada se agitó y se sometió a ultrasonidos durante 4 h. Después de congelar a -20 ° C durante la noche, los armazones compuestos nHAC / PLGA / GO se obtuvieron mediante liofilización para eliminar el dioxano.

Caracterizaciones

Los andamios compuestos se recubrieron con oro y se observaron bajo un SEM (JSM-7100F). Rociamos oro durante 20 s para la preparación de muestras de microscopía electrónica. La topografía y las propiedades mecánicas de las matrices se caracterizaron mediante microscopía de fuerza atómica (AFM, Multimode VIII, Bruker, Alemania) en el aire. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software de análisis Gwyddion y Nanoscope. El análisis de la composición de los armazones compuestos nHAC / PLGA / GO se realizó mediante un espectrofotómetro FT-IR (VECTOR22, Bruker, Alemania). Todos los espectros se registraron en modo de absorción en el rango de longitud de onda de 1000-2200 cm ⁻¹ con una resolución de 4.0 cm ⁻¹ y escaneo de 16 veces. Los ángulos de contacto de las muestras se midieron utilizando un sistema de medición de ángulos de contacto por el método de gota sésil (EasyDrop, modelo DAS30, kruss, Alemania). Los patrones de XRD se midieron utilizando el difractómetro de rayos X (D8 DISCOVER). La radiación de Cu-Kα (λ =0.154 nm) es de 40 kV y 30 mA. La frecuencia de exploración de las mediciones es de 8 ° min ⁻¹ sobre el rango de 2θ de 5–80 ° a RT. La porosidad de los andamios se midió mediante un analizador automático de superficie y porosidad (ASAP 2460, Micromeritics, GA, EE. UU.).

Cultivo celular

Se incubaron células de osteoblastos MC3T3-E1 en DMEM complementado con FBS al 10% y solución antibiótico-antimicótica al 3% a 37 ° C y CO ₂ al 5% en una incubadora de células. La unión y la proliferación iniciales se probaron utilizando CCK-8 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en las que el número de células viables era directamente proporcional a los productos de reacción metabólica obtenidos en el ensayo CCK-8 [69]. Brevemente, las células de osteoblastos MC3T3-E1 se sembraron a una densidad de 2,5 × 10 ⁴ células por pocillo en las matrices nHAC / PLGA, nHAC / PLGA / GO (0,5% en peso), nHAC / PLGA / GO (1,0% en peso) y nHAC / PLGA / GO (1,5% en peso) incluidas en cultivo celular de 48 pocillos plato. Las células se incubaron con la solución de CCK-8 en las últimas 2 h de los periodos de cultivo (1, 3, 5 y 7 días) para la proliferación a 37 ° C en la oscuridad. La absorbancia se midió a la longitud de onda de 450 nm utilizando un lector ELISA (DNM-9602).

Las muestras de células para la medición de SEM se fijaron con formaldehído y luego las muestras se deshidrataron a través de una serie graduada de etanol (30, 50, 75, 95 y 100%) durante 15 min en cada concentración. Luego, las muestras se secaron por punto crítico y se dejó que ocurriera el secado con un analizador de dióxido de carbono (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

$$ \mathrm{Cell}\ \mathrm{viability}\ \left(\%\right)=\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{experiment}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]/\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{control}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]\times 100\% $$

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Statistical Analysis

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). t del estudiante test was used to the statistical analysis. A value of p < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p < <0.01.

Abreviaturas

3D:: Tridimensional
AFM:: Microscopía de fuerza atómica
CCK-8:: Cell counting kit-8
CTD:: Computational topology design
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle media
EDS:: X-ray spectroscopy
FBS:: Fetal bovine serum
FT-IR:: Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier
GO:: Óxido de grafeno
HA:: Hydroxyapatite
MC3T3-E1:: Osteoblast cells
MSCs:: Mesenchymal stem cells
nHAC:: Nano-hydroxyapatite/collagen
NIH-3T3:: Fibroblast cells
PBS:: Phosphate-buffered saline
PLA:: Poly(lactic acid)
PLGA:: poly(lactic-co-glycolic acid)
QNM-AFM:: Quantitative nano-mechanical atomic force microscope
SD:: Standard deviation
SEM:: Microscopio electrónico de barrido
SFF:: Olid free-form fabrication
XRD:: Difracción de rayos X

Nanopétalos mesoporosos de óxido de níquel (NiO) para detección de glucosa ultrasensible Síntesis fácil de óxido de estaño mesoporoso similar a un agujero de gusano a través del autoensamblaje inducido por evaporación y las propiedades mejoradas de detección de gas

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias