Mejora de la osteoinductividad con andamios de fibroína de seda cargados con rhBMP-2 para ingeniería de tejido óseo

Resumen

Existe una demanda creciente de formulaciones de andamios de fibroína de seda (FS) para aplicaciones biomédicas. La FS se reticuló mediante glutaraldehído con la proteína morfogenética ósea recombinante humana-2 (rhBMP-2) osteoinductiva en diferentes proporciones: (i) 3% FS sin rhBMP-2 (FS), (ii) 3% FS con cantidad igual de rhBMP-2 (FS+BMP2), y (iii) 12% FS con 3% de rhBMP-2 (4FS+BMP2). Estas soluciones se utilizaron en la fabricación de nanoandamios mediante electrohilado para evaluar el potencial osteoinductivo incrementado de los andamios de FS con rhBMP-2. La relación tensión-deformación sugirió que no hay pérdida de resistencia mecánica de las fibras con la adición de rhBMP-2, y la resistencia mecánica del andamio mejoró con el aumento de la concentración de FS. La asociación de rhBMP-2 aumentó la capacidad de retención de agua del andamio, como lo demuestran los estudios de hinchamiento. La viabilidad de las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) fue mayor en los andamios conjugados, y estos no mostraron citotoxicidad hacia las células huésped. Las células presentaron una mayor actividad de fosfatasa alcalina en los andamios conjugados, tanto en condiciones in vitro como in vivo, lo que establece la mayor osteoinductividad del nuevo constructo. Los andamios resultaron efectivos para la formación ósea in vivo.

Antecedentes

La capacidad regenerativa del hueso permite la reparación de pequeñas fracturas por sí mismo. Se forma hueso, seguido de la unión y, finalmente, la reconstrucción de la forma y estructura original. Sin embargo, esta capacidad es limitada, lo que crea la necesidad de autoinjertos o aloinjertos para el tratamiento [1]. El aloinjerto implica obtener hueso de un donante separado que puede causar reacción inmunológica. El autoinjerto, donde el hueso se obtiene del propio cuerpo del paciente, no crea problemas inmunológicos pero está limitado por la cantidad suficiente de hueso disponible [2,3,4].

La ingeniería de tejidos se percibe como una tecnología potencial para superar la limitación inmunológica del aloinjerto y autoinjerto. Con la ingeniería de tejidos, células especializadas como células madre mesenquimales humanas u osteosarcoma (MG63) se cultivan en un ambiente adecuado sobre un andamio pre-fabricado, y este sistema de células y andamio se usa como injerto [5, 6].

El andamio proporciona anclaje y nicho bioquímico a las células para su supervivencia y proliferación. Deben considerarse varias propiedades: resistencia mecánica, osteoinducción, biorresorción, porosidad graduada y biocompatibilidad al seleccionar material para fabricar andamios. La osteoinducción (inducción de formación ósea) es una de las propiedades requeridas del material para fabricar andamios de ingeniería de tejido óseo (ITO) [7]. Los andamios con factores osteogénicos son potentes para imitar el proceso de regeneración ósea que acopla angiogénesis y osteogénesis, lo que puede reclutar células progenitoras y su diferenciación. Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) son una clase de factores de crecimiento que inducen la formación ósea y se proponen para aplicaciones de ITO junto con matriz ósea desmineralizada (DBM) y fosfato de calcio [8,9,10].

Varios grupos han reportado el uso de metales, cerámicas, polímeros sintéticos y compuestos, y fibroína de seda como materiales potenciales para fabricación de andamios en ITO. La fibroína de seda (FS) se ha reportado como material adecuado para fabricación de andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos debido a sus notables propiedades mecánicas y biocompatibles [5]. Hasta la fecha, no se ha publicado ningún informe que evalúe los beneficios asociativos de las BMPs con nanoandamios electrohilados de FS.

Aquí reportamos la fabricación de novedosos nanoandamios electrohilados de fibroína de seda conjugados con proteína morfogenética ósea recombinante humana-2 (rhBMP-2). Los andamios se compararon con andamios puros de FS para elucidar el efecto de la conjugación con rhBMP-2 sobre la osteoinducción. También se midieron las propiedades de viabilidad y proliferación celular para establecer la potencia del andamio para aplicaciones nuevas y mejores de ingeniería de tejido óseo.

Métodos

Preparación de soluciones acuosas de FS/BMP2

Primero, la FS se aisló de los capullos del gusano de seda, Bombyx mori, como solución acuosa. Se siguió el protocolo establecido con ligeras modificaciones [11]. Los capullos se hirvieron en 100 mL de Na₂CO₃ 0,02 M durante 20 min y luego se enjuagaron exhaustivamente con agua destilada para eliminar el exceso de sericina y cera solubles en agua. La fibroína extraída se disolvió en solución de bromuro de litio 9 M a 60 °C durante 4 h y se dializó contra agua durante 4 días. La concentración final se determinó pesando la materia seca después del secado y fue del 7% p/v. Esta solución se usó después de concentrarla a diferentes niveles por diálisis contra 1 L de solución de polietilenglicol (PEG, 10.000 g mol⁻¹) al 25% a temperatura ambiente. Las soluciones acuosas diluidas de FS se prepararon diluyendo con agua destilada, y todas las soluciones se almacenaron a 10 °C hasta su procesamiento. El polvo liofilizado de proteína morfogenética ósea recombinante humana-2 (rhBMP-2) se disolvió en PBS (pH 3,8). La solución de proteína se esterilizó con filtros de jeringa de 0,22 μm y se añadió como solución acuosa a cada solución de fibroína con agitación continua. Se empleó reticulación mediada por glutaraldehído para asociar BMP con fibroína. Brevemente, para 10 mL de mezcla de reacción, 5 mL cada uno de 6% fibroína de seda y 1% rhBMP-2 se reticulizaron usando 200 μL glutaraldehído y 40 μL, 12 N HCl como agente activador de grupo. Con este procedimiento, se prepararon tres soluciones: (i) 3% fibroína de seda sin rhBMP-2 (FS), (ii) 3% fibroína de seda con 0,5% de rhBMP-2 (FS+rhBMP-2), y (iii) 12% fibroína de seda con 0,125% de rhBMP-2 como en (ii) (4FS+rhBMP-2). Estas soluciones se utilizaron en procedimientos de electrohilado para fabricación de andamios.

Fabricación de andamio por electrohilado

Para la fabricación del andamio, cada solución se cargó en una jeringa de vidrio de 5 mL con aguja de acero inoxidable (25G, DI 0,26 mm, Sigma Aldrich) conectada a una fuente de CC de 5,5 kV. Para la preparación de fibras, el caudal de salida se mantuvo en 0,4 mL h⁻¹ usando una bomba de jeringa, y las fibras electrohiladas se recogieron en papel de aluminio रखा a una distancia de 15 cm de la punta del capilar. Las muestras se recogieron durante 4 h cada una.

Microscopía electrónica de barrido

Para el examen morfológico de los andamios preparados, se realizó MEB usando Zeiss EVO40SEM. Las muestras se recubrieron con oro por sputtering antes de escanear, y las imágenes se procesaron posteriormente. La determinación del diámetro de fibra se realizó promediando los diámetros de 10 fibras aleatorias en el marco de la imagen.

Propiedades mecánicas del andamio

Se realizaron experimentos de compresión para evaluar las propiedades mecánicas de los andamios desarrollados usando un probador electromecánico de mesa de columna única Instron (modelo 3345, Instron, Canton, MA). Fibras con 0,2 mm de diámetro, obtenidas por electrohilado a duraciones más largas, se usaron para determinar la resistencia a la tracción y el alargamiento a la rotura a partir de las curvas tensión-deformación a 25 °C y 50% de humedad.

Estudio de hinchamiento

Para la medición de la relación de hinchamiento, cada formulación se disolvió en PBS (pH 7,4) a 37 °C. Las muestras se retiraron a intervalos de tiempo preestablecidos, y el peso seco se midió usando una balanza electrónica. La prueba continuó hasta alcanzar el peso de equilibrio. La relación de hinchamiento se expresó como:

$$ \mathrm{Relación\ de\ hinchamiento}\left(\%\right)=\frac{W\mathrm{s}-W\mathrm{o}}{W\mathrm{o}} $$

donde, W _o = peso seco inicial de las matrices nanofibrosas y W _s = peso de las matrices nanofibrosas hinchadas en cada punto de tiempo.

Cultivo celular

Se utilizaron células madre mesenquimales humanas (hMSCs) en el presente estudio para evaluar el potencial osteoinductivo de los nanoandamios fabricados. Las hMSCs se cultivaron y mantuvieron en DMEM con 10% suero fetal bovino y 1% penicilina, a 37 °C en atmósfera humidificada con 5% CO₂ hasta alcanzar 90% de confluencia. Luego, las células se tripsinizaron, centrifugaron y resuspendieron en medio para cuantificación.

Los andamios se esterilizaron lavando con etanol e irradiando con luz UV durante 30 min y lavando con PBS (pH 7,4) posteriormente. Se dio un tratamiento con DMEM a los andamios antes de la siembra celular. Se añadieron 20 μL de suspensión celular gota a gota a cada andamio y a una película plástica que servía como control. Los andamios se mantuvieron en reposo en atmósfera humidificada (37 °C, 5% CO₂) durante 30 min. Luego, los andamios se incubaron en DMEM durante 21 días con renovación regular del medio cada dos días.

Ensayo de adhesión celular

Para evaluar la capacidad de adhesión de las células al andamio, se contaron el número de células no adheridas después de 1, 3 y 6 h de la siembra inicial según el método en la literatura con ligeras modificaciones [6]. Se recogió el medio celular y el recuento celular se realizó con un hemocitómetro. La diferencia entre el recuento de siembra inicial y el número de células no adheridas se consideró como el número de células adheridas. Los resultados se expresaron en términos de porcentaje de adhesión según la siguiente ecuación:

$$ \%\mathrm{Adhesión}=\frac{\mathrm{Siembra\ inicial}-\mathrm{número\ de\ células\ no\ adherentes}}{\mathrm{Siembra\ inicial}}\times 100 $$

Ensayo de citotoxicidad

Para medir el efecto tóxico de las matrices nanofibrosas, se realizó el ensayo MTT. Después del período de tiempo respectivo, los constructos se incubaron en solución MTT (solución stock 1 mg mL⁻¹ diluida en PBS (pH 7,4) en proporción 1:10) e incubaron durante 4 h. Las células viables convierten MTT en sal de formazán durante este período de incubación. La sal de formazán se disolvió con la adición de DMSO y se mantuvo aparte durante 20 min. La absorbancia originada por la sal de formazán se midió cuantitativamente registrando cambios en la absorbancia a 570 nm usando un lector de microplacas.

Ensayo de proliferación celular

Se realizó el ensayo de reducción de colorante Alamar blue (AB) para determinar la proliferación de células dentro del andamio. Los andamios se incubaron en colorante diluido con DMEM durante 4 h, y la reducción del colorante se midió espectrofotométricamente. El porcentaje de reducción de AB se calculó como:

$$ \%\mathrm{Reducción\ AB}=\left[\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_2\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_1\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_1\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_2\right)/\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_1\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_2\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_2\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_1\right)\right]\times 100 $$

donde, ελ ₁ = coeficiente de extinción molar de alamar blue a 570 nm y ελ ₂ = coeficiente de extinción molar de alamar blue a 600 nm, en formas oxidada (ε _ox) y reducida (ε _red). Aλ ₁ y Aλ ₂ denotan la absorbancia de los pozos de prueba.

A’λ ₁ = absorbancia del pozo de control negativo a 570 nm.

A’λ ₂ = absorbancia del pozo de control negativo a 600 nm.

Ensayo ALP

La producción de fosfatasa alcalina (ALP) por hMSC cultivadas dentro del andamio se midió según el protocolo del fabricante en el kit [12]. Brevemente, PBS estéril (pH 7,4) se usó en el lavado e incubación de andamios, seguido de homogeneización con 1 mL tampón Tris (1 M, pH 8,0), y sonicación durante 3 min en hielo. 25 μL del lisado se incubaron luego con 1 mL de solución de p-nitrofenil fosfato (16 mM) a 30 °C durante 5 min. Se realizaron mediciones espectrofotométricas a 405 nm para monitorear la producción de p-nitrofenol en presencia de ALP.

Actividad ALP in vivo

Se tomaron nueve ratas nu/nu macho, de 100–120 g cada una, y se disecaron bilateralmente en los músculos abdominales para crear bolsas. Se utilizó un modelo de ratón nu/nu para demostrar el potencial osteoinductivo del andamio in vivo. Uno de cada uno de los tres tipos de andamios (5 mm × 5 mm) se cortó y empaquetó en las bolsas musculares por separado. La bolsa se cerró luego con sutura no absorbible. Después de 14 días de la operación, los implantes se recuperaron extirpando los músculos rectos abdominales y se mantuvieron en PBS. Se extirparon los colgajos musculares, y se obtuvo el tejido de explante que se homogeneizó en tampón de extracción para liberar fosfatasa alcalina. Se usó 50 μL de alícuota de solución para la medición de la actividad ALP.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron en triplicado, y los datos presentados se formatearon como media ± desviación estándar (DE) de las muestras, salvo mención. Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) usando el software estadístico Origin 6.0, para evaluar diferencias inciertas y significativas. Un valor P de 0,05 o menos significa diferencias significativas entre los grupos de estudio.

Resultados

Morfología del andamio

Las imágenes de MEB (Fig. 1) del andamio fabricado revelaron una estructura nanofibrosa finamente hilada. Los diámetros promedio de fibras en andamios FS y FS+BMP2 parecen ser similares, variando de 100 a 900 nm, a todas las concentraciones, ya que el diámetro es función del tiempo de electrohilado [13], mientras que las nanofibras de FS fueron uniformes, y la conjugación con BMP2 llevó a no uniformidad en el diámetro de fibra. El tamaño de poro de los andamios parece ser homogéneo en los andamios fabricados y se encontró independiente de la concentración de fibroína. La concentración de FS no afecta significativamente el tamaño de poro [11].

Propiedades mecánicas del andamio

Las curvas tensión-deformación de los andamios nanofibrosos se representan en la Fig. 2. Se observó que la adición de BMP no altera las propiedades mecánicas del andamio de FS, pero con el aumento de la concentración del material de fabricación (FS), la propiedad tensil de las matrices mejoró. Puede deberse a la formación de enlaces interfibra durante la reticulación. Las fibras de FS de baja concentración no exhibieron mejor resistencia mecánica en comparación con las de mayor concentración.

Estudio de hinchamiento

Las relaciones de hinchamiento en función del tiempo para los andamios se representaron en la Fig. 3. Los andamios se hincharon bien con el tiempo uniformemente al principio y alcanzaron el equilibrio en alrededor de 380 min. Las fibras enlazadas a rhBMP-2 absorbieron más agua en comparación con los andamios solo de FS, sugiriendo el aumento de bolsas hidrofílicas debido a la asociación de BMP-2. Las fibras de FS equilibraron en ~70% mientras que las fibras que contenían BMP-2 equilibraron en ~81% de agua.

Ensayo de adhesión celular

La adhesión de células al andamio es requerida para el crecimiento celular e inducción a la diferenciación. En este estudio, observamos que las hMSCs se adhirieron bien a los andamios, y la adhesión de hMSC a los andamios 4FS-BMP2, SF-BMP2 y FS se representó en la Fig. 4.

Existía la preocupación de una pérdida en la adhesión en el andamio mezclado, lo cual se descartó con los resultados observados. La mezcla con BMP2 no disminuye la capacidad de adhesión del andamio. Como es evidente de la Fig. 3, se entendió bien que con un aumento en el tamaño de poro (disminución en la concentración de FS), la adhesión de células al andamio aumenta. El ANOVA entre las tres formulaciones diferencia significativamente las variaciones en la 3ª y 6ª hora. Sin embargo, no se observó diferencia significativa en la 1ª hora.

Ensayo de citotoxicidad y proliferación celular

La viabilidad celular aumentó significativamente en los andamios conjugados con rhBMP-2, y los andamios construidos no crean efectos citotóxicos a las células huésped (Fig. 4), y las células proliferaron bien en todos los andamios comparativamente (Fig. 5). Hubo una tendencia creciente en la viabilidad con el número de días, y el andamio FS+BMP2 exhibió la menor toxicidad en cada punto de tiempo. El ANOVA reveló diferencia significativa entre los valores de viabilidad celular de las tres formulaciones.

De la Fig. 6, se puede examinar la proliferación celular. Las células proliferaron bien en las tres preparaciones de andamios, siendo la mejor en FS+BMP2 en cada punto de tiempo. Los poros más grandes en el andamio FS + BMP2 proporcionaban el máximo espacio para el crecimiento celular. La significancia de las diferencias entre los grupos se estableció bien mediante ANOVA.

Ensayo ALP

La actividad ALP es un marcador estándar de la propiedad osteoinductiva del ambiente alrededor de la célula [13]. En nuestro experimento, observamos una mayor actividad ALP en los constructos FS+BMP2 en comparación con los constructos solo de FS (Fig. 7). Los andamios nanoestructurados de FS fueron capaces de exhibir osteoinducción por sí mismos, pero como es evidente de la Fig. 7 y ANOVA, el andamio FS+BMP2 resultó ser el mejor entre los andamios en cuestión. La concentración de ALP aumentó en el transcurso del tiempo del experimento, y los constructos con mayor concentración de FS, sin embargo, exhibieron menor actividad ALP en comparación con constructos con menor concentración de FS.

Actividad ALP in vivo

La Fig. 8 muestra la actividad ALP de explantes para (a) FS, (b) FS+rhBMP-2, y (c) 4FS+rhBMP-2. Como se esperaba, los explantes del tratamiento que contenía rhBMP-2 indujeron mayor actividad ALP, mientras que los ratones tratados con andamio libre de rhBMP-2 produjeron menor actividad ALP.

Discusión

La ingeniería de tejidos basada en andamios ha demostrado su potencial en medicina regenerativa y ha presenciado un progreso impresionante como herramienta para ITO. Estudios previos han establecido el papel crucial de la microarquitectura y propiedades físicas de las estructuras en la traducción de constructos célula-andamio diseñados in vitro en tejido óseo [14,15,16].

Las propiedades mecánicas óptimas (tamaño de poro, resistencia a la tracción, etc.) y biocompatibilidad de los constructos son características potenciales a considerar para la colonización y organización celular [17]. El trabajo presentado describe la fabricación y caracterización de andamio para ingeniería de tejido óseo utilizando la combinación de propiedades beneficiosas de materiales propuestos para lo mismo. Mientras que la FS proporciona una plataforma adecuadamente fuerte y biocompatible, el rhBMP-2 incrustado induce la formación de nuevos osteocitos. La FS está siendo ampliamente estudiada por varios grupos en diferentes formulaciones para proliferación de células osteoblásticas [18] y regeneración de tejidos incluyendo ligamento, tendón, cartílago, hueso, hígado, piel, tráquea, córnea, nervio, tímpano y vejiga [19, 20].

Hemos usado soluciones acuosas de FS y FS+rBMP-2 para nuestro estudio ya que las soluciones acuosas son preferidas sobre solventes orgánicos para la preparación de soluciones de FS, ya que la degradación de FS es desfavorable en soluciones orgánicas [18]. Las fibras electrohiladas de FS se reportaron previamente con estructura homogénea de fibras con diámetro uniforme, y la malla es altamente porosa con poros interconectados y cruzados, lo cual está de acuerdo con nuestro estudio [21, 22]. No se observó formación de estructuras tipo cuentas en fibras de FS en nuestros andamios ni en los reportados previamente [21]. El diámetro de la fibra pura de FS se reportó previamente que disminuye con el aumento de la mezcla [11, 21]; sin embargo, no observamos pérdida de diámetro debido a la mezcla. Pero la uniformidad de la fibra se vio perturbada en fibras mezcladas posiblemente debido a la asociación desigual de rBMP-2 sobre las fibras de FS.

Una resistencia mecánica amplia es una propiedad esencial para un andamio de tejido. La mezcla de FS pura aumentó la flexibilidad de la nanofibra en nuestro experimento, y reportes previos también revelaron una tendencia similar en la mejora de propiedades mecánicas al mezclar FS con otros materiales para producir biomateriales mezclados utilizables [21, 23]. Por lo tanto, nuestro andamio fabricado posee la resistencia mecánica y flexibilidad esenciales requeridas en aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Los andamios para ingeniería de tejidos deben ser capaces de adherir células sobre ellos, facilitar la proliferación celular y osteoinducción, y ser lo menos citotóxicos posible para una mejor aceptabilidad. Reportes previos sobre andamios de FS han establecido sus actividades no citotóxicas y proliferativas [21, 24], y nuestros estudios estuvieron de acuerdo con los resultados reportados previamente.

Debido a sus propiedades osteoinductivas, el rhBMP-2 se está utilizando en ingeniería de tejido óseo por varios grupos [25,26,27]. Estos estudios han revelado que las células cultivadas sobre andamios que contienen BMP-2 poseen mayor actividad ALP, un biomarcador de osteoinducción. El efecto de la asociación de BMP-2 se contrastó mejor a medida que progresaba el tiempo de incubación. Kim et al. utilizaron microesferas porosas asociadas a BMP-2 y observaron una mejora similar en la osteoinducción [25].

Conclusiones

Fabricamos exitosamente andamios fibrosos basados en FS que contienen rhBMP-2. Estos andamios eran homogéneos y se encontró que tienen propiedades mecánicas adecuadas y biocompatibilidad. Además, la asociación de rhBMP-2 atribuyó el potencial osteoinductivo de los andamios fabricados. Los andamios se evaluaron además para aplicaciones in vivo y se encontró que son adecuados para aplicaciones que involucran ingeniería de tejido óseo.

Abreviaturas

ALP:

Fosfatasa alcalina

BTE:

Ingeniería de tejido óseo

hMSCs:

Células madre mesenquimales humanas

rhBMP2:

Proteína morfogenética ósea recombinante humana-2

SF:

Fibroína de seda