Bioseguridad y capacidad antibacteriana del grafeno y el óxido de grafeno in vitro e in vivo

Resumen

En los últimos años, se han comenzado a aplicar nanopartículas de grafeno (G) y óxido de grafeno (GO) en la modificación de la superficie de implantes quirúrgicos. Sin embargo, la bioseguridad y la capacidad antibacteriana de G y GO aún no están claras. En este estudio, se evaluó la bioseguridad de G y GO in vitro mediante cocultivo con células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) y se observó la bioseguridad in vivo mediante la implantación de materiales en tejido muscular de ratones. Los resultados de bioseguridad mostraron que 10 μg / ml era la concentración crítica de seguridad para G y GO. Cuando la concentración era superior a 10 μg / ml, la citotoxicidad de G y GO mostró una forma dependiente de la dosis.

Los resultados antibacterianos mostraron que G presentó la capacidad antibacteriana con una concentración igual y superior a 100 μg / ml; GO presentó la capacidad antibacteriana con la concentración igual y superior a 50 μg / ml. El efecto antibacteriano de G y GO fue de una manera dependiente de la dosis in vitro.

La concentración de GO o G entre 50 y 100 μg / ml puede ser el mejor rango para mantener el equilibrio de citotoxicidad y capacidad antibacteriana. Nuestro estudio revela que G y GO tienen potencial para usarse en la clínica con buenas propiedades de bioseguridad y antibacterianas en un cierto rango de concentración.

Antecedentes

En los últimos años, los implantes quirúrgicos se utilizan ampliamente para tratar fracturas óseas y otras enfermedades, pero el implante necesita buenas propiedades de bioseguridad y antibacterianas para evitar el rechazo y la infección. De hecho, el tratamiento ortopédico del defecto óseo infeccioso sigue siendo un problema importante. Sobre el aspecto de las bacterias, Staphylococcus aureus es el patógeno más común en ortopedia e implante ortopédico [1]. Debido a la infección y el defecto óseo [2], el tratamiento es difícil y los pacientes necesitan mucho tiempo para curarse. Si la herida no cicatriza, el último tratamiento es la amputación de una extremidad [3, 4].

Un buen tratamiento del defecto óseo infeccioso debe satisfacer simultáneamente tanto el control de infecciones como la reconstrucción de la solicitud de reparación del defecto óseo. Con el desarrollo de la ingeniería de tejidos óseos, se utilizan cada vez más aplicaciones de biomateriales en el campo del tratamiento ortopédico. La tasa de curación de la infección en los huesos puede, por tanto, mejorarse enormemente. Estos materiales incluyen principalmente hueso heterogéneo [5], biocerámicas [6] (como hidroxiapatita [7] y fosfato de calcio [8]), polímeros [9, 10], materiales proteicos (como fibras de colágeno [11]), y así. Junto a estos materiales, Beatriz Pelaz et al. reveló la importancia y las perspectivas prometedoras de la nanotecnología en los implantes [12]; entre estas nanopartículas, el grafeno y sus derivados son otros materiales novedosos para cumplir con los requisitos para la reparación ósea.

El grafeno es bidimensional, con una o pocas capas de átomos de carbono en una estructura de panal [13,14,15]. Es ampliamente utilizado en materiales compuestos [16, 17], sensores [18, 19], energía [16, 20] y otros campos debido a sus excelentes propiedades físicas. El óxido de grafeno es un material de grafeno funcionalizado en la superficie que se encuentra en una capa de átomos de carbono conectados con una extensión infinita bidimensional de los grupos tensioactivos de base que contienen oxígeno y su forma de óxido de grafeno [21]. El grafeno (G) y sus derivados han causado gran preocupación en el campo biomédico debido a su estructura bidimensional única, así como a sus propiedades físicas y químicas específicas [22]. El grafeno funcionalizado y sus derivados tienen muchas funciones, como la carga de fármacos [23], antibacteriano [24], bioimagen [25, 26] y terapia contra el cáncer [27].

