Un escrutinio comparativo in vivo de nanopartículas de óxido de zinc y cobre biosintetizadas por vías de administración intraperitoneal e intravenosa en ratas

Resultados y discusión

La síntesis de Bio-CuNP y Bio-ZnONP se llevó a cabo mediante un método enzimático extracelular durante la exposición de los reactivos a Enterococcus faecalis flotante. El análisis FeSEM de Bio-CuNP y Bio-ZnONP se puede ver con un tamaño que varía de 1 a 100 nm en distribución (archivo adicional 1). El análisis TEM informa la presencia de CuNP y ZnONP biosintetizados con morfología de capa central de tamaño de 12 a 90 nm y forma esférica para CuNP [31] y ZnONP de 16 a 96 nm [32] (archivo adicional 2).

Se investigó la evaluación de Bio-Cu y ZnONP en ratas wistar macho sin signos de mortalidad tras el tratamiento con NP. Además, después del tratamiento y hasta el final de la duración del experimento, se controló el examen frecuente de heces blancas después de la administración i / v de Bio-CuNP en dosis de 9,5 a 11,5 μg / kg. Entre la tercera y la cuarta semana, las ratas tratadas con Bio-CuNPs mostraron un aumento significativo en el consumo de alimento y agua para i / v fue de 9.5 μg / kg (IC ₅₀ ) y 11,5 μg / kg (TLC), mientras que para la vía i / p (rango de dosis:24,8 a 30,3 μg / kg) y el grupo control ratas de la 3a a la 4a semana. En las Tablas 3 y 4 se muestra la administración de Bio-CuNP y Bio-ZnONP. La reducción y el aumento del peso corporal son indicadores valiosos para evaluar la toxicidad de una muestra de ensayo [37]. Informes previos evidenciados en estudios de toxicidad sobre NP de oro de 13,5 nm [33] y plata de 100 nm [38], el efecto sobre el peso corporal por inyección i / v fue menor que i / py la administración oral. Según Rhiouani et al. , la baja disminución de peso después de 4 días de tratamiento en todos los grupos tratados puede sugerir efectos adversos de sustancias tóxicas en los animales [39].

Se puede observar que la administración i / vy i / p de Bio-ZnONP en las tres dosis diferentes (NOAEC, IC ₅₀ y TLC) el peso corporal se redujo ligeramente hasta la segunda semana de administración en comparación con el grupo de control. Sin embargo, después de los 14 días se recuperó el peso corporal. En el caso de la administración i / p, la reducción del peso corporal fue inducida por Bio-ZnONP (30,3 μg / kg) a una concentración letal total y fue menor que el grupo de control, lo que indica una toxicidad trivial por vía i / p sobre la vía i / v. (Tabla 4, Fig. 1a). De manera similar, las ratas tratadas con Bio-CuNP, a una concentración de 9,5 μg / kg y 11,7 μg / kg por vía i / v, se notó una ligera reducción del peso corporal. Hasta los 14 días de tratamiento con Bio-CuNP no se observaron signos de efectos adversos sobre el crecimiento y el aumento de peso corporal. La variación del peso corporal dentro de los 28 días a una dosis de 11,7 μg / kg (vía i / v) se muestra en la Tabla 3. Después del decimocuarto día de tratamiento, se encontró una disminución considerable del peso corporal por vía i / v en comparación con el control. grupo. Por tanto, indica toxicidad de Bio-CuNP a través de esta ruta (Fig. 1b). Las ratas tratadas con Bio-CuNPs mediante la administración por vía i / p indujeron una disminución menor en el peso corporal y no se observó ningún signo de mortalidad en las vías i / py i / v. Por lo tanto, las inyecciones i / p indujeron una menor toxicidad (que se muestra en la Tabla 4 y la Fig. 1a).

