Nanocompuestos magnéticos de poli (N-isopropilacrilamida):efecto del método de preparación sobre las propiedades antibacterianas

Métodos

Productos químicos

Cloruro de hierro (III) hexahidrato (FeCl ₃ .6H ₂ O, ≥ 98%), cloruro de hierro (II) tetrahidrato (FeCl ₂ .4H ₂ O, ≥ 99%), hidróxido de amonio (26% NH ₃ en H ₂ O), N-isopropil-acrilamida (NiPAM, ≥ 99%), N, N-metilenbis (acrilamida) (BIS, ≥ 99%), dodecilsulfato de sodio (SDS, ≥ 99%) y persulfato de amonio (APS, ≥ 98,5) %) se compraron frescos de Sigma-Aldrich, Alemania.

Preparación de PNIPAAm por polimerización en emulsión

Se disolvieron NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) y SDS (0,3 g) en 350 ml de agua desionizada (DI) a 70ºC bajo nitrógeno atmosférico. Se disolvió APS (0,0035 g) en 1 ml de DI y se añadió al recipiente de reacción para iniciar la reacción. Después de 4 h, se detuvo la reacción y las partículas preparadas se lavaron con agua desionizada. Finalmente, las nanopartículas de PNIPAAm se separaron mediante centrifugación (12.000 rpm durante 30 min) y se utilizaron en reacciones posteriores.

Preparación de magnetita (Fe ₃ O ₄ ) Nanopartículas

FeCl ₂ · 4H ₂ O (1,9 g) y FeCl ₃ · 6H ₂ Se disolvió O (5,4 g) (relación molar 1:2) en DI (100 ml) y se calentó a 70ºC. Hidróxido de amonio (NH ₄ OH; 6 ml) se añadió rápidamente a la solución, lo que inmediatamente produjo un precipitado magnético de color negro intenso. Finalmente, el Fe ₃ O ₄ La suspensión de nanopartículas se agitó durante 30 min a 70ºC. El producto se lavó varias veces con DI, después de lo cual el Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas se secaron en un evaporador rotatorio (25 mbar a 40 ° C) hasta que se formó un polvo fino. Esto se utilizó en todas las reacciones posteriores.

Preparación de nanocompuestos magnéticos de PNIPAAm por polimerización en emulsión (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1)

NiPAM (0,4 g), Fe ₃ recién preparado O ₄ Se disolvieron nanopartículas (0,2 g), BIS (0,2 g) y SDS (0,3 g) en 350 ml de DI y se calentaron a 70ºC en una atmósfera de nitrógeno. A continuación, se disolvió APS (0,0035 g) en 1 ml de DI y se añadió al recipiente de reacción para iniciar la reacción. Después de 4 h, se detuvo la reacción y el nanocompuesto preparado se lavó con DI. Finalmente, Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 se separó por centrifugación (12.000 rpm durante 30 min) y luego se secó usando un evaporador rotatorio (25 mbar a 40 ° C). El material en polvo se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente.

Preparación de nanocompuesto magnético PNIPAAm a través de precipitación in situ (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2)

FeCl ₂ (0,148 g), FeCl ₃ (0,4 g) y 10 ml de DI se mezclaron bien y se añadieron a 1 g de PNIPAAm. NH ₄ A continuación, se añadió rápidamente OH (3 ml) a la solución, lo que produjo inmediatamente un precipitado magnético de color negro intenso. Después, la suspensión se agitó durante 30 min a 70ºC. El nanocompuesto preparado se lavó con DI, después de lo cual el Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 se separó por centrifugación (12.000 rpm durante 30 min) y se secó usando un evaporador rotatorio (25 mbar a 40 ° C). El polvo resultante se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente.

Preparación de nanocompuestos magnéticos de PNIPAAm mediante adición física (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3)

PNIPAAm (1 g) recién preparado, Fe ₃ recién preparado O ₄ Se mezclaron bien nanopartículas (0,5 g) y DI (5 ml) y la suspensión resultante se agitó durante 30 min a 70ºC. El nanocompuesto así preparado se lavó con DI, tras lo cual el Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 se separó mediante centrifugación (12.000 rpm durante 30 min) y se secó usando un evaporador rotatorio (25 mbar a 40 ° C). El material en polvo se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente.