Sobre el aspecto de la capacidad antimicrobiana, Li et al. revelaron que el mecanismo antimicrobiano G es causado principalmente por la transferencia de carga [28] y la migración bacteriana. Las bacterias se transfieren a la superficie de nanohojas afiladas, que laceran las bacterias por los bordes afilados [29]. Además, Tu et al. También demostró otro mecanismo antimicrobiano potencial que G puede penetrar en las células, lo que lleva a la extracción de grandes cantidades de fosfolípidos de las membranas celulares [30]. Así, el G y el óxido de grafeno (GO) tienen bioactividad y capacidad antimicrobiana, lo que cumple con los requisitos para ser calificados como materiales de reparación ósea.

Sin embargo, con la producción y aplicación a gran escala, los problemas de bioseguridad del grafeno son particularmente importantes. Los trabajadores pueden sufrir la exposición a nanopartículas (NP) a través de múltiples medios, incluida la inhalación, el contacto cutáneo y las vías gastroentéricas. Andrea Prodi y col. sugirió un enfoque escalonado para evaluar la exposición a NP para una mayor protección [31]. A excepción de la evaluación, la bioseguridad y la biocompatibilidad son otros puntos clave de la investigación. Kan Wang y col. demostraron la biocompatibilidad de la GO, que presenta toxicidad para las células de fibroblastos humanos cuando la dosis es inferior a 20 μg / ml, pero exhibe una citotoxicidad obvia cuando la dosis es superior a 50 μg / ml, con una disminución significativa de la adhesión celular [32]. En la actualidad, una visión más coherente confirma que G y GO tienen un efecto tóxico sobre las bacterias, pero en desacuerdo con el efecto tóxico sobre las células [33,34,35,36]. La función y la toxicidad de G y GO aún necesitan un estudio más específico. Beatriz Pelaz y col. planteó una pregunta, "cómo reducir los riesgos y aumentar los beneficios es vital para el desarrollo de nanomedicinas seguras y eficaces", que recuerda e insta al estudio hacia la combinación de los riesgos potenciales de G y GO y la capacidad antibacteriana in vivo e in vitro [12] .

Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) son células madre adultas multipotentes. Se han convertido en una fuente celular importante para reparar defectos óseos en la ingeniería de tejidos [37, 38]. Además, la interacción entre el grafeno y los derivados y las células madre aún carece de investigación [39, 40].

Por lo tanto, este estudio investigó el efecto de G y GO en BMSC en tejidos musculares de ratones in vitro, Staphylococcus aureus , con el objetivo de investigar la citotoxicidad y la capacidad antibacteriana de G y GO in vivo e in vitro y promover la investigación de la nanomedicina y la nanotoxicidad de nanomateriales de carbono.

Resultados

Citotoxicidad G y GO

Citotoxicidad G y GO in vitro

Al microscopio electrónico, las nanopartículas G o GO mostraron una forma irregular con un tamaño de 30,41 ± 5,59 nm y se pudo encontrar una aglomeración de partículas (Fig. 1a, b). Después de 7 días de cultivo, la morfología de la célula cambió a forma de huso (Fig. 1c). Los nódulos de calcio se formaron después del cultivo con medio de diferenciación osteogénica (Fig. 1d). La acumulación de aceite se formó después de la diferenciación adipogénica (Fig. 1e).

Citotoxicidad G y GO ( a , b). Imágenes TEM de G ( a ) y GO ( b ) mostró la nano-red formada. c Citomorfología de BMSC. d Rojo de alizarina para la deposición de calcio. e Aceite rojo O para lípidos. f Actividad celular después del tratamiento con G y GO, * P <0.01 con grupo de control, ^# P <0.01 con grupo de control, ^○ P <0.05 con el grupo G 50 μg / ml, ^{☆, □, △} P <0.01 con la misma concentración de grupo G. r 2 (G) =0,843, r 2 (PASO) =0,939. Barras de escala a , b 200 millas náuticas, c , d 100 micras, e 50 μm. r , coeficiente de correlación

Cuando la concentración fue superior a 10 μg / ml, G o GO inhibieron el crecimiento de BMSC. La citotoxicidad fue la más alta en el grupo de 1000 μg / ml y mostró la forma dependiente de la dosis. Cuando la concentración fue superior a 10 μg / ml, la citotoxicidad del grupo GO fue mayor que la del grupo G a la misma concentración. La diferencia fue más significativa al aumentar la concentración (Fig. 1f).

