Nanocompuestos de poli (N-isopropilacrilamida) pirrol sensibles a la luz del infrarrojo cercano para la terapia quimio-fototérmica del cáncer

Resumen

La terapia combinada basada en nanocompuestos multifuncionales se ha considerado un enfoque prometedor para mejorar la eficacia terapéutica del cáncer. Aquí, informamos poli ( N ) multifuncional dirigido nanocompuestos basados en isopropilacrilamida) (PNIPAM) para la terapia quimio-fototérmica sinérgica hacia las células del cáncer de mama. Para aumentar la temperatura de transición, se añadió ácido acrílico (AAc) en el proceso sintético de PNIPAM, lo que demuestra que la temperatura intrínseca inferior de la solución crítica se cambió a 42 ° C. Para generar el efecto fototérmico bajo irradiación con láser de infrarrojo cercano (NIR) (808 nm), se decoraron uniformemente nanopartículas de polipirrol (ppy) en PNIPAM-AAc. El ácido fólico (FA), como ligando dirigido al cáncer, se conjugó con éxito en los grupos carboxilo excedentes en la red PNIPAM. La liberación del fármaco de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se desencadenó de manera eficiente en respuesta al cambio de temperatura por irradiación con láser NIR. También confirmamos que PNIPAM-ppy-FA se internalizó en las células de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante endocitosis mediada por receptores de folato y mejoró significativamente la eficacia terapéutica del cáncer con el tratamiento combinado de efectos quimio-fototérmicos. Por lo tanto, nuestro trabajo fomenta una mayor exploración de agentes nanoportadores multifuncionales para enfoques terapéuticos sinérgicos para diferentes tipos de células cancerosas.

Introducción

El sistema de administración de fármacos (DDS) es uno de los métodos poderosos de administrar un compuesto farmacéutico para lograr un efecto terapéutico en la terapia del cáncer [1]. Aunque el objetivo del DDS es administrar el fármaco activo y acumularse en el área deseada, el DDS convencional suele ir acompañado de efectos secundarios graves y una eficacia terapéutica ineficaz [2, 3]. Para superar estos obstáculos, se han desarrollado una variedad de nanoportadores, que tienen la capacidad de responder a estímulos internos o externos específicos que incluyen temperatura, luz, pH, campo eléctrico, oxidación-reducción, actividad enzimática y concentración de antígeno, para DDS avanzado y utilizado para inducir la liberación sostenida y controlada de fármacos [4, 5, 6].

Uno de los diversos estímulos, el nanoportador termosensible, es un método poderoso para mejorar el tratamiento del cáncer, porque los fármacos en nanopartículas podrían liberarse a una determinada temperatura [7]. Además, la ventaja de las nanopartículas termosensibles podría combinarse con otros estímulos para inducir la erradicación completa del cáncer [8, 9]. Como nanopartícula termosensible, poli ( N -isopropilacrilamida) (PNIPAM) ha recibido la mayor atención, porque exhibe una transición de fase a una temperatura de solución crítica más baja (LCST) de alrededor de 32 ° C [10, 11]. Por debajo de la LCST, toda la red de polímeros en PNIPAM existe en un estado hinchado debido a los enlaces de hidrógeno. Por otro lado, PNIPAM transita al estado hidrófobo y los enlaces de hidrógeno se reducen, lo que resulta en un colapso de la red de polímeros por encima de la LCST [12, 13]. En comparación con otras nanopartículas, el nanoportador basado en PNIPAM tiene la ventaja de una alta eficiencia de encapsulación del fármaco, una capacidad de liberación controlada del fármaco y una buena biocompatibilidad [14]. Sin embargo, debido a la liberación espontánea del fármaco a la temperatura corporal, el nanoportador basado en PNIPAM no es suficiente para su uso en DDS avanzado. Para superar esto, los estudios anteriores agregaron los ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido vinil acético, acrílico y alil acético) en el proceso sintético de PNIPAM, lo que resultó en la reducción de los efectos secundarios por la liberación continua del fármaco [15].

Recientemente, varios estudios se han centrado en nuevos enfoques terapéuticos en los que la integración de dos o más estímulos desencadenan nanopartículas para mejorar la eficacia terapéutica del cáncer [16, 17, 18]. Por ejemplo, la terapia fototérmica (PTT) presenta varias ventajas, como el control preciso de la luz en los tumores, la penetración no invasiva y la baja toxicidad para las células normales [19, 20]. Para combinar las nanopartículas con PTT, los agentes fototérmicos (por ejemplo, nanovarillas de oro, nanotubos de carbono, polipirrol (ppy) y óxido de grafeno) deben encapsularse uniformemente en nanopartículas basadas en PNIPAM [21, 22, 23]. El estudio anterior fabricó nanobarras de oro mesoporosas recubiertas de sílice con una cáscara PNIPAM sensible al pH y al calor y exploró más a fondo las aplicaciones de la terapia del cáncer in vivo [24]. Sin embargo, estos nanocompuestos basados en PNIPAM requieren un proceso sintético de varios pasos. Además, dado que los nanocompuestos no tenían una fracción dirigida contra células cancerosas específicas, podrían causar efectos secundarios graves en otros órganos o tejidos normales. En nuestro informe anterior, desarrollamos un sistema de liberación controlada bidireccional utilizando las propiedades termosensibles y sensibles al pH de PNIPAM [15]. Los nanogeles de PNIPAM se copolimerizaron con contenido de ácido acrílico (AAc) para un control eficaz de la LCST. Para mejorar mejor la focalización del cáncer y la eficacia terapéutica, desarrollamos la terapia combinada de focalización del cáncer utilizando efectos quimio- y fototérmicos (Esquema 1). A