Síntesis y rendimiento in vitro de nanopartículas de hierro-platino recubiertas de polipirrol para terapia fototérmica e imágenes fotoacústicas

Métodos

Material

Acetilacetonato de platino (Pt (acac) ₂ , 97%) se adquirió de Acros Organics y se utilizó tal como se recibió. Hierro pentacarbonilo (Fe (CO) ₅ , 99%), hexadecano-1,2-diol (90%), oleil amina (80-90%), ácido oleico (70%), dioctil éter (90%), 1-octadeceno (90%), 3- mercaptopropiónico (3-MPA, 97%), pirrol (Py, grado reactivo, 98%), alcohol polivinílico (PVA, Mw:9000–10,000), persulfato de amonio ((NH ₄ ) ₂ S ₂ O ₈ , 98%), dodecilsulfato de sodio (SDS), ferrocianuro de potasio, ácido clorhídrico y bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) se adquirieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron recibido durante los experimentos. Los reactivos de tinción celular que incluyen azul de tripán, yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342 también se adquirieron de Sigma-Aldrich. El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino (FBS), la penicilina, la estreptomicina, la tripsina 1x y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirieron en HyClone (South Logan, UT, EE. UU.). Se utilizó agua destilada (DI) para todos los experimentos.

Síntesis de NP FePt @ PPy

La síntesis de NP de FePt @ PPy se realizó mediante tres pasos que se describen en el Esquema 1.

Representación esquemática de la síntesis de FePt @ PPy NPs

Paso 1:Síntesis de NP de FePt hidrofóbicas

La síntesis de NP de FePt hidrofóbicas se realizó de acuerdo con el esquema informado [5]. En resumen, 97 mg de Pt (acac) ₂ , 4 ml de éter dioctílico, 66 μl de Fe (CO) ₅ , Se cargaron 195 mg de 1,2-hexadecandiol, 100 μL de oleil amina y 100 μL de ácido oleico en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 50 mL. La mezcla de reacción se calentó a 240 ° C con una velocidad de calentamiento de 15 ° C / min bajo gas argón. Después de 30 min, el producto se enfrió a temperatura ambiente. Las NP de FePt se recogieron mediante centrifugación (15.000 rpm, 30 min) y se lavaron varias veces con hexano. La solución de nanopartículas final se almacenó en hexano.

Paso 2:Intercambio de ligandos

Los ligandos en la superficie de las NP de FePt hidrofóbicas se intercambiaron con ácido 3-mercaptopropiónico (3-MPA) como se informa en los artículos [14]. Además, se cargó 1 mL de 3-MPA y 1 mL de ciclohexanona en un tubo de centrífuga, y luego, se agregaron 0.5 mL de NP de FePt hidrofóbicas dispersas en hexano (~ 10 mg) a la solución anterior y se agitó usando un vórtice. Después de 30 min, las NP de FePt comenzaron a precipitar y todas las nanopartículas precipitaron después de 1 h. Las NP de FePt hidrófilas se recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 5 min). El producto se lavó con ciclohexanona, etanol y acetona, respectivamente. Finalmente, las NP de FePt hidrófilas se diluyeron en DI con la adición de NaOH.

Paso 3:Recubrimiento de NP de FePt hidrófilas con PPy

Se disolvieron cinco miligramos de NP de FePt hidrófilo en 200 ml de barker que contenía 60 ml de DI y se sonicó de forma continua durante 10 min. Luego, se agregaron 6 ml de SDS 40 mM a la solución anterior. A continuación, se añadió a la solución anterior 1 g de PVA que se disolvió completamente en agua caliente. Después, la mezcla resultante se agitó a 500 rpm. A continuación, 10 ml de (NH ₄ ) ₂ S ₂ O ₈ se añadió a la solución agitada. Después de 1 h de equilibrio, se añadieron 6 ml de Py 100 mM a la solución anterior. Después de varios minutos, la solución gradualmente se volvió negra. Después de 2 h de polimerización, las nanopartículas resultantes se separaron por centrifugación (12.000 rpm, 30 min) y se lavaron varias veces con agua caliente para eliminar las impurezas. Las NP de FePt @ PPy obtenidas se resuspendieron con PBS mediante ultrasonidos durante 3 min.