Caracterización de nanocompuestos

El tamaño y el potencial zeta del Fe ₃ O ₄ Los nanocompuestos de -PNIPAAm se midieron después de la disolución completa de las nanopartículas en DI (dispersión en DI seguida de sonificación durante 2 min a temperatura ambiente). Las mediciones del potencial Zeta se realizaron usando un analizador Zetasizer Nano (Malvern Instruments, EE. UU.) A pH 7. Se empleó una unidad de dispersión de luz dinámica (DLS) Zetasizer Nano para medir el diámetro hidrodinámico de los agregados de partículas en DI. Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) para cuantificar la cantidad de recubrimiento y determinar la estabilidad térmica del nanocompuesto. Se llevaron a cabo estudios térmicos en 3-4 mg de muestra seca a temperaturas que oscilan entre 25 y 900 ° C, utilizando un TGA Q500 (TA Instruments, EE. UU.) En una atmósfera de nitrógeno (velocidad de calentamiento 10 ° C / min). Las propiedades magnéticas del material se midieron utilizando un magnetómetro de muestra vibrante MicroMag ™ 2900 (Princeton Measuring Corporation, EE. UU.). Las imágenes de microscopía se obtuvieron usando un microscopio electrónico de barrido (SEM), las partículas se disolvieron completamente en DI y se colocó una gota de la solución en la rejilla de cobre de un SEM de emisión de campo Zeiss ULTRA Plus equipado con un cátodo Schottky. Todas las imágenes se analizaron con el software Smart SEM v 5.05 (Zeiss, Alemania) para obtener imágenes operadas a 1,5 kV.

Medios y cepas bacterianas

Escherichia coli gramnegativa CCM3954 y Staphylococcus aureus grampositivos Se utilizaron CCM 3953 (Brno, República Checa) para todos los experimentos. Se proporciona información detallada sobre las cepas en la página web de la "Colección Checa de Microorganismos" (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Cada cultivo bacteriano se preparó recientemente y se mantuvo durante la noche en un caldo de nutrientes de soja (Sigma-Aldrich) antes de realizar los experimentos biológicos.

Daño en el ADN

Los ensayos de cometas se realizaron siguiendo la metodología de Singh et al. [15] y Solanky et al. [dieciséis]. Todos los productos químicos se compraron en PENTA (República Checa) a menos que se indique lo contrario. Un cultivo bacteriano fresco (ajustado a 10 ⁷ células / ml) se cultivó durante la noche y luego se incubó con dos concentraciones (0,1 y 1 g / l) de PNIPAAm y cada uno de los Fe ₃ O ₄ -Nanocomposites de PNIPAAm durante 30 min a 37 ° C.

Se preparó un microgel poniendo 100 ml de agarosa sobre la superficie esmerilada de un portaobjetos y cubriéndolo con un cubreobjetos de 24 x 50 mm (ThermoFisher Scientific, EE. UU.). Los portaobjetos se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min, luego se retiraron los cubreobjetos y se dejaron secar los portaobjetos. Esta capa de agarosa seca (primera capa) proporcionó una base firme para las capas posteriores. Después de exponer las bacterias a PNIPAAm y Fe ₃ O ₄ -Nanocomposites de PNIPAAm durante 30 min, se tomaron 2 μl (que contenían aproximadamente 10,000 células expuestas) y se mezclaron con 100 μl de agarosa al 0.5% recién preparada. Esta mezcla se pipeteó sobre portaobjetos helados e inmediatamente se cubrió con un cubreobjetos (segunda capa). A continuación, los portaobjetos se enfriaron en una bandeja de acero sobre hielo. Los cubreobjetos se retiraron después de 1 min, y una tercera capa de 100 μl de agarosa de lisis (incluida agarosa al 0,5% con 5 μg / ml de ARNasa A [Ameresco, EE. UU.], N-lauroilsarcosina sódica al 0,25% y lisozima 0,5 mg / ml) se produjo, de nuevo utilizando un cubreobjetos. A continuación, los portaobjetos se dejaron en hielo durante 10 minutos y luego se colocaron en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 ° C. Después de retirar el cubreobjetos, los portaobjetos se sumergieron en una solución de lisis que contenía 2,5 M de NaCl, 100 mM de sal tetrasódica de EDTA, tampón tris 10 mM de pH 10, lauroil sarcosina sódica al 1% y tritón X-100 al 1%. Después de 1 h de lisis a temperatura ambiente, los portaobjetos se transfirieron a una solución de digestión enzimática que contenía 2,5 M de NaCl, 10 mM de EDTA y 10 mM tris pH 7. Cuatro tampones con 1 mg / ml de proteinasa K. Los portaobjetos se incubados a 37 ° C durante 2 h, después de lo cual se colocaron en la losa horizontal de una unidad electroforética (Scie-plas, Reino Unido) y se equilibraron con 300 mM de acetato de sodio y tampón tris pH 9 100 mM durante 20 min y luego se sometieron a electroforesis a 12 V (0,4 V / cm, aproximadamente 100 mA) durante 30 min. Después de la electroforesis, los portaobjetos se sumergieron en acetato de amonio 1 M en etanol (5 ml de acetato de amonio 10 M y 45 ml de etanol absoluto) durante 20 min, etanol absoluto durante 0,5 hy etanol al 70% durante 10 min, después de lo cual los portaobjetos se secaron al aire a temperatura ambiente. Para lograr una tinción uniforme, los portaobjetos se pretrataron con 50 ml de una solución recién preparada de tampón TE al 5% y 10 mM de NaH ₂ PO ₄ . A continuación, los portaobjetos se tiñeron con 50 µl de una solución 1 mM recién preparada de tinción SYBR (Sigma-Aldrich, EE. UU.) En tampón TE durante 30 min. La migración de las roturas de la hebra de ADN (cometas) se visualizó utilizando un microscopio de fluorescencia AxioImager con un aumento de × 400 y el software AxioVision v 4 (Zeiss, Alemania). Por lo general, se midió individualmente una longitud de cola de 50 cometas para cada muestra.

Tasa de crecimiento bacteriano, viabilidad celular y morfología

El protocolo experimental siguió el descrito en Darwish et al. [17]. Brevemente, un Fe ₃ O ₄ -Se añadió suspensión madre de nanocompuestos de PNIPAAm (10 g / l) a cultivo bacteriano fresco para obtener concentraciones finales de 0.01, 0.05, 0.5 y 1 g / l. Cada concentración se produjo por triplicado en una placa de 24 pocillos. Controles negativos, que consisten en células bacterianas solo en medios de crecimiento y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposite solo en medios de crecimiento, se corrieron en paralelo. Luego, la placa se incubó a 37 ° C, después de lo cual se midió la densidad óptica de la muestra a 600 nm (DO600) cada 2 h durante 6 h utilizando un lector de placas Synergy ™ HTX (Biotek, EE. UU.). La tasa de crecimiento bacteriano se definió como la regresión lineal R de la medición de DO600 (unidades de absorbancia, AU) frente al tiempo de incubación en horas. Las mediciones preliminares de muestras de nanocompuestos sin células (6 ha 600 nm) mostraron valores de absorbancia constantes que no interfirieron con los valores de absorbancia de nanocompuestos medidos con células bacterianas.

La concentración efectiva de nanocompuestos al 10% de inhibición (EC10) sobre la tasa de crecimiento bacteriano ( µ ) se calculó para cada forma de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm basado en la ecuación: I (%) =( µ _C - µ _T ) / µ _C × 100, donde I es inhibición, µ _C es el valor medio de la tasa de crecimiento del control y µ _T es la tasa de crecimiento del cultivo afectado por el nanocompuesto [18].

Después de 24 h de incubación, se tiñeron alícuotas de 100 μl de cada muestra con el kit de viabilidad bacteriana L7007 (Molecular Probes, Invitrogen, EE. UU.) En la oscuridad durante 15 min. La determinación de la proporción de células vivas (Ex / Em 485/528 nm) y muertas (Ex / Em 485/645 nm) se realizó usando un lector de placas Synergy ™ HTX (Biotek, EE. UU.). El porcentaje de células muertas se calculó como la proporción de células muertas a vivas. Al mismo tiempo, las imágenes de E. coli y S. aureus se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia AxioImager (Zeiss, Alemania) con Ex / Em 470 / 490–700 nm. La longitud de E. coli células y área de S. aureus Los grupos de células se determinaron con un aumento de × 600 utilizando el software AxioVision v 4 (Zeiss, Alemania).

Análisis estadístico

Diferencias entre cepas bacterianas incubadas en PNIPAAm, diferentes Fe ₃ O ₄ -Los nanocompuestos de PNIPAAm y las muestras de control sin nanocompuestos se probaron utilizando ANOVA y la prueba de Dunnett (GraphPad PRISM, EE. UU.).

Resultados

En este estudio, sintetizamos Fe ₃ O ₄ -Nanocompuesto PNIPAAm que emplea tres protocolos diferentes:polimerización en emulsión (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1), precipitación in situ (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2) y adición física (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3). Las imágenes SEM mostraron que el tipo de protocolo utilizado tenía un efecto claro en la morfología de la muestra y el tamaño de las partículas, con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 que muestra una amplia distribución de tamaño, aglomeración debido a la alta energía superficial entre nanopartículas y presencia de interacciones dipolares magnéticas ( Figura 1 ) .

Imágenes de microscopio electrónico de barrido e histogramas de PNIPAAm ( a ), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 ( b ), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 ( c ) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 ( d ). Barra de escala =200 nm

TGA indicó que el Fe ₃ O ₄ -Las muestras de PNIPAAm se volvieron relativamente estables a temperaturas superiores a 400 ° C (Fig. 2). En general, las nanopartículas de PNIPAAm mostraron un contenido residual más bajo que el Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites. Los valores de potencial zeta para la carga superficial fueron - 1,58 mV para PNIPAAm, - 15,6 mV para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, - 16,4 mV para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y - 1.8 mV para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3. Los valores del magnetómetro de muestra vibrante para la saturación de magnetización fueron 50,4 emu / g para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, 53,7 emu / g para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y 21,0 emu / g para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3. La dispersión dinámica de la luz por encima (45 ° C) y por debajo (25 ° C) LCST indicó un tamaño hidrodinámico para PNIPAAm de 50 nm a 25 ° C y 27 nm a 45 ° C; 412 nm a 25 ° C y 197 nm a 45 ° C para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1; 212 nm a 25 ° C y 130 nm a 45 ° C para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y 122 nm a 25 ° C y 60 nm a 45 ° C para Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (Figura 3).

Análisis termogravimétrico de PNIPAAm (a), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 (b), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 (c) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (d)

Dispersión dinámica de la luz por debajo (25 ° C) y por encima (45 ° C) de la transición de fase de temperatura de solución crítica más baja para PNIPAAm ( a ), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 ( b ), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 ( c ) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 ( d )

Fe ₃ O ₄ -Efecto nanocompuesto de PNIPAAm sobre el ADN bacteriano

Después de una exposición corta de 30 min, se determinaron las roturas de la hebra de ADN tanto para E. coli y S. aureus en células tratadas con Fe ₃ O ₄ -Nanocomposites de PNIPAAm, EtOH al 40% (control positivo) y células no tratadas (control negativo). Todo Fe ₃ O ₄ -Los nanocompuestos de PNIPAAm mostraron un efecto igualmente significativo ( P <0,001) en la media E. coli y S. aureus longitud de la cola del cometa en todas las concentraciones (Fig. 4), en comparación con las células de control incubadas sin nanocompuestos.

Un ejemplo de Escherichia coli cola de cometa , después del tratamiento con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 ( a ). Resultados de las roturas de la cadena de ADN (longitud de la cola del cometa) para Escherichia coli ( b ) y Staphylococcus aureus ( c ) incubadas durante 30 min con EtOH al 40% (control positivo), sin nanocomposites (control negativo), PNIPAAm (0,1 y 1 g / l) y (1) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y (3) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (las barras de error representan SD para una longitud de cometa de 50 celdas). Nivel de significancia *** P <0,001

Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm Efecto antibacteriano nanocompuesto

Las tasas de crecimiento indicaron que las S. aureus fue menos resistente que las gramnegativas E. coli a todos los nanocomposites después de 6 h de exposición. Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 inhibió fuertemente el crecimiento bacteriano, en comparación con PNIPAAm y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3, con E. coli la tasa de crecimiento se redujo significativamente de 0.08 a 0.028 ( P <0.001) con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y 0.005 ( P <0.001) con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 (1 g / l). No se observó ningún efecto sobre E. coli tasa de crecimiento por PNIPAAm o Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (Figura 5a). En comparación, la tasa de crecimiento de S. aureus fue afectado por todo el Fe ₃ O ₄ -Nanocomposites PNIPAAm y por las nanopartículas PNIPAAm. A concentraciones más bajas (0.01 g / ly 0.05 g / l), la tasa de crecimiento se redujo solo ligeramente de 0.07 a 0.06 ( P <0,05). Sin embargo, a concentraciones más altas (0.5 y 1 g / l), hubo una reducción significativa de 0.07 a 0.001 con PNIPAAm, 0.0 con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, 0.01 con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y 0.009 con Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (todos P <0,001; Figura 5b). Además, el EC10 para todos los Fe ₃ O ₄ -Nanocomposites PNIPAAm y el control de nanopartículas PNIPAAm fue menor para S. aureus que eso para E. coli (Tabla 1).

Tasa de crecimiento relativa de Escherichia coli ( a ) y Staphylococcus aureus ( b ) después de 6 h de incubación en diferentes concentraciones (0.01, 0.05, 0.5 y 1 g / l) de PNIPAAm (círculos rojos), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 (diamantes naranjas [1]), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 (triángulos verdes [2]) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (triángulos azules [3]). Las barras de error muestran la SD calculada a partir de n =3. Nivel de significancia *** P <0,001

El porcentaje de muertos E. coli las células aumentaron al aumentar la concentración de Fe ₃ O ₄ -Nanocompuesto PNIPAAm a las 24 h. PNIPAAm (0,5 y 1 g / l), por ejemplo, provocó un aumento significativo de E. coli células muertas (20%) en comparación con cultivos sin Fe ₃ O ₄ -Nanocompuesto PNIPAAm (12%). Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 (0,5 g / l) resultó en hasta un 28% de E. coli células y 32% a 1 g / l ( P <0,001). El efecto de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 fue menor que el de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3, con el porcentaje de células muertas aumentando del 13 al 25% cuando se exponen a concentraciones de 0.01 y 1 g / l, respectivamente ( P <0,001). Tanto a 0,5 como a 1 g / l, Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 resultó en alrededor del 25% de células muertas ( P <0,001; Figura 6a). El porcentaje de muertos S. aureus las células solo se vieron afectadas significativamente por 1 g / l de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3, con células muertas que alcanzan el 50 y el 48%, respectivamente ( P <0,001). El control sin nanocompuestos contenía aproximadamente el 18% de células muertas mientras que en concentraciones más bajas de PNIPAAm, Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3, la proporción de células muertas fue aún menor. PNIPAAm en concentraciones de 0.5 y 1 g / l resultó en 25 y 30% ( P <0,005) células muertas, respectivamente. Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 no tuvo ningún efecto sobre S. aureus cultivos (Fig. 6b).

Porcentaje de Escherichia coli muertas ( a ) y Staphylococcus aureus ( b ) células después de 24 h de exposición a PNIPAAm y (1) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y (3) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3. Las barras de error muestran SD de n =3. Niveles de significancia * P <0.05, ** P <0,005, *** P <0,001

No hubo diferencia en el promedio de E. coli longitud de celda (5 μm) y S. aureus área del grupo de células (200 μm ² ) para cualquier nanocompuesto o el control PNIPAAm a concentraciones más bajas (0,1 g / l; Fig. 7). A concentraciones más altas, E. coli la longitud no cambió en presencia de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2, ni S. aureus área del grupo celular en presencia de Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1. Sin embargo, E. coli la longitud aumentó significativamente en presencia de 1 g / l de PNIPAAm (5,4 μm, P <0,005), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 (6 μm, P <0.001) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (10 μm, P <0,001) (Fig. 7a), mientras que S. aureus formaron grupos más grandes cuando se expusieron a PNIPAAm (1937 μm ² , P <0,001), Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 (924 μm ² , P <0.001) y Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (1722 μm ² , P <0,001) (figura 7b).

Longitud de Escherichia coli celdas ( a ) y área del racimo de Staphylococcus aureus celdas ( b ) después de 24 h de incubación con PNIPAAm y (1) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2 y (3) Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3. Las barras de error muestran la SD determinada a partir de n =50. Niveles de significancia ** P <0.05 y *** P <0,001

Discusión

Tanto el método de síntesis como los medios por los cuales se añadieron nanopartículas magnéticas a la matriz polimérica tuvieron un claro efecto sobre las propiedades físico-químicas intrínsecas del Fe ₃ magnético. O ₄ -PNIPAAm nanocomposites. La síntesis escalonada tuvo un fuerte impacto en las propiedades de los nanocompuestos, lo que resultó en cambios en la forma de las partículas, la distribución del tamaño, el tamaño y la química de la superficie, junto con cambios posteriores en las propiedades magnéticas [19, 20]. Polimerización en emulsión (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1), un método fácil y preciso, produjo los nanocompuestos estables con distribución de tamaño de partícula estrecha y tendencia de agregación más baja, cualidades particularmente importantes en aplicaciones biomédicas [17]. Producido como resultado de la repulsión estérica y culombiana, las dimensiones de las partículas eran lo suficientemente pequeñas como para evitar la precipitación [21]. El método menos efectivo fue la adición física (Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3). No solo se produjo a través de tres pasos distintos y, por lo tanto, llevó más tiempo prepararlo, el nanocompuesto resultante mostró una mayor agregación que cualquiera de los otros dos métodos de producción. Además, nuestros resultados indicaron que Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3 producido de esta manera puede haber contenido PNIPAAm y Fe ₃ indeseables O ₄ Residuos de nanopartículas.

Los polímeros pueden adherirse a las nanopartículas magnéticas mediante enlaces físicos (no covalentes) o covalentes, y el material híbrido resultante muestra propiedades específicas según la ruta sintética tomada. Se produce una resuspensión significativa de nanopartículas magnéticas cuando la preparación avanza en el disolvente en el que se produce la formación de nanopartículas híbridas, por lo que la agregación y segregación pueden convertirse en un problema. En este caso, la formación in situ de nanopartículas magnéticas puede ser una mejor alternativa en muchos casos. Además, si la concentración de tensioactivo es demasiado baja, la coalescencia cambiará el tamaño de las gotas, mientras que se pueden formar micelas si la concentración es demasiado alta, lo que conduce a la nucleación micelar. A este respecto, es importante que la concentración de tensioactivo se elija cuidadosamente en función de la caracterización precisa de las propiedades de la superficie y el grado de modificación de las partículas, para garantizar que la superficie de las partículas inorgánicas sea compatible con la matriz del polímero.

Para evaluar las propiedades magnéticas del Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites, es importante conocer el contenido de MNPs en el nanocomposites. Se empleó TGA para cuantificar la cantidad de MNP y para investigar la estabilidad térmica de Fe ₃ O ₄ -Nanocompuestos PNIPAAm en comparación con nanopartículas PNIPAAm solas. Los tres Fe ₃ O ₄ -Los nanocompuestos de PNIPAAm mostraron una mayor estabilidad térmica que las nanopartículas de PNIPAAm, presumiblemente debido a la presencia de Fe ₃ O ₄ partículas en la matriz (Fig. 2). Los residuos más altos en los nanocompuestos magnéticos podrían atribuirse a la presencia de Fe ₃ inorgánico O ₄ compuestos en las muestras, que se mantuvieron incluso a temperaturas más altas.

Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1 mostró la mayor estabilidad térmica de nanocompuestos, junto con la menor pérdida de peso. Hasta 200 ° C, la principal fuente de pérdida de peso era la pérdida de agua y la adsorción física de la capa de polímero [22]; por encima de 200 ° C, sin embargo, las pérdidas se debieron principalmente a la descomposición de la capa química que une el PNIPAAm. El residuo de la muestra, que se estabilizó por encima de los 400 ° C, representó el 87% del peso original, lo que corresponde a la cantidad de nanopartículas magnéticas en el nanocompuesto. One aim of this preparation process was to produce a nanocomposite with magnetic properties preventing aggregation and enabling it to re-disperse rapidly as soon as the magnetic field is turned off. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ O ₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ O ₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ O ₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ O ₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe₃ O ₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli and S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ O ₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli and S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli and S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ O ₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli and S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .

Abreviaturas

Fe₃ O ₄ -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles

Estudio antitumoral de nanogeles de condroitina sulfato-metotrexato Síntesis y rendimiento in vitro de nanopartículas de hierro-platino recubiertas de polipirrol para terapia fototérmica e imágenes fotoacústicas