Cambio en el peso corporal de ratas no tratadas (control) y tratadas con Bio-CuNP y Bio-ZnONP. Bio-CuNP y Bio-ZnONP tratados mediante (A) vía de administración intraperitoneal (i / p) y (B) intravenosa (i / v) hasta el día 28 de observación. Todos los tratamientos de Bio-CuNPs (Cu) y Bio-ZnONPs (ZnO) en su concentración letal total se administraron y se mantuvieron en observación durante 28 días; N =6 ratas por grupo

Índices de hematología

La estimación de parámetros hematológicos como el recuento de glóbulos rojos, el recuento de glóbulos blancos, el recuento de plaquetas, el nivel de hemoglobina y el tiempo de coagulación de la sangre son entidades importantes para medir la toxicidad de los NP tratados. Para los días 14 y 28, los resultados de la hematología dependiente de la concentración se presentan en las Tablas 5 y 6 para las vías de administración i / py i / v. Dosis de Bio-CuNP a 9,5 μg / kg (IC ₅₀ ) y 11,7 μg / kg (TLC) por vía i / v ha mostrado un recuento de RBC reducido en contraste con Bio-ZnONPs. Sin embargo, no se ha observado una tendencia dependiente de la concentración. Para las ratas tratadas con Bio-ZnONP a través de la vía de administración i / v, el nivel de hemoglobina, el recuento de plaquetas y los glóbulos blancos han cambiado, pero no se observa una diferencia significativa entre las tres concentraciones (NOAEC, IC ₅₀ y TLC). Pero en el caso de la vía de administración i / p, se ha encontrado una disminución y cambios significativos en el recuento de glóbulos rojos, glóbulos blancos, nivel de hemoglobina y recuento de plaquetas en el día 14 de observación (Tabla 5) en comparación con el control y Bio- CuNPs tratados. Sorprendentemente, los efectos hematológicos son normales el día 28 (tabla 6).

Los efectos hematológicos de los diferentes métodos de inyección (i / v, i / p) para los dos Bio-NP diferentes en los días 14 y 28 de observaciones son diversos. Se puede observar que la hemoglobina, los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas disminuyen por vía i / v en el tratamiento con Bio-CuNPs y por vía i / p en ratas tratadas con Bio-ZnONPs. Pero se observó una disminución significativa en los recuentos de glóbulos rojos. Esto indica que las diferentes vías de inyección no indujeron diferencias significativas en el recuento de plaquetas, hemoglobina o glóbulos blancos, excepto en ratas inyectadas con Bio-CuNP (vía i / v). Los glóbulos rojos muestran una diferencia significativa después de la inyección i / py i / v (como se muestra en las Tablas 5 y 6).

Ensayo bioquímico de suero

La creatinina sérica es un producto de desecho; una mayor producción de creatinina indica daño renal. Los Bio-ZnONP (vía i / v:dosis de 11-16 μg / kg, vía i / p:dosis de 24-30 μg / kg) no afectaron significativamente el nivel de creatinina sérica en comparación con el control los días 14 y 28. (Tablas 7 y 8, Fig. 2a, b). Las ratas tratadas con Bio-CuNP (vía i / v:dosis de 06-12 μg / kg) han mostrado un aumento en el nivel de creatinina sérica a 2,3 mg / dl en comparación con el control. Sin embargo, la vía de inyección i / p no mostró cambios significativos (Tablas 7 y 8). El suero sanguíneo tiene un gran número de enzimas, pero para evaluar los síntomas normales y patológicos del hígado, son útiles la alanina transaminasa (glutamato piruvato transaminasa) y aspartato transaminasas (glutamato oxalato acetato transaminasa). La aspartato transaminasa es de origen mitocondrial y está presente en grandes cantidades en el hígado, corazón, riñón y músculos esqueléticos. La fosfatasa alcalina sérica es una enzima globulina de bajo peso molecular, que se encuentra en mayor concentración en huesos, tracto hepatobiliar y riñón. La actividad de esta enzima puede determinarse mediante la estimación del fosfato orgánico liberado del fosfato de glicerol. El nivel sérico de las enzimas se incrementó tanto en la ictericia hepatocelular como en la obstructiva. En la vía de administración i / v, Bio-ZnONPs (40,7 mg / dl, 37,9 UI / L, 82,4 UI / L) no tiene efectos significativos sobre los niveles de ALT sérico, AST y ALP séricos en comparación con el control. Aunque la administración i / p mostró un aumento significativo en los niveles de ALT, AST y ALP en comparación con el control a los días 14 y 28 (Fig. 2a yb). Los resultados del estudio de toxicidad en suero no mostraron cambios en los niveles de creatinina, ALT, AST y ALP de Bio-ZnONP para la ruta i / v hasta los 28 días.

