Nanocompuestos Fe₃O₄–PNIPAAm: El método de preparación determina la eficacia antibacteriana y el rendimiento fisicoquímico

Resumen

Los nanocompuestos magnéticos de poli(N-isopropilacrilamida) (Fe₃O₄-PNIPAAm) son prometedores para aplicaciones biomédicas y ambientales. Comparamos tres rutas de síntesis—polimerización en emulsión, precipitación in situ y adición física—para producir Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 y -3, respectivamente. Microscopía electrónica de barrido, potencial zeta, análisis termogravimétrico, magnetometría de muestra vibrante y dispersión dinámica de luz revelaron que Fe₃O₄-PNIPAAm-1 y -2 exhiben estabilidad térmica, carga superficial y magnetización superiores, indicando coloides altamente estables. Todos los compuestos, incluso a bajas concentraciones, indujeron daño significativo de ADN en Escherichia coli y Staphylococcus aureus y redujeron la viabilidad celular. Fe₃O₄-PNIPAAm-1 mostró el efecto antimicrobiano más fuerte en ambas cepas, con S. aureus mostrando mayor sensibilidad que E. coli. Estos hallazgos destacan la polimerización en emulsión como la ruta preferida para producir Fe₃O₄-PNIPAAm con propiedades antibacterianas mejoradas.

Antecedentes

Los nanocompuestos de polímero magneto-responsivos térmicamente, como Fe₃O₄–PNIPAAm, combinan respuesta magnética con el comportamiento sensible a la temperatura LCST de PNIPAAm (~32 °C). El núcleo magnético facilita la separación rápida bajo campo externo, mientras que la capa polimérica ofrece estabilidad coloidal y sitios de funcionalización para fármacos o biomoléculas. Las aplicaciones abarcan tratamiento de agua, administración de fármacos, contraste de resonancia magnética e hipertermia para terapia contra el cáncer. Se emplean tres estrategias principales de síntesis: (1) adición física de partículas pre-formadas de Fe₃O₄ y PNIPAAm; (2) precipitación in situ de Fe₃O₄ dentro de una matriz de PNIPAAm; y (3) polimerización en emulsión de N-isopropilacrilamida alrededor de Fe₃O₄. La elección del método influye en el tamaño de partícula, química superficial, magnetización y, en última instancia, el rendimiento biológico. Comprender estos efectos es esencial para diseñar nanocompuestos con estabilidad y eficacia antibacteriana óptimas.

Métodos

Reactivos

Todos los reactivos (FeCl₃·6H₂O, FeCl₂·4H₂O, NH₄OH, N-isopropil-acrilamida, BIS, SDS, APS) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Alemania) y se usaron sin purificación adicional.

Síntesis de PNIPAAm (Polimerización en emulsión)

NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) y SDS (0,3 g) se disolvieron en 350 mL agua desionizada a 70 °C bajo N₂. APS (0,0035 g) en 1 mL agua inició la polimerización; la reacción duró 4 h, tras lo cual las partículas se lavaron y recogieron por centrifugación (12 000 rpm, 30 min).

Preparación de nanopartículas Fe₃O₄

FeCl₂·4H₂O (1,9 g) y FeCl₃·6H₂O (5,4 g) (proporción molar 1:2) se disolvieron en 100 mL agua DI, se calentaron a 70 °C y precipitaron con NH₄OH (6 mL). La suspensión negra se agitó durante 30 min, se lavó repetidamente y se secó en evaporador rotatorio (25 mbar, 40 °C).

Fe₃O₄-PNIPAAm-1 (Polimerización en emulsión)

NiPAM (0,4 g), Fe₃O₄ (0,2 g), BIS (0,2 g), SDS (0,3 g) se mezclaron en 350 mL agua DI, se calentaron a 70 °C bajo N₂, y polimerizaron con APS (0,0035 g). Tras 4 h, el compuesto se lavó, centrifugó y secó.

Fe₃O₄-PNIPAAm-2 (Precipitación in situ)

FeCl₂ (0,148 g), FeCl₃ (0,4 g) y 10 mL agua DI se añadieron a 1 g PNIPAAm. NH₄OH (3 mL) indujo precipitación negra inmediata; la mezcla se agitó a 70 °C durante 30 min, se lavó, centrifugó y secó.

Fe₃O₄-PNIPAAm-3 (Adición física)

1 g PNIPAAm, 0,5 g Fe₃O₄ y 5 mL agua DI se mezclaron y agitaron a 70 °C durante 30 min. La suspensión se lavó, centrifugó y secó.

Caracterización

Tamaño y potencial zeta se midieron por DLS después de sonicación. Análisis termogravimétrico (25–900 °C, 10 °C/min, N₂) cuantificó el contenido de recubrimiento. La magnetización de saturación se registró con magnetómetro de muestra vibrante. Imágenes SEM (1,5 kV) revelaron morfología. Todas las mediciones se realizaron en triplicado.