Bajo la observación de SEM, cuando la concentración de G o GO era de 10 μg / ml, las BMSC estaban en buenas condiciones con buena adherencia y forma. Cuando la concentración de G era superior a 50 μg / ml, se encontró que las células cambiaban, incluida la disminución del tamaño, el aumento de la secreción superficial y la extensión de las microvellosidades de la superficie celular. Cuando la concentración de GO era superior a 50 μg / ml, las BMSC se encontraban encogidas y deformadas y la mayoría de las células estaban muertas. Estos resultados indicaron que GO tenía una mayor citotoxicidad para las BMSC en comparación con G en la misma concentración (Fig. 2).

Imágenes SEM de cocultivo de G, GO y BMSC. un Grupo G, 10 μg / ml. Las celdas están en buen estado. b Grupo G, 50 μg / ml. El tamaño celular disminuye, la secreción superficial aumenta y las microvellosidades en la superficie celular se alargan. c Grupo GO, 50 μg / ml. Las BMSC se encogen y deforman. G grafeno, óxido de grafeno GO, BMSC

Bajo la observación de TEM, encontramos que G o GO podrían entrar en BMSC y depositarse en el interior de la celda. Y cuando la concentración era superior a 50 μg / ml, se encontraron cambios en el microambiente celular, incluido el trastorno de la estructura celular y el desorden de microvellosidades, lo que indica una mayor citotoxicidad de GO en comparación con el grupo G (Fig. 3).

Imágenes TEM de cocultivo de G, GO y BMSC. un Grupo G. b Vaya grupo. Tanto G como GO pueden provocar trastornos en la estructura celular y desorden de microvellosidades en la superficie celular; GO provoca cambios en el microambiente celular de alta citotoxicidad

Con base en el resultado de la observación de SEM y TEM, encontramos que 10 μg / ml era la concentración crítica de seguridad para G y GO. Cuando la concentración de GO fue superior a 10 μg / ml, GO tuvo una mayor citotoxicidad para las BMSC en comparación con G.

Citotoxicidad G y GO In Vivo

Para analizar la citotoxicidad de G y GO in vivo, seleccionamos tejido esquelético para representar y simular la circunstancia de trasplante local en ortopedia. El resultado de la tinción HE del tejido esquelético en el grupo de control y el grupo G presentó la estructura normal con miofibrillas musculares paralelas al eje vertical. En la sección transversal, la sección miofibrilar presentada como las manchas delgadas y el núcleo se ubicó en el borde de las células. Los cambios mencionados anteriormente también se pueden encontrar en las células esqueléticas normales, lo que indica que G tiene poca toxicidad para los tejidos musculares.

Por el contrario, en el grupo GO, las líneas transversales de las fibras musculares en la sección longitudinal estaban fracturadas y no eran claras, revelando la atrofia y necrosis del músculo. Por lo tanto, GO tuvo una mayor toxicidad para los animales (Fig. 4).

Secciones de tejido teñidas con tinción HE. un El control representa tejido sano. b Grupo G. Las células esqueléticas se presentan como una tira recta. Las miofibrillas musculares son paralelas a lo largo del eje largo, las líneas transversales son claras y la sección transversal son bloques irregulares. La sección miofibrilar se presenta como manchas delgadas; El núcleo se encuentra en el borde. c Vaya grupo. Las líneas transversales de las fibras musculares en la sección longitudinal están fracturadas y no son claras

Propiedades antibacterianas de G y GO

Capacidad antibacteriana in vitro

En el experimento de bacteriostasis in vitro, la intensidad del fotón del ROI de G o GO mostró una forma dependiente de la dosis. Y la intensidad de los fotones disminuyó a medida que aumentaba la concentración. En comparación con el grupo G a la misma concentración, el grupo GO tenía menor intensidad de fotones (Fig. 5).