Resultados bioquímicos de ratas tratadas con Bio-CuNP y Bio-ZnONP. Se midieron los niveles de S. creatinina, ALT, AST y ALP en ratas tratadas con Bio-CuNP y Bio-ZnONP a través de la vía de administración intraperitoneal (i / p) e intravenosa (i / v) el (A) día 14 y (B) Día 28. Todos los datos se expresan en media ± DE de la media de los tres experimentos independientes; cada uno se llevó a cabo por triplicado, N =6 ratas por grupo. Nota:Cu:Bio-CuNP, ZnO:Bio-ZnONP, i / p:intraperitoneal, i / v:intravenoso

Por el contrario, las ratas tratadas con Bio-CuNP por vía i / v mostraron un aumento significativo en la ALT sérica (67,7 mg / dl), el nivel de AST (70 UI / L) y la ALP (128 UI / L). El efecto de los Bio-CuNP a través de la ruta i / p fue considerablemente bajo en comparación con el control. La diferencia de los resultados podría atribuirse a la diferencia en las vías de dosificación, la toxicidad de las nanopartículas y la duración de la administración. Descubrimos que los Bio-ZnONP no tienen ningún efecto sobre los biomarcadores de la función renal y hepática (tanto i / v como i / p) en comparación con los Bio-CuNP.

Detección de peso de orgánulos y estudio histológico

Los cambios en el peso de los órganos de las ratas a diferentes dosis de Bio-NP ilustran los efectos adversos de los NP en los órganos. Se puede ver que el peso del corazón, hígado, bazo, pulmón, riñones y cerebro disminuye en ratas cuando se trata con Bio-ZnONP como se muestra en las Tablas 9 y 10. Además, consideración de la reacción del órgano y el grado de cambios. fueron examinados calculando el índice de órganos (O _X ) de cada órgano por separado. El índice de órganos del corazón, hígado, bazo, pulmón, riñones, cerebro y timo se presenta en las Tablas 9 y 10.

Se observaron diferencias en el peso del bazo y el timo después de la administración i / vy i / p en ratas tratadas con Bio-CuNP y Bio-ZnONP. El día 14, Bio-ZnONPs mostró una disminución del índice del bazo mediante la inyección i / p y un aumento con la administración i / v (Tabla 9). En el caso de las ratas tratadas con Bio-CuNPs mediante administración i / v, se observó una reducción significativa en el índice del bazo el día 14 (0,265) y el día 28 (0,49). Indicando así, el sistema inmunológico se ha visto afectado por la administración i / v de Bio-CuNP y la administración i / p de Bio-ZnONP. En el caso de la administración i / p de Bio-ZnONP, el sistema inmunológico de la rata vuelve al estado normal después del día 14 y demuestra que el efecto no se prolonga. En conjunto con la variación anterior del peso corporal, parece que la vía de administración i / v de Bio-CuNP puede afectar el corazón, hígado, pulmón, riñones y cerebro; además, podría dañar el sistema inmunológico. De la Fig. 3a, implica que el bazo y el timo son el objetivo principal de los órganos por las Bio-CuNP.

Cambio en la morfología de los orgánulos. Donde a bazo, b hígado, c riñón, d cerebro, e pulmones y f corazón, de ratas Wistar macho tratadas con Bio-CuNP por vía intravenosa en comparación con el control en la observación del día 28

En el caso de grupos tratados con i / vy i / p Bio-CuNPs, se han observado efectos obvios sobre el índice de órganos en ambos IC ₅₀ y dosis de TLC. Además, de las dos vías de administración diferentes, la inyección intraperitoneal muestra la toxicidad modesta en los grupos tratados con Bio-ZnONP y la toxicidad más alta en los grupos tratados con Bio-CuNP. Se sabía que la absorción eficaz del fármaco mediante inyección i / p era rápida debido a la densidad de los vasos sanguíneos y la linfa del peritoneo murino [40]. En consecuencia, la inyección intravenosa muestra la menor toxicidad en los grupos tratados con Bio-ZnONP y la mayor toxicidad en los grupos tratados con Bio-CuNP.

Cambios toxicológicos en ratas

Intentamos escudriñar los efectos de la toxicidad, en diferentes dosis e intervalos de tiempo de Bio-NP. Los tejidos tratados con Bio-ZnONP (vía i / v:rango de dosis 11-16 μg / kg, vía i / p:rango de dosis 24-30 μg / kg) no mostraron cambios en el hígado, riñón, bazo y cerebro en comparación con controlar los tejidos (Figs. 4, 5, 6 y 7). Las observaciones de la necropsia (autopsia:examen disectivo de ratas muertas) especificaron que todos los órganos de las ratas tratadas con Bio-NP exhibieron las características anatómicas (por ejemplo, características de color, forma y tamaño) esperadas en función de su apariencia en un animal no tratado. En comparación con Bio-ZnONP, las ratas tratadas con Bio-CuNP mostraron cambios más significativos en las características anatómicas de los tejidos del riñón, hígado, bazo y cerebro en contraste con el control (Figs. 4, 5, 6 y 7).

Secciones teñidas con H &E de riñón de rata. Ratas tratadas por vía i / vy i / p con Bio-Cu y ZnONP; las muestras no tratadas se consideraron control. Donde las secciones tratadas con Bio-CuNPs se observaron el día 14 (A – C) y el día 28 (D – F). Secciones tratadas con Bio-ZnONPs el día 14 (G – I) y el día 28 (J – L). Cápsula BC Bowman, glomerular G, túbulo proximal PT, necrosis glomerular GN, daño al túbulo proximal PTD

Secciones teñidas con H &E de bazo de rata. Ratas tratadas por vía i / vy i / p con Bio-Cu y ZnONP; las muestras no tratadas se consideraron control. Las secciones tratadas con Bio-CuNP se observaron el día 14 (A – C) y el día 28 (D – F). Secciones tratadas con Bio-ZnONPs el día 14 (G – I) y el día 28 (J – L). Pulpa blanca WP, pulpa roja RP, disminución de DRP en pulpa roja

Secciones de hígado de rata teñidas con H &E. Ratas tratadas por vía i / vy i / p con Bio-Cu y ZnONP; las muestras no tratadas se consideraron control. Las secciones tratadas con Bio-CuNP se observaron el día 14 (A – C) y el día 28 (D – F). Secciones tratadas con Bio-ZnONPs el día 14 (G – I) y el día 28 (J – L). Vena central CV, células KC Kupffer, vacuolización de la vena central CVV (vacuolización citoplásmica), hemorragia hepática HH

Secciones teñidas con H &E de cerebro de rata. Ratas tratadas por vía i / vy i / p con Bio-Cu y ZnONP; las muestras no tratadas se consideraron control. Las secciones tratadas con Bio-CuNP se observaron el día 14 (A – C) y el día 28 (D – F). Secciones tratadas con Bio-ZnONPs el día 14 (G – I) y el día 28 (J – L). [Todos los portaobjetos se observan con un aumento de × 40, NIKON eclipse E200 (microscopio trinacular)]

Los bio-CuNP indujeron daños mediante la administración por vía i / v y mostraron una tendencia dependiente de la dosis en los tejidos. A una concentración de TLC (11, 7 μg / kg), los Bio-CuNP mostraron un daño severo en los tejidos del hígado y los riñones de las ratas Wistar. Además, las Bio-CuNP tratadas por vía i / v e i / p han inducido necrosis de células glomerulares (atrofia glomerular), cápsula de Bowman y tubular proximal en ratas del grupo 14 y 28 días (Fig. 4b, e, cyf ) en comparación con el control no tratado. La necrosis glomerular se debe al reembolso inmunológico, pero los daños de los túbulos se deben principalmente al efecto tóxico de los NP. El daño tubular causado por los efectos tóxicos de los Bio-CuNP a través de las rutas i / v e i / p también aumentó la presión glomerular y causa atrofia glomerular.

El grupo de control normal mostró una estructura histológica normal del lóbulo hepático y la vena central que está rodeada por hepatocitos normales (Fig. 6). Los Bio-CuNP tratados mediante la ruta i / p (19,82 µg / kg) mostraron cambios histológicos leves que incluían la activación de las células de Kupffer tanto en la observación del día 14 como en el del día 28 (Fig. 6b, e). Las ratas tratadas con Bio-CuNPs por vía i / v mostraron cambios severos incluyendo vacuolización citoplásmica de hepatocitos rodeados de vena central y hemorragia hepática para observación del día 14 (Fig. 6c). Sorprendentemente, el grupo del día 28 mostró cambios moderados que incluían cambios grasos de los hepatocitos y picnosis de los núcleos hepatocíticos (Fig. 6f). El tejido hepático tratado con Bio-ZnONP, durante el día 14 del grupo administrado por vía i / p, mostró cambios moderados demostrados por cambios grasos de los hepatocitos (Fig. 6i). Los grupos tratados con Bio-ZnONPs mostraron una ligera mejoría y se observó una actividad hepatoprotectora significativa en el día 28 en comparación con el día 14 (Fig. 6l). A partir del día 14, se llevó a cabo la restauración de la arquitectura hepática normal en los animales tratados con Bio-ZnONPs.

Se observó una disminución en las células del bazo (pulpa roja), mientras que un aumento en los linfocitos (pulpa blanca), en el tejido del bazo extraído de ratas tratadas con Bio-CuNPs por vía i / v (Fig. 5c, f). En la observación primaria, se observó una acumulación de Bio-CuNP en el bazo en la pulpa roja y se relacionó con una modesta pérdida de masa celular; reduced cell mass was obvious on the 28th day time point when compared with 14th day of i/v administration (Fig. 5f), whereas minor changes were observed in red pulp depletion when rats were treated with Bio-CuNPs via i/p route on both 14th and 28th day time point. Structural changes were not seen in the white pulp or in splenic blood vessels (arteries or venous sinuses) and intravascular erythrocytes (Fig. 5b, e). No morphological changes have been found in spleen tissues treated with Bio-ZnONPs (Fig. 5). The H&E-stained brain sections of rats, treated (i/v and i/p) with NPs, showed no changes in brain region, olfactory bulb (perivascular localization) and the choroid plexus and ependyma of the lateral ventricles (Fig. 7).

Conclusion

Animal toxicity studies using 16- to 96-nm-ranged biosynthesized copper (Bio-CuNPs) and zinc oxide (Bio-ZnONPs) was assessed in male Wistar rat at the dose range of 6.1 to 19.82 μg/kg and 11.14 to 30.3 μg/kg respectively for both i/p and i/v routes on 14th and 28th day of observation. We observed no mortality and normal behaviour in the animals treated with Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs in their specific dose range. The results also verified the Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs at low concentrations do not cause identifiable toxicity even after their breakdown in vivo over time. Increased concentrations of these Bio-NPs induce weight reduction, but no significant statistical difference was observed for Bio-ZnONPs’ treated animals. In the case of i/v and i/p Bio-CuNPs’ treated groups, obvious effects on organ index have been observed at both IC₅₀ and TLC doses. Moreover, of the two different administration routes, the intraperitoneal injection shows the modest toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Correspondingly, the intravenous injection shows the least toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Considering all the results of studies, targeting Bio-ZnONPs by intravenous injection is promising for possible biomedical application.

Abreviaturas

±:

Plus or minus

ALP:

Fosfatasa alcalina

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

Bio-CuNPs:

Biogenic copper nanoparticles

Bio-ZnONPs:

Biogenic zinc oxide nanoparticles

B_X :

Brain index

CRE:

Creatinine

Cu:

Copper

FesEM:

Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo

H&E:

Haematoxylin eosin

Hb:

Haemoglobin

H_X :

Heart index

i.e.:

That is

i/p route:

Intraperitoneal route

i/v route:

Intravenous route

IC:

Inhibitory concentration

K_X :

Kidney index

Li_X :

Liver index

Lu_X :

Lung index

NOAEC:

No observable adverse effect concentration

NPs:

Nanoparticles

O_x :

Organ index

RBC:

Red blood cell

SD:

Standard deviation

S_X :

Spleen index

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TLC:

Total lethal concentration

T_X :

Thymus index

WBC:

White blood cell

ZnO:

Óxido de zinc

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