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

E. coli CCM3954 (Gram-negativa) y S. aureus CCM3953 (Gram-positiva) se cultivaron durante la noche en caldo soja-nutrientes antes de la exposición a nanocompuestos (0,01–1 g L⁻¹).

Evaluación de daño de ADN (Ensayo Cometa)

Suspensiones bacterianas (10⁷ células mL⁻¹) se incubaron con 0,1 o 1 g L⁻¹ de cada compuesto durante 30 min a 37 °C. Se siguió el protocolo estándar de cometa (lisis, electroforesis, tinción); 50 cometas por muestra se cuantificaron usando microscopía de fluorescencia (×400).

Crecimiento, viabilidad y morfología

Las tasas de crecimiento se calcularon a partir de mediciones OD₆₀₀ cada 2 h durante 6 h. Los valores EC₁₀ se derivaron de porcentajes de inhibición. La viabilidad tras 24 h se determinó con kit live/dead (excitación 485 nm, emisión 528 nm para vivas; 645 nm para muertas). Longitud celular (E. coli) y área de racimos (S. aureus) se midieron a ×600.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron por ANOVA unidireccional seguido de prueba de Dunnett (GraphPad Prism). La significancia se estableció en P < 0,05.

Resultados

Las imágenes SEM confirmaron que Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 y -3 exhiben morfologías distintas, con Fe₃O₄-PNIPAAm-1 mostrando la distribución de tamaño más estrecha y mínima aglomeración (Figura 1). Las curvas TGA indicaron que todos los compuestos eran térmicamente estables por encima de 400 °C, con Fe₃O₄-PNIPAAm-1 reteniendo 87% de su masa, reflejando alta carga de Fe₃O₄ (Figura 2). Los potenciales zeta fueron –15,6 mV (–1,58 mV para PNIPAAm), –16,4 mV (–1,8 mV para Fe₃O₄-PNIPAAm-3), confirmando estabilidad coloidal (Figura 3). Los valores de magnetización de saturación fueron 50,4 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-1), 53,7 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) y 21,0 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-3). Las mediciones DLS a 25 °C y 45 °C revelaron cambios de tamaño dependientes de temperatura consistentes con comportamiento LCST (Figura 4).
Los ensayos cometa mostraron roturas significativas de cadenas de ADN en tanto E. coli como S. aureus tras 30 min de exposición a todos los compuestos (P < 0,001) (Figura 5). Los ensayos de tasa de crecimiento demostraron que Fe₃O₄-PNIPAAm-1 y -2 inhibieron fuertemente la proliferación bacteriana, mientras que Fe₃O₄-PNIPAAm-3 tuvo un efecto modesto (Figura 6). Los valores EC₁₀ fueron más bajos para Fe₃O₄-PNIPAAm-1, indicando la mayor potencia antibacteriana. Los ensayos de viabilidad revelaron aumentos dependientes de dosis en células muertas, con Fe₃O₄-PNIPAAm-1 alcanzando hasta 32% E. coli muertas y 50% S. aureus muertas a 1 g L⁻¹ (Figura 7). El análisis morfológico mostró alargamiento de E. coli y formación de racimos en S. aureus a concentraciones más altas, reflejando respuestas de estrés.

Discusión

La ruta de síntesis influye marcadamente en los atributos fisicoquímicos de los nanocompuestos Fe₃O₄-PNIPAAm. La polimerización en emulsión produce partículas con homogeneidad de tamaño óptima, carga superficial y magnetización, facilitando dispersión rápida y fuerte acción antibacteriana. La precipitación in situ ofrece estabilidad térmica comparable pero ligera mayor agregación, mientras que la adición física resulta en las propiedades menos deseables y efecto antimicrobiano más débil. El daño de ADN observado probablemente surge del estrés oxidativo y disrupción de membrana inducidos por núcleos de Fe₃O₄, corroborado por reportes previos de genotoxicidad de nanopartículas basadas en Fe. La actividad superior de Fe₃O₄-PNIPAAm-1 subraya la importancia de la síntesis controlada para aplicaciones biomédicas como recubrimientos antimicrobianos, apósitos para heridas y administración dirigida de fármacos.

Conclusiones

Los nanocompuestos Fe₃O₄-PNIPAAm preparados via polimerización en emulsión (Fe₃O₄-PNIPAAm-1) exhiben la combinación más favorable de estabilidad térmica, carga superficial, magnetización y eficacia antibacteriana contra tanto E. coli como S. aureus. La precipitación in situ (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) y la adición física (Fe₃O₄-PNIPAAm-3) producen compuestos menos estables y menos potentes. Estos hallazgos respaldan el uso de polimerización en emulsión para generar materiales Fe₃O₄-PNIPAAm adecuados para aplicaciones antimicrobianas clínicas y ambientales.

Abreviaturas

Fe₃O₄-PNIPAAm

Poli(N-isopropilacrilamida) magnética

MNPs

Nanopartículas de magnetita