Caracterización

La morfología de las nanopartículas se observó mediante microscopía electrónica de transmisión de emisión de campo (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japón). La composición atómica se analizó mediante espectroscopía de dispersión de energía (EDS). Los grupos químicos funcionales de las nanopartículas se analizaron utilizando un espectrómetro de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (espectrofotómetro Perkin Elmer 1320 FTIR). El diámetro de las nanopartículas se determinó mediante el método de dispersión de luz dinámica utilizando un espectrofotómetro de dispersión de luz electroforética (ELS-8000, OTSUKA Electronics Co. Ltd., Japón). Los espectros UV-Vis-NIR se midieron usando espectroscopía UV-Vis-NIR (espectrofotómetro Thermo Biomate 5). La irradiación con láser se realizó utilizando un láser de 808 nm sintonizable en potencia (onda continua, potencia máxima =5 W, Hi-TechOptoelectronics Co., Beijing, China).

Prueba fototérmica

Para medir el rendimiento fototérmico de las NP preparadas, se agregó una suspensión (1 mL) que contenía las NP FePt @ PPy con concentraciones específicas (20, 30, 50, 70, 100 y 120 μg / mL) en un pozo de 12 pocillos. plato. Luego, cada pocillo fue expuesto por un láser de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W / cm ² durante 5 min. Además, también se registró el aumento de temperatura de las NP de FePt @ PPy irradiadas a diferentes densidades de potencia del láser de 808 nm. Brevemente, se irradió una solución de FePt @ PPy NP de 50 μg / ml con el láser NIR a la densidad de potencia deseada de 0,5, 1 y 1,5 W / cm ² durante 6 min. La temperatura se registró con un termómetro (MASTECH, CA, EE. UU.) A través de una fibra térmica.

Prueba de fotoestabilidad

Se expusieron NP de FePt @ PPy de 50 μg / ml al láser de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W / cm ² hasta que se alcanzó la temperatura más alta, y luego, se dejó volver a la temperatura ambiente apagando el láser. Los ciclos de calentamiento y enfriamiento se repitieron seis veces. Se registró el espectro UV-Vis de la muestra irradiada para compararlo con la muestra irradiada.

Prueba de almacenamiento a largo plazo

La suspensión acuosa FePt @ PPy NPs a una concentración de 120 μg / ml se almacenó a 4 ° C durante 30 días para evaluar su estabilidad en almacenamiento a largo plazo. Para la comparación, se observaron los espectros de absorción de UV-Vis y el tamaño de partículas de las NP de FePt @ PPy durante el primer día y el último día. Además, las NP de FePt @ PPy en diferentes medios, incluidos DI, DMEM más FBS y PBS, se almacenaron a 4 ° C durante 30 días para evaluar la estabilidad de las NP de FePt @ PPy preparadas.

Ensayo de citotoxicidad de NP de FePt-PPy

Se utilizó un ensayo MTT estándar [15] para cuantificar la citotoxicidad celular. Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se utilizaron como células cancerosas modelo para probar la biocompatibilidad de los NP de FePt @ PPy. Como control se utilizaron células cancerosas tratadas con FePt NP. La línea celular MDA-MB-231 se cultivó en un medio DMEM complementado con FBS al 10% y antibióticos al 1% en una atmósfera humidificada a 37 ° C y CO ₂ al 5% . Las células MDA-MB-231 se sembraron en una microplaca de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / pocillo. Después de 24 h, los medios DMEM que contenían NP de FePt @ PPy (o NP de FePt) con diferentes concentraciones (0, 20, 30, 50, 70, 100 y 120 μg / mL) se agregaron a las placas de células y las células tratadas se luego se incubó durante 48 h. Tenga en cuenta que la cantidad de FePt es la misma para las dos nanopartículas probadas, incluidas las NP de FePt y las NP de FePt-PPy. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 μL de MTT disuelto en PBS a 0,5 mg / ml y las placas de células se incubaron durante 4 h. La enzima deshidrogenasa, que está presente en las mitocondrias de las células vivas, convirtió el MTT soluble en formazán púrpura insoluble. A continuación, se añadieron 100 µl de DMSO para disolver el formazán violeta insoluble. Posteriormente, se registró la absorción de formazán púrpura a 570 nm utilizando un espectrofotómetro de lectura de placas para cuantificar el porcentaje de viabilidad celular.

Captación celular

Se utilizó tinción con azul de Prusia para comprobar la captación celular de NP de FePt @ PPy en la célula MDA-MB-231 [16]. Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10 ⁵ células / mL en placas de 12 pocillos y se incubaron durante 24 h. A continuación, se añadieron NP de FePt @ PPy de 200 μg / ml a las placas de células y se incubaron durante otras 24 h. Después de eso, las células se fijaron con formaldehído frío durante 15 min. Y luego, ferrocianuro de potasio al 10% y solución acuosa de ácido clorhídrico al 20% (50:50 v / v ) se añadieron a las placas de células y se incubaron durante 1 h. El resultado se observó mediante microscopía óptica.

Terapia fototérmica in vitro

El ensayo MTT se realizó para cuantificar la eficacia de las NP FePt @ PPy sobre la capacidad de destrucción de las células de cáncer de mama MDA-MB-231. Brevemente, las células MDA-MB-231 se cultivaron en una microplaca de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / pocillo. Al día siguiente, las soluciones de FePt @ PPy NP con concentración específica (0, 10, 20, 30, 50, 70 y 100 μg / mL) se agregaron a las placas de células y las células tratadas se incubaron durante otras 24 h. . Luego, se usó PBS para lavar las nanopartículas no unidas. Posteriormente, las microplacas se expusieron al láser NIR a una densidad de potencia de 1 W / cm ² durante 4 y 6 min, respectivamente. Para obtener los resultados, se llevaron a cabo los siguientes pasos de acuerdo con el ensayo de citotoxicidad celular en la sección "Ensayo de citotoxicidad de NP de FePt-PPy".

También se utilizó la tinción doble de Hoechst 33342 y PI para detectar las células dañadas y muertas como resultado del tratamiento fototérmico con NP FePt @ PPy. Concretamente, las células MDA-MB-231 se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁵ células / pocillo. Después de 24 h, las células se trataron con las NP de FePt @ PPy (0, 50, 70 y 100 μg / mL) y se incubaron continuamente durante otras 24 ha 37 ° C. A continuación, las nanopartículas no unidas se eliminaron lavando suavemente con PBS. Posteriormente, las placas de las células se expusieron al láser NIR a una densidad de potencia de 1 W / cm ² durante 6 min. A continuación, las placas de cultivo celular se mantuvieron durante 24 h en la incubadora, y luego, las células irradiadas se tiñeron con Hoechst 33342 y PI. Tenga en cuenta que se agregaron 1,5 ml de Hoechst 33342 (10 μg / ml) en la placa de cultivo celular y luego se mantuvo en la incubadora durante 20 min. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar el exceso de tinción. Luego, las células se tiñeron continuamente con 1,5 mL de PI (10 μg / mL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Finalmente, las células se lavaron nuevamente con PBS y las imágenes fluorescentes se capturaron con un microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania).

Experimento con animales

Para realizar una prueba in vivo de las propiedades fototérmicas de las NP de FePt @ PPy, se inyectó subcutáneamente a un ratón desnudo BALB / c hembra de 6 semanas de edad con 100 μL de NP de FePt @ PPy de 100 μg / ml en PBS. Otro ratón desnudo sin inyección se utilizó como control. Posteriormente, el área inyectada de los ratones se irradió con un láser de 808 nm a 1 W / cm ² durante 6 min. Los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de uso y cuidado de animales de la Universidad Nacional de Pukyong y se realizaron de acuerdo con los principios rectores para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Imágenes fotoacústicas in vitro

Configuración de PAI

Se realizó PAI en el fantasma para evaluar la señal de PA de las NP de FePt @ PPy. Nuestro grupo ha desarrollado el sistema PAI no invasivo como se informó en el estudio anterior [17]. El diagrama esquemático de la configuración de PAI se muestra en la Fig. 11. Se empleó un sistema óptico integrado con un láser de conmutación Q de Nd-YAD pulsado (Surelite III, CA, EE. UU.). El láser se fijó en una longitud de onda de 808 nm y una frecuencia de 10 Hz con una operación de pulso de 5 ns. La fibra óptica de entrada que tiene una distancia focal de 50 mm (Thorlabs, Newton, NJ, EE. UU.) Se conectó a una lente plano-convexa. La fibra óptica de salida se conectó a un transductor enfocado (Olympus NDT, EE. UU.) Y se ajustó al centro de la zona iluminada. Para registrar señales de megafonía, los datos se digitalizaron y almacenaron a través de un sistema DAQ (adquisición de datos) integrado con el sistema láser. Posteriormente, los datos registrados se utilizaron para reconstruir imágenes 2D del fantasma mediante un programa de LabVIEW.

Preparación de la muestra

El fantasma de PVA se preparó con PVA al 8% para imitar el tejido. Las células cancerosas MBA-MD-231 preseleccionadas se trataron con diferentes concentraciones de NP de FePt @ PPy (50, 100 y 200 μg / ml) durante 24 h, y luego, las células se recolectaron y se mezclaron con gelatina al 4% en el maniquí (Figura 12a). Luego, el fantasma se cubrió con una pequeña capa de gelatina al 4% y se dejó solidificar. Finalmente, se fijó el fantasma en el tanque de agua para el procesamiento de PAI.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de NP de FePt @ PPy

El proceso de síntesis de FePt NP se ilustra en el Esquema 1. El análisis de EDS de estas nanopartículas reveló que la composición atómica final de Fe y Pt son 20 y 80%, respectivamente (archivo adicional 1:Figura S1). Las NP de FePt hidrófobas se modificaron con 3-MPA; por tanto, se convierten en NP de FePt hidrófilas con un tamaño medio de 8,3 nm. Las NP de FePt hidrófobas se dispersan en hexano debido a la presencia de ácido oleico y oleilamina en la superficie. Sin embargo, las partículas se vuelven solubles en agua después del intercambio de ligando. Los espectros FTIR de NP de FePt hidrófobo y NP de FePt hidrófilo revelaron las bandas características de los ligandos de absorción de ácido oleico, oleilamina y 3-MPA en la superficie (Fig. 3; Esquema 2) [14, 18]. Los datos de FTIR (Fig. 2) junto con la buena solubilidad de las NP de FePt hidrófilas en agua (Esquema 1, paso 2) confirmaron el éxito del proceso de intercambio de ligandos.

Representación esquemática de la síntesis y aplicación de NP FePt @ PPy en terapia fototérmica e imagen fotoacústica

Las NP de FePt se recubrieron con PPy mediante polimerización por oxidación química utilizando (NH ₄ ) S ₂ O ₈ como agente oxidante y PVA como estabilizador. La capa de PPy se observó claramente mediante formación de imágenes por TEM (Fig. 1c) con un grosor de aproximadamente 10 nm, y el tamaño medio de las NP de FePt @ PPy es de 42 nm (Fig. 1d). El FTIR de FePt @ PPy NP también se implementó para confirmar el recubrimiento de PPy NP mediante el examen de los cambios de frecuencia de FTIR (Fig. 3c). Los picos característicos de PPy se analizaron bien en el informe anterior [19]. Las bandas de vibración FTIR a 1620 y 1446 cm ⁻¹ se asignaron a las vibraciones de estiramiento C – C y C =C de un anillo PPy. La banda a 1236 cm ⁻¹ se atribuyó a la vibración de estiramiento C – N, y la banda a 1076 cm ⁻¹ indicó la presencia de un modo de deformación en el plano C – N. Además, las bandas a 798 y 600 cm ⁻¹ se atribuyeron a la vibración de deformación en el plano C – H y N – H y las vibraciones de flexión exterior C – H, respectivamente. El FTIR junto con el TEM asegura el recubrimiento exitoso de los NP de FePt externos de PPy.

un TEM y b distribuciones de tamaño correspondientes de NP de FePt puro. c TEM y d distribuciones de tamaño correspondientes de FePt @ PPy NPs

Espectros FTIR de (a) NP de FePt hidrófobas, (b) NP de FePt hidrófila y (c) NP de FePt @ PPy

Los espectros UV-Vis-NIR de NP de FePt, PPy y FePt @ PPy puros

Curva de calentamiento fototérmico de NP de FePt puro y NP de FePt @ PPy con la misma cantidad de FePt. Todas las soluciones se irradiaron con 1 W / cm ² Láser de 808 nm durante 6 minutos

un Espectros UV-Vis-NIR de diferentes concentraciones de NP de FePt @ PPy. b La desintegración fototérmica de NP de FePt @ PPy con diferentes concentraciones. c Las correspondientes imágenes termográficas NIR de muestras irradiadas. Todas las soluciones se irradiaron con 1 W / cm ² Láser de 808 nm durante 5 minutos

un Comportamiento fototérmico de 50 μg / mL de NP de FePt @ PPy mantenidas bajo un láser de 808 nm a diferentes densidades de potencia durante 6 min. b El registro de temperatura en tiempo real de seis ciclos de calentamiento / enfriamiento de 50 μg / mL de NP de FePt @ PPy bajo un experimento láser de encendido / apagado (1 W / cm ² ). c Espectros UV-Vis-NIR de FePt @ PPy NP antes y después de la irradiación

Viabilidad celular (con ensayo MTT) de células MDA-MB-231 incubadas con NP de FePt y FePt @ PPy con diferentes concentraciones durante 48 h

Porcentaje de células vivas de las células tratadas con NP de FePt @ PPy bajo diferentes densidades de potencia láser y diferentes tiempos de irradiación. un La irradiación se realizó durante 4 min. b La irradiación se realizó durante 6 minutos

Imágenes de campo brillante y fluorescencia de células MDA-MB-231 en diferentes condiciones. un Control. b Solo láser. c 50 μg / mL FePt @ PPy NPs + láser. d 70 μg / mL FePt @ PPy NPs + láser. e 100 μg / mL FePt @ PPy NPs + láser. Todas las soluciones se irradiaron con 1 W / cm ² Láser de 808 nm durante 6 minutos

un La imagen óptica y las imágenes termográficas NIR correspondientes del ratón desnudo antes de la inyección de NP de FePt @ PPy. b El lado izquierdo:la imagen óptica del ratón desnudo con inyección subcutánea. El círculo rojo punteado indica la ubicación de la inyección. El lado derecho:la imagen termográfica NIR del ratón desnudo después de 6 min bajo irradiación con un láser de 808 nm (1 W / cm ² ). Tenga en cuenta que el calentamiento máximo corresponde al lugar de la inyección. c Cambio de temperatura de la superficie de la piel en el lugar de la inyección y en los ratones con irradiación con láser de 808 nm (1 W / cm ² ) durante 6 minutos

Configuración experimental del sistema PAI

Evaluaciones de las respuestas de PA de FePt @ PPy NP a diversas concentraciones: a fantasma y b imágenes de PA correspondientes

Los espectros de absorción UV-Vis-NIR de NP de FePt, PPy y FePt @ PPy puros se dan en la Fig. 3. Se observó una fuerte absorción en la región NIR para las nanopartículas compuestas. Los espectros de absorción de FePt y PPy juntos pueden contribuir al de los NP de FePt @ PPy. Las propiedades ópticas de las dispersiones acuosas de FePt @ PPy NP con diferentes concentraciones (de 20 a 120 μg / mL) también fueron registradas por espectroscopía UV-Vis-NIR. Como se muestra en la Fig. 4a, con un aumento de la concentración de FePt @ PPy NP, la intensidad de fotoabsorción de toda la región UV-Vis-NIR aumentó.

Rendimiento fototérmico de NP FePt @ PPy

Los comportamientos fototérmicos de las NP de FePt y FePt @ PPy puro se compararon en la Fig. 4. Las NP de FePt y FePt @ PPy puro con la cantidad fija de FePt se irradiaron con un láser de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W / cm ² . Las NP de FePt @ PPy mostraron un excelente comportamiento fototérmico en comparación con las NP de FePt puro. Estos datos indicaron que la capa de PPy mejoró la eficacia fototérmica de todo el sistema.

Como se muestra en las Figs. 5a, en la misma condición de láser NIR (5 min, 1 W / cm ² ), la temperatura de la solución que contenía NP de FePt @ PPy de 20 μg / ml aumentó de 25 a 39,3 ° C, mientras que la que contenía NP de FePt @ PPy de 120 μg / ml alcanzó rápidamente los 71 ° C. Además, las imágenes termográficas (Fig. 5c) indicaron la conversión fototérmica eficaz de la muestra que contenía NP de FePt @ PPy irradiadas con un láser de 808 nm. Los NP de FePt @ PPy (50 μg / ml) se expusieron a irradiación láser NIR a diferentes densidades de potencia láser de 0,5, 1,0 y 1,5 W / cm ² durante 6 min, y las temperaturas resultantes fueron 41,1, 51,3 y 59,4 ° C, respectivamente. Estos resultados experimentales revelaron que el tiempo de exposición, la concentración de nanopartículas y la intensidad de la potencia del láser son parámetros importantes que influyen significativamente en el rendimiento fototérmico de las NP de FePt @ PPy.

Pruebas de estabilidad fototérmica de NP FePt @ PPy

Además de la fuerte transducción fototérmica, la fotoestabilidad de las nanopartículas es importante en PTT. Se irradió una solución de FePt @ PPy NP de 50 μg / ml con el láser NIR de 808 nm a 1,0 W / cm ² hasta que la solución alcanza la temperatura más alta, luego se enfría naturalmente a temperatura ambiente apagando el láser. Después de seis ciclos de calentamiento y enfriamiento, la curva térmica de FePt @ PPy NPs permaneció casi igual para cada ciclo (Fig. 4d). Los espectros UV-Vis-NIR antes y después de la exposición al láser se muestran en la Fig. 6c. No se observó ningún cambio significativo para todo el espectro. Los resultados anteriores indicaron una buena estabilidad fototérmica de las NP de FePt @ PPy durante un largo período de irradiación con láser NIR.

Prueba de almacenamiento a largo plazo

El tamaño de partícula y los espectros de absorción UV-Vis-NIR de las nanopartículas preparadas se controlaron durante los 30 días de almacenamiento. En primer lugar, no se observó agregación en todas las soluciones que contienen FePt @ PPy NP (archivo adicional 1:Figura S3a). En segundo lugar, FePt @ PPy NPs en medios de cultivo celular a una concentración de 120 μg / mL no mostró ningún cambio significativo en sus espectros UV-Vis-NIR (archivo adicional 1:Figura S3b) después de los 30 días de almacenamiento. Además, el tamaño de partícula promedio de las NP de FePt @ PPy casi no se modificó durante el almacenamiento a largo plazo (archivo adicional 1:Figura S3c). Todos los resultados anteriores demostraron evidentemente la estabilidad de las nanopartículas preparadas.

Ensayo de citotoxicidad celular in vitro

Para el tratamiento del cáncer, las nanopartículas deben tener una excelente biocompatibilidad. Como se muestra en la Fig. 7, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se trataron con NP de FePt y FePt @ PPy puro con diferente concentración y se incubaron durante 48 h. No se observó citotoxicidad significativa de las NP de FePt @ PPy incluso a la concentración más alta probada (120 μg / ml), y la viabilidad celular de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 fue aún mayor al 95%. Para las NP de FePt puro, 120 μg / ml de nanopartículas irradiadas mataron al 20% de las células cancerosas. Este resultado indicó que el recubrimiento de la capa de PPy mejoró la biocompatibilidad de las NP de FePt, y las NP de FePt @ PPy pueden considerarse un material no tóxico.

Captación celular

La tinción con azul de Prusia, que se basa en la reacción de ferrocianuro de hierro y potasio en solución ácida, se realizó para detectar la captación celular de NP de FePt @ PPy. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S2, la mayoría de las células se tiñeron con tinciones azules dentro de las células, lo que indica la captación celular de NP de FePt @ PPy.

Terapia fototérmica in vitro

El ensayo MTT estándar se realizó para evaluar la eficacia de las NP de FePt @ PPy irradiadas sobre la capacidad de destrucción de las células de cáncer de mama MDA-MB-231. Primero, las células cancerosas se incubaron con diferentes concentraciones de NP de FePt @ PPy durante 24 hy luego se expusieron al láser de 808 nm a 1 W / cm ² durante 4 min. Como se muestra en la Fig. 8, el porcentaje de viabilidad celular disminuyó gradualmente cuando se incrementó la concentración de las nanopartículas tratadas. Aproximadamente el 50% de las células murieron a una concentración de 100 μg / ml de NP de FePt @ PPy irradiadas. Para matar más células cancerosas, se aumentó el tiempo de irradiación hasta 6 minutos. With 100 μg/mL concentration, approximately 70% of dead cells were observed. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.

Conclusions

In this study, we developed the photoabsorber FePt@PPy NPs and evaluated their efficiency on in vitro PTT and PAI (Scheme 2). The prepared FePt@PPy NPs showed many good properties for PTT and PAI including excellent biocompatibility, photothermal stability, and high NIR absorbance. Moreover, in vitro investigation confirmed the effectiveness of the FePt@PPy NPs in killing the cancer cells under the NIR laser. So far, the phantom test of PAI used in conjunction with FePt@PPy NPs showed a strong PA signal. Owing to their good properties, the novel FePt@PPy NPs could be considered as promising multifunctional nanoparticles for further applications in PTT and PAI.

Nanocompuestos magnéticos de poli (N-isopropilacrilamida):efecto del método de preparación sobre las propiedades antibacterianas Na4Mn9O18 / Compuesto de nanotubos de carbono como material de alto rendimiento electroquímico para baterías acuosas de iones de sodio