Dielectroforesis modulada en frecuencia de vesículas y células: trayectorias en U predecibles en la frecuencia de cruce

Resumen

Hemos derivado un modelo integral para la fuerza dielectroforética (DEP) ejercida sobre partículas micro- y nanoescópicas cuando se exponen a campos eléctricos modulados en frecuencia (FM). Al sintonizar la banda de frecuencia de la onda FM para abarcar la frecuencia de cruce f_X de la parte real del factor de Clausius-Mossotti, nuestra teoría predice una reversión sistemática de la fuerza DEP cada vez que la frecuencia instantánea cruza f_X. Experimentalmente, observamos giros en U periódicos en vesículas multilamelares (MLVs), células de leucemia T humana (TL), células de leucemia B (BL) y glóbulos rojos (RB) bajo FM-DEP. El seguimiento por video de estos giros en U proporciona un método rápido, <30 segundos, y altamente preciso para determinar f_X, útil tanto para suspensiones salinas como de nanopartículas donde el flujo de solvente inducido por campo eléctrico se minimiza. La precisión de f_X se confirmó mediante dos experimentos independientes: (1) midiendo la fuerza DEP en una sola vesícula bajo DEP de corriente alterna (AC) a varias frecuencias sinusoidales y comparando el f_X resultante con el obtenido de FM-DEP; y (2) evaluando cómo f_X varía con la conductividad del medio circundante para tres tipos de células. El segundo enfoque permitió la estimación simultánea de conductividades citoplasmáticas y capacitancias de membrana usando un modelo de capa única refinado. Las conductividades citoplasmáticas fueron ligeramente inferiores a los rangos reportados previamente, mientras que las capacitancias de membrana coincidieron estrechamente con valores de la literatura.

Antecedentes

La polarizabilidad celular está dominada por las propiedades eléctricas de la membrana y el citoplasma, que varían con la frecuencia del campo aplicado. Este espectro dieléctrico dependiente de la frecuencia permite la discriminación libre de etiquetas de fenotipos celulares mediante espectroscopía de impedancia, DEP AC, DEP de onda viajera (twDEP) y electrorrotación [1–16]. Comparados con métodos basados en anticuerpos o etiquetado adhesivo, estas técnicas eléctricas evitan la modificación y activación potencial celular, haciéndolas atractivas para clasificación celular no invasiva.

La DEP surge en un campo eléctrico no uniforme, generando una fuerza proporcional al gradiente de la amplitud del campo y la parte real del factor de Clausius-Mossotti (CM). El gradiente de fase da origen a twDEP o electrorrotación, que proporcionan información dieléctrica complementaria. Nuestro trabajo extiende la DEP AC convencional introduciendo campos eléctricos FM, permitiendo el recorrido continuo de la frecuencia de cruce f_X y permitiendo una caracterización dieléctrica rápida.

En configuraciones típicas de DEP AC, el campo se aplica entre electrodos microfabricados fijos, limitando la flexibilidad espacial. Las pinzas electrónicas —donde agujas de electrodos micromanipulados entregan el campo— ofrecen una alternativa versátil y sin contacto. Sin embargo, las mediciones dieléctricas requieren tiempos de exposición cortos (<30 s) para reducir efectos de flujo de solvente, lo cual es desafiante con sistemas multi-electrodo. FM-DEP aborda esto modulando la frecuencia manteniendo la geometría del electrodo constante.

Nuestro sistema plug-in (Fig. 1) emplea dos agujas de electrodo de tungsteno, cada una de 0,5 µm de diámetro de punta, posicionadas a 100 µm de distancia. Las agujas son impulsadas por un generador de forma de onda arbitraria y amplificador de corriente, y todo el conjunto se monta en un micromanipulador de patch-clamp bajo un microscopio invertido. Esta configuración permite la manipulación precisa y sin contacto de vesículas o células individuales sobre el sustrato.

La onda FM se define por

𝐸(𝐫,t)=𝐴(𝐫)cosθ(t),

con la fase relacionada con la frecuencia instantánea f(t) por θ̇=2πf(t). Usamos una modulación FM de banda ancha:

f(t)=f_c+Δf cos(2πf_m t),

donde la frecuencia de modulación f_m es mucho menor que el rango de frecuencia portadora, satisfaciendo la condición de límite de banda ancha (WBL) Δf/f_m≫1.

Métodos

Materiales

Las MLVs se prepararon a partir de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC; Avanti Polar Lipids). Una solución de 1 mL de DOPC (20 mM) en cloroformo/metanol (2:1 v/v) se secó bajo nitrógeno y se selló al vacío por >12 h. La película delgada se rehidrató con agua desionizada e incubó a 25 °C durante varias horas.

Líneas celulares de leucemia T humana (JKT-β-del) y leucemia B (CCRF-SB) se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10 % suero fetal bovino y 100 mM piruvato sódico a 37 °C, 5 % CO₂. Tras 1 semana, las células se pelletizaron (370 g, 3 min, dos veces) y resuspendieron en 1 mL RPMI 1640. Las suspensiones se diluyeron luego en sacarosa isotónica 200 mM para lograr conductividades deseadas.

Células RB humanas se aislaron de sangre total de voluntarios sanos (principios de los veinte). Las células se suspendieron en una mezcla RPMI 1640 de hematocrito 3,1 % y diluyeron con sacarosa 200 mM. Todos los experimentos con RB se realizaron dentro de 10 min de la extracción de sangre.

Configuración Experimental

La conductividad de las suspensiones se midió con un medidor SevenMulti (Mettler-Toledo). El campo FM o AC fue generado por un generador de formas de onda Agilent 33220A y amplificado por un amplificador de corriente F30PV. Dos agujas de tungsteno de 0,5 µm, separadas por 100 µm, entregaron el campo. El par de agujas se posicionó sobre 50 µL de suspensión en una etapa calentada (25 °C). La imagen se realizó con un microscopio Nikon TE2000-U y una cámara CCD Retiga Exi (25 fps). La resolución de frecuencia de la forma de onda FM se verificó dentro del error experimental.

Las películas adicionales S1–S3 demuestran manipulación DEP AC de células diatomeas en agua desionizada: (S1) rotación a 30 kHz, (S2) empuje hacia una pared de vidrio a 100 kHz, y (S3) recuperación a 20 MHz.

Resultados y Discusión

Observación Experimental de una Célula Leucémica Experimentando FM-DEP

Las agujas plug-in permiten la aplicación del campo sobre el sustrato, facilitando la selección precisa de células. La película S4 muestra una célula diatomea triangular respondiendo a un salto de frecuencia 100–500 kHz a intervalos de 0,5 s. Las películas S5 y S6 presentan trayectorias típicas en U de células TL bajo FM-DEP (modulación 0,25 Hz, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). La Fig. 2 muestra una trayectoria 3D (x, y, t) donde el origen corresponde a la punta de la aguja. El eje x se alinea con la tangente a la superficie del electrodo; el eje y refleja la amplitud del giro en U.

Los giros en U comprenden tres fases: alejarse de la aguja, acercarse tras un giro en U, y permanecer en la superficie del electrodo. El flujo de solvente a menudo impide el retorno exacto al mismo punto, pero el momento de la salida y el inicio del giro en U es claro. El período observado de giro en U (≈4 s) coincide con el período de modulación de 0,25 Hz.

Estudio Teórico sobre FM-DEP

Para una partícula esférica con permitividad interior ε_in y conductividad σ_in y exterior ε_out, σ_out, la fuerza DEP es

𝐹_DEP(𝐫,t)=𝐩(𝐫,t)·∇𝐸(𝐫,t),

con el momento dipolar

𝐩(𝐫,t)=4πR³ε_out K_H {𝐸(𝐫,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(𝐫,t)},

donde K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ⁻¹=τ₀⁻¹–τ⁻¹, y τ₀ y τ son los tiempos característicos definidos en el texto. Promediando sobre un ciclo AC se obtiene la fuerza DEP media ⟨𝐹_DEP⟩=χ(f_AC)∇A_RMS², donde χ(f) es proporcional a la parte real del factor CM.

Reemplazando el campo AC con una onda FM e invocando el WBL, la fuerza DEP promediada se convierte en

⟨𝐹_DEP(𝐫,t)⟩=χ{f(t)}∇A_RMS²,

mostrando que la dirección de la fuerza cambia cada vez que f(t) cruza f_X. Esto explica los giros en U periódicos observados experimentalmente.

Resolviendo para el instante cuando f(t)=f_X se obtiene

f_X = f_c – Δf cos(πf_m Δt_n),

donde Δt_n es el tiempo medido desde la salida del electrodo hasta el giro en U. Así, el método FM-DEP proporciona una determinación rápida de f_X a partir de la trayectoria observada.

Comparación de Frecuencias de Cruce de una MLV Individual Determinadas por FM- y AC-DEP

Usando una suspensión de MLV libre de sal, comparamos f_X obtenido de FM-DEP (rango FM 10–50 kHz, f_m=0,1 Hz, período 10 s) y AC-DEP (sinusoide 30–100 kHz). De la trayectoria FM, el tiempo medio de salida fue 5,8 ± 0,2 s, produciendo f_X=35 ± 1 kHz. Las mediciones de fuerza AC-DEP mediante aguja móvil produjeron una curva fuerza-frecuencia que ajustó el modelo F_DEP(f)= [L+(2πfτ)²H]/[1+(2πfτ)²], con parámetros ajustados L=–21,02 pN, H=19,03 pN, τ=4,9 µs, dando f_X=34,15 kHz, en excelente acuerdo con el resultado FM.

Dependencias de Conductividad de las Frecuencias de Cruce para Células Biológicas

Aplicamos FM-DEP a células TL, BL y RB en rangos de conductividad 60–160 mS m⁻¹ (Δf≈700 kHz, f_m=0,25 Hz). Para cada tipo celular, medimos los tiempos de salida de 10 células por gota, promediados sobre dos gotas, y derivamos f_X usando la Ec. (10). La Figura 6 grafica el f_X resultante versus σ_out. Los datos se ajustaron al modelo de capa única extendido f_X = [σ_out – (σ_out²)/(2σ_cyt)]/(√2 π R C_m) + f_X0, produciendo capacitancias de membrana C_m y conductividades citoplasmáticas σ_cyt que concuerdan con valores de literatura (C_m≈0,5–1,5 µF cm⁻², σ_cyt≈0,3–0,8 S m⁻¹). La consistencia entre tipos celulares confirma la fiabilidad de FM-DEP para caracterización dieléctrica.

Conclusiones

Nuestra teoría basada en WBL y experimentos confirman que FM-DEP produce giros en U predecibles en la frecuencia de cruce, permitiendo una determinación rápida, <30 segundos, de f_X. Las mediciones FM-DEP de MLVs coinciden con mediciones directas de fuerza AC-DEP, mientras que los datos de f_X dependientes de conductividad producen capacitancias de membrana que se alinean con la literatura. FM-DEP ofrece, por tanto, un método robusto y sin contacto para espectroscopía dieléctrica de vesículas y células, y puede extenderse a partículas sub-micrónicas y nanoscópicas en configuraciones on-chip para espectroscopía electrocinética en tiempo real.

Abreviaturas

AC:

Corriente alterna

BL:

Leucemia de células B

CM:

Clausius-Mossotti

DEP:

Dielectroforesis

DOPC:

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

FM:

Modulada en frecuencia

MLV:

Vesícula multilamelar

RB:

Glóbulo rojo

RMS:

Raíz cuadrada media

TL:

Leucemia de células T

twDEP:

Dielectroforesis de onda viajera

WBL:

Límite de banda ancha