Monitoreo de intensidad de bioluminiscencia de S . aureus in vitro. G y GO muestran una forma dependiente de la dosis en la capacidad antibacteriana in vitro. un Imagen de bioluminiscencia de Xen-29 in vitro después de 0, 8 y 24 h de incubación a 37 ° C, con variaciones de color que representan la intensidad de la luz (Bin M (8), FOV12, f1, 15 s). b PI =0 h, r 2 (GO-0 h) =0,924. c PI =8 h, r 2 (G-8 h) =0.584, r 2 (GO-8 h) =0,960. d PI =24 h, r 2 (G-24 h) =0,616, r 2 (GO-24 h) =0.943. * P <0.01 con grupo de control, ^# P <0.01 con grupo de control, ^{☆, □, △, ○} P <0.01 con la misma concentración de grupo G. r , coeficiente de correlación

A las 0, 8 y 24 h, cuando las concentraciones de G eran 100, 500 y 1000 μg / ml, G mostró la capacidad de inhibición del crecimiento de Xen-29 en comparación con el grupo de control. Sin embargo, la intensidad de los fotones en los grupos de 10 y 50 μg / ml no mostró diferencias significativas en comparación con el grupo de control.

Cuando las concentraciones de GO fueron 50, 100, 500 y 1000 μg / ml, a las 0, 8 y 24 h, GO mostró el efecto de inhibición del crecimiento hacia Xen-29. De manera similar, la intensidad de los fotones en los grupos de 10 y 50 μg / ml no mostró diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de control.

Los resultados mostraron que el G presentó la capacidad antibacteriana con la concentración de más de 100 μg / ml, y el GO presentó la capacidad antibacteriana con la concentración de más de 50 μg / ml. La capacidad antibacteriana de G o GO dependía de la dosis. GO tenía una capacidad antibacteriana más fuerte en comparación con G a la misma concentración.

Capacidad antibacteriana en vivo

En el experimento de bacteriostasis in vivo, el grupo GO mostró un valor de intensidad de fotones (PI) significativamente menor a las 0 y 24 h. El valor de PI disminuyó en comparación con el grupo G y el grupo de control. Sin embargo, el valor de PI del grupo G no fue estadísticamente significativamente diferente en comparación con el grupo de control (Fig. 6). Los resultados mostraron que GO mostró una fuerte capacidad antibacteriana, pero G no mostró una capacidad antibacteriana obvia in vivo a la concentración de 100 μg / ml.

Monitoreo de intensidad de bioluminiscencia de S . aureus en vivo. GO muestra una forma dependiente de la dosis en la capacidad antibacteriana in vivo. un Imagen de bioluminiscencia de Xen-29 in vivo después de 0 y 24 h de incubación, con variaciones en el color que representan la intensidad de la luz (Bin M (8), FOV12, f1, 60 s). b PI =0 h, ^# P <0.01 con grupo control. c PI =24 h, ^# P <0.01 con grupo de control

Discusión

Con el desarrollo de la ingeniería de tejidos, se utilizan cada vez más aplicaciones de biomateriales en el campo del tratamiento ortopédico [41]. Es necesaria una buena bioseguridad para los biomateriales. G y GO se han utilizado ampliamente en el campo médico por su seguridad y propiedades físicas y químicas únicas. En el aspecto de la capacidad antibacteriana, G y GO son las buenas sustancias antibacterianas. Los principales mecanismos antibacterianos son la transferencia de carga [28, 29] y la penetración en las células [30]. Por lo tanto, la capacidad antibacteriana de G y GO podría cumplir con los requisitos de los materiales de reparación ósea por debajo de los rangos seguros.

En este estudio, para identificar las propiedades de bioseguridad, observamos el efecto citotóxico de G y GO hacia las BMSC a través de SEM y TEM, y este efecto se presentó como una forma dependiente de la dosis. Además, GO tuvo un mayor efecto citotóxico. En el aspecto de las propiedades antibacterianas, observamos además que G y GO tenían propiedades antibacterianas como una forma dependiente de la dosis, y el efecto GO fue significativamente mejor que G in vivo. En conclusión, la concentración en el rango de 50 ~ 100 μg / ml puede ser mejor para mantener el equilibrio entre el efecto citotóxico menor y la mayor capacidad antibacteriana.

Esta investigación demostró que tanto G como GO presentan el efecto citotóxico hacia las BMSC y las células esqueléticas y la toxicidad del GO es mayor que G. Un gran número de estudios han demostrado la toxicidad de las nanoceldas G y sus propiedades físicas y químicas del material (como tamaño, forma y grupos funcionales de superficie) hacia las células [35, 42, 43]. Además, los investigadores encontraron que el G prístino puede inducir citotoxicidad a través del agotamiento del potencial de membrana mitocondrial (MMP) y el aumento de especies reactivas de oxígeno intracelular (ROS) [12], por lo tanto desencadenando apoptosis por activación de la vía mitocondrial [34, 44] . Pero el fenómeno de que la citotoxicidad de GO es mayor que G puede estar asociado con los grupos contenidos en la superficie de GO [45]. Los investigadores han descubierto que la citotoxicidad de GO se relaciona directamente con el contenido de suero. Hu W y col. demostraron que GO tiene una fuerte capacidad de adsorción que podría adsorber proteínas séricas para formar inclusiones de proteínas [46], lo que demuestra la mayor citotóxica básica de GO en comparación con G. Nuestros experimentos confirmaron las conclusiones mencionadas anteriormente. Además, la toxicidad animal es otro indicador importante de la evaluación de la seguridad biológica de G y GO. En este estudio, se encontró una respuesta patológica grave en los tejidos musculares en el grupo GO, lo que indica su mayor toxicidad en comparación con el grupo G.

En segundo lugar, las propiedades antibacterianas están en consonancia con los cambios de dosis de G y GO; Una concentración de 50 ~ 100 μg / ml de GO podría equilibrar mejor la toxicidad biológica y la capacidad antibacteriana. Nuestros estudios demostraron que tanto la toxicidad biológica como la capacidad antibacteriana se presentan de forma dependiente de la dosis. Por lo tanto, algún rango de concentración puede mantener el equilibrio de toxicidad biológica menor y mayor capacidad antibacteriana.

Los resultados mostraron que tanto G como GO tenían cierta toxicidad biológica hacia BMSC y tejidos musculares, pero en el grupo GO, la capacidad antibacteriana fue significativa in vivo. Con base en los resultados previos de toxicidad de G y GO, encontramos que la concentración de 50 ~ 100 μg / ml puede ser la mejor para mantener el equilibrio de toxicidad biológica menor y mayor capacidad antibacteriana, proporcionando así nuevas pruebas de bioseguridad y antibacterias. capacidad de G y GO in vivo e in vitro en trabajo clínico.

Aunque GO tiene mucho efecto tóxico, la toxicidad puede evitarse mediante modificaciones de GO [47, 48]. Al mismo tiempo, los materiales GO modificados pueden degradarse y eliminarse en el cuerpo [49]; por lo tanto, se insta a una nueva dirección de investigación de la modificación para GO. Además, los efectos de G y GO sobre otros órganos o tejidos importantes aún necesitan más investigación para llegar a la medicina del holismo. Mientras tanto, es necesario estudiar más a fondo si la GO causa daño por estrés oxidativo a las bacterias y la presencia de un mecanismo antibacteriano adicional. Antes de la aplicación a la ingeniería de tejidos, los mecanismos de toxicidad de G y GO y las formas modificadas para reducir la toxicidad aún necesitan más aclaraciones.

Métodos

Animales

Se adquirieron ratas macho Sprague-Dawley (SD) y ratones macho Balb / C del Instituto Pasteur de Irán y se mantuvieron en condiciones de luz / oscuridad de 12 horas a 25ºC. Se utilizaron ratas SD a la edad de 4 semanas para el aislamiento de las BMSC. Se utilizaron ratones Balb / C para experimentos con animales in vivo. Todos los animales fueron criados en el Centro de Animales de Laboratorio de la Cuarta Universidad Médica Militar, y las operaciones siguieron el Estándar de Cirugía Experimental Animal del Hospital Xijing. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar.

Grafeno y óxido de grafeno

G o GO (capas 1 a 2) (Hengqiu Graphene Technology, China) se agregaron respectivamente en etanol absoluto (utilizado para la prueba de microscopio electrónico de transmisión, TEM), tampón PBS (utilizado para experimentos celulares in vitro) y solución salina (utilizada para experimentos con animales in vivo) para preparar la solución G o GO (el resultado de la prueba de espectroscopía Raman fue proporcionado por Hengqiu Graphene Technology). La concentración inicial de la solución de G o GO fue de 1 mg / ml. La solución G o GO se dispersó mediante ultrasonidos 2 h antes de los experimentos.

Citotoxicidad

Cultivo celular

El medio de cultivo celular contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco, Carlsbad, California, EE. UU.), DMEM / F12 (Corning, NY, EE. UU.), 100 U / ml de penicilina y 100 U / ml de estreptomicina (Sigma, St. Louis, EE. UU.). Misuri, Estados Unidos). Se extrajeron BMSC de ratas macho de 4 semanas de edad mediante el método de cultivo de médula ósea [50]. Después de la ejecución de la rata, se extrajeron el fémur y la tibia en condiciones asépticas. La cavidad medular se lavó con medio de cultivo celular; luego, la mezcla se centrifugó a 1500 rpm durante 10 min para recoger la médula ósea. La médula ósea se resuspendió con medio de cultivo celular y se inoculó en frascos de cultivo celular recubiertos de gelatina a 37ºC y en una incubadora de células con dióxido de carbono al 5%. El medio de los frascos de cultivo celular se cambió después de 48 horas y se eliminaron las células no adherentes; luego, el medio de cultivo se cambió una vez cada 48 h. Se utilizaron células del tercer al quinto pasaje para los siguientes experimentos.

La diferenciación osteogénica y la diferenciación adipogénica en BMSC se llevaron a cabo con medio de diferenciación (Cyagen, CA, EE. UU.). Después de 2 semanas de inducción de la diferenciación, las células se fijaron con una solución de formaldehído al 4% durante 30 min; luego, se realizaron tinción con rojo de alizarina para diferenciación osteogénica y tinción con rojo aceite para diferenciación adipogénica.

Actividad de celda

La concentración de la suspensión de BMSC se ajustó a 5 x 10 ⁴ / ly las células se cultivaron en una placa de 96 agujeros con 100 µl en cada agujero. Después de 24 h, el medio se reemplazó con medio de cultivo celular que contenía G o GO con las concentraciones de 0 (como grupo de control), 10, 50, 100, 500 y 1000 μg / ml. Después de 24 h de cultivo, se añadieron 10 μl de alamarBlue (Bio-rad, Hercules, CA, EE. UU.) En cada orificio para un cultivo de 4 h más. Se utilizó una microplaca (Bio-rad, Hercules, CA, EE. UU.) Para detectar los valores de DO (densidad óptica) a 570 y 600 nm, y luego, se utilizó la calculadora colorimétrica alamarBlue® (Bio-rad, Hercules, California, EE. UU.) Para evaluar la tasa de proliferación celular.

Caracterización mediante SEM

Las BMSC se sembraron en una placa de vidrio delgada de 24 orificios con un grosor de 0,17 mm y un diámetro de 14 mm. Después de 24 h de cultivo, el medio se reemplazó con medio de cultivo celular que contenía G o GO con las concentraciones de 0 (como grupo de control), 10, 50, 100, 500 y 1000 μg / ml. Las células se siguieron cultivando durante 24 horas y después se eliminó el sobrenadante. Las células se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5% durante 24 h. Luego, las células se observaron mediante microscopio electrónico de barrido (Hitachi S-4800 SEM, JPN) después de la deshidratación y el dorado.

Caracterización mediante TEM

La suspensión de G y GO se ajustaron a 50 µg / ml. Las células se cultivaron conjuntamente con G o GO durante 24 hy luego se digirieron con tripsina al 0,25%. El sobrenadante se eliminó después de centrifugar a 1000 rpm durante 10 min. Las células se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5% durante 24 hy se observaron cortes mediante microscopía electrónica de transmisión (FEI Tecnai G2 TEM, EE. UU.).

Toxicidad e identificación del tejido muscular

Para analizar la citotoxicidad de G y GO in vivo, seleccionamos tejido esquelético para representar y simular la circunstancia de trasplante local en ortopedia. G o GO se inyectaron respectivamente en los tejidos del músculo femoral medial de ratones Balb / C. Los ratones se sacrificaron después de 7 días y los tejidos musculares inyectados con G o GO se fijaron con una solución de formaldehído neutro al 10% durante 24 h. Después de la deshidratación con alcohol, el tejido se envolvió en parafina y se cortó en rodajas para realizar la tinción con hematoxilina y eosina (HE). Los cortes se observaron bajo microscopio invertido (microscopio invertido Leica DMI6000B, RBT).

Capacidad antibacteriana

Cultivo bacteriano

Seleccionamos Xen-29 para cultivo por su reacción luminiscente. Xen-29 era una bacteria bioluminiscente de Staphylococcus aureus (Caliper, LS, EE. UU.) Derivado de ATCC-12600. Las bacterias se cultivaron en medio Luria Bertani (LB, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) Que contenía 200 μg / ml de kanamicina (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) A 37 ° C. Se tomó una sola colonia en caldo LB a 37 ° C con agitación durante 2-3 h a una velocidad de 200 rpm. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,5 (aproximadamente equivalente a 1,44 × 108 ufc / ml) en comparación con la absorbancia en blanco de caldo LB, las bacterias se utilizaron para el siguiente experimento.

Imágenes bioluminiscentes

Para presentar imágenes bioluminiscentes, utilizamos el sistema de imágenes macroscópicas ópticas CCD refrigerado IVIS Lumina II (Caliper, LS, EE. UU.). La señal bioluminiscente bacteriana se convirtió en intensidad de fotón (PI). Se utilizó el software Living Image® 4.2 (Caliper, LS, EE. UU.) Para la cuantificación de PI en regiones de interés (ROI). Para evitar el movimiento de los ratones en el proceso de obtención de imágenes, los ratones fueron anestesiados para evitar la inestabilidad de la señal recibida.

Capacidad antibacteriana in vitro

Se agregó Xen-29 en la placa de 24 orificios y la concentración en cada orificio fue 10 ⁷ ufc. Luego, se añadió suspensión G o GO para ajustar la concentración a 0 (control), 10, 50, 100, 500 y 1000 μg / ml. El volumen constante en cada orificio fue de 500 µl. Para analizar la capacidad antibacteriana de G y GO, se midió secuencialmente el PI bacteriano en el ROI a las 0, 8 y 24 h después de la intervención.

Capacidad antibacteriana en vivo

En base a los resultados del experimento anterior, se eligió un grupo de 100 μg / ml para identificar la capacidad antibacteriana. Se inyectó suspensión de Xen-29 (200 µl) en los tejidos del músculo femoral medial de ratones Balb / C. Se detectó PI de ROI en 0 y 24 h después de la operación.

Análisis de datos

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar (DE). t del estudiante Se utilizó la prueba para la comparación entre G y GO con la misma concentración. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar las diferencias entre G y GO con diferente concentración, respectivamente. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Conclusiones

En conclusión, G y GO tienen algún efecto citotóxico biológico con la forma dependiente de la dosis. G y GO tienen propiedades antibacterianas y funcionan también como la forma dependiente de la dosis; las propiedades antibacterianas de GO son significativamente mejores que las de G in vivo. La concentración de 50 ~ 100 μg / ml puede ser mejor para mantener el equilibrio de toxicidad biológica menor y mayor capacidad antibacteriana. Además, las modificaciones de GO para reducir la toxicidad deben aclararse para contribuir a las aplicaciones de G y GO en nanomedicina.

Abreviaturas

BMSC:: Células madre mesenquimales de la médula ósea
G:: Grafeno
GO:: Óxido de grafeno
HE:: Hematoxilina y eosina
LB:: Mediana Luria Bertani
NP:: Nanopartículas
PI:: Intensidad de fotones
ROS:: Especies reactivas de oxígeno
SEM:: Microscopio electrónico de barrido
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión

Nuevas nanopartículas de Au Nanostars @ PEG biocompatibles para la obtención de imágenes de TC in vivo y las propiedades de depuración renal Efectos del espesor de la bicapa en las propiedades morfológicas, ópticas y eléctricas de los nanolaminados de Al2O3 / ZnO

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias