Evaluación de la bioseguridad y eficacia antibacteriana de grafeno y óxido de grafeno para aplicaciones en implantes ortopédicos

Resumen

Las nanopartículas de grafeno (G) y óxido de grafeno (GO) son modificadores prometedores para superficies de implantes ortopédicos, sin embargo, sus perfiles de seguridad y antimicrobianos permanecen incompletamente definidos. Evaluamos citotoxicidad in vitro en células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs) y biocompatibilidad in vivo por implante intramuscular en ratones. Los resultados identificaron 10 µg/mL como umbral por debajo del cual G y GO exhiben citotoxicidad mínima. Concentraciones por encima de este valor indujeron muerte celular dependiente de la dosis, siendo GO más tóxico que G. Ensayos antimicrobianos contra Staphylococcus aureus revelaron que G solo inhibe el crecimiento bacteriano a ≥100 µg/mL, mientras que GO muestra actividad antibacteriana significativa a ≥50 µg/mL. El rango 50–100 µg/mL parece óptimo, equilibrando baja citotoxicidad con eficacia antibacteriana robusta, apoyando la traducción clínica dentro de esta ventana de dosificación.

Introducción

Los implantes ortopédicos deben combinar excelente bioseguridad con control efectivo de infecciones, particularmente contra S. aureus, el patógeno más frecuente en infecciones relacionadas con implantes. Las terapias convencionales a menudo fallan, llevando a curación prolongada o amputación. La nanotecnología ofrece nuevas vías; el grafeno y sus derivados, con su red de carbono bidimensional, poseen propiedades mecánicas, eléctricas y químicas únicas que pueden aprovecharse para regeneración ósea y acción antibacteriana.

Los bordes afilados del grafeno pueden disrumpir físicamente membranas bacterianas, mientras que mecanismos de transferencia de carga inhiben la proliferación bacteriana. El GO, funcionalizado con grupos oxígeno, mejora la dispersión y puede servir como transportador de fármacos, agente de imagen o superficie antimicrobiana. Sin embargo, la misma nanoestructura que confiere beneficios terapéuticos también puede elicitar toxicidad celular, especialmente a dosis altas o por formación de corona proteica.

Estudios previos han reportado umbrales citotóxicos contradictorios para G y GO. Mientras algunos datos sugieren G es relativamente benigno, GO a menudo muestra mayor toxicidad hacia células mamíferas, potencialmente debido a su química de superficie. Clarificar estas relaciones dosis-respuesta es esencial para despliegue clínico seguro.

Resultados

Citotoxicidad in vitro de G y GO

La microscopía electrónica de transmisión reveló láminas irregulares de G y GO promediando 30 ± 5,6 nm, con aglomerados ocasionales (Figura 1a–b). Tras 7 días de co-cultivo, BMSCs mantuvieron morfología fusiforme; la diferenciación osteogénica y adipogénica confirmó multipotencia (Figura 1c–e).

La viabilidad celular disminuyó de manera dependiente de la dosis una vez que las concentraciones superaron 10 µg/mL. GO exhibió mayor citotoxicidad que G a dosis equivalentes, con la disparidad ampliándose a concentraciones más altas (Figura 1f). La microscopía electrónica de barrido corroboró estos hallazgos: a 10 µg/mL, BMSCs se adhirieron y extendieron normalmente; a 50 µg/mL G, las células se encogieron y mostraron secreción superficial aumentada; a 50 µg/mL GO, las células estaban marcadamente deformadas y mayormente no viables (Figura 2).

La microscopía electrónica de transmisión confirmó la internalización de tanto G como GO. A concentraciones superiores a 50 µg/mL, GO indujo disrupción intracelular pronunciada, incluyendo orgánulos desordenados y pérdida de microvellosidades (Figura 3).

Colectivamente, 10 µg/mL se identificó como umbral crítico de seguridad; GO mostró mayor toxicidad celular más allá de este nivel.

Citotoxicidad in vivo

El tejido muscular implantado con G preservó arquitectura normal, con miofibrillas paralelas y núcleos intactos (Figura 4a–b). En contraste, el tejido tratado con GO exhibió líneas transversales fracturadas y signos de atrofia y necrosis, indicando mayor toxicidad in vivo (Figura 4c).

Propiedades antibacterianas

In vitro

La imagen bioluminiscente de Staphylococcus aureus (Xen-29) demostró inhibición dependiente de la dosis por tanto G como GO. G requirió ≥100 µg/mL para reducción significativa; GO logró inhibición a ≥50 µg/mL. Las curvas de intensidad de fotones (PI) confirmaron acción antibacteriana más fuerte de GO (Figura 5).

In vivo

En músculo de ratón, GO a 100 µg/mL produjo PI marcadamente menor a 0 y 24 h, mientras que G no difirió significativamente del control (Figura 6). Así, GO retuvo eficacia antibacteriana robusta in vivo, mientras que el efecto de G fue insignificante a esta dosis.

Discusión

El estudio confirma que tanto G como GO exhiben citotoxicidad dependiente de la dosis hacia BMSCs y músculo esquelético, con GO consistentemente más tóxico. La actividad antibacteriana también sigue respuesta de dosis, con GO superando a G en ambos entornos in vitro e in vivo. La ventana 50–100 µg/mL parece equilibrar citotoxicidad mínima con acción antibacteriana significativa, haciéndola un rango objetivo prometedor para modificación de superficie de implantes.

Insights mecanísticos sugieren que los bordes afilados de G y propiedades de transferencia de carga disrumpan membranas bacterianas, mientras que los grupos oxígeno de superficie de GO facilitan interacciones más fuertes con células microbianas y posiblemente induzcan producción de especies reactivas de oxígeno. La mayor toxicidad mamífera de GO puede derivar de formación de corona proteica y estrés oxidativo, subrayando la necesidad de modificaciones de superficie que mitiguen efectos adversos sin comprometer función antimicrobiana.

Trabajos futuros deberían explorar funcionalización de GO para reducir citotoxicidad, evaluar biodegradación a largo plazo y evaluar efectos en otros tejidos. Entender la interacción entre atributos fisicoquímicos y respuestas biológicas será crucial para avanzar nanomedicinas basadas en G y GO.

Métodos

Animales

Ratas Sprague-Dawley macho (4 semanas) proveyeron BMSCs; ratones Balb/C macho se usaron para estudios de implante. Todos los procedimientos cumplieron directrices institucionales de cuidado animal.

Preparación de grafeno y óxido de grafeno

G y GO de origen comercial (1–2 capas) se dispersaron en etanol, PBS o suero salino, luego se ultrasonificaron 2 h para lograr solución madre de 1 mg/mL.

Cultivo celular y ensayos de citotoxicidad

BMSCs se expandieron a pasajes 3–5, luego se expusieron a 0, 10, 50, 100, 500 u 1000 µg/mL de G u GO durante 24 h. Ensayos AlamarBlue® cuantificaron actividad metabólica; SEM y TEM proporcionaron insights morfológicos.

Implantación in vivo

G u GO (10 µg/mL) se inyectaron en músculo femoral medial de ratones; tejidos se cosecharon tras 7 días para tinción HE.

Pruebas antibacterianas

S. aureus bioluminiscente (Xen-29) se cultivó a 10⁷ ufc/mL y co-trató con G u GO en los mismos rangos de concentración. La intensidad de fotones se registró a 0, 8 y 24 h (in vitro) y a 0 y 24 h (in vivo) usando sistema IVIS Lumina II.

Análisis de datos

Los resultados se expresan como media ± DE. Prueba t de Student y ANOVA de una vía evaluaron significancia estadística; p < 0,05 se consideró significativo.

Conclusiones

El grafeno y el óxido de grafeno demuestran efectos citotóxicos y antibacterianos dependientes de la dosis. La superior potencia antibacteriana de GO a 50–100 µg/mL, acoplada con toxicidad manejable, lo posiciona como fuerte candidato para recubrimientos de implantes ortopédicos, siempre que modificaciones de superficie puedan reducir aún más respuestas celulares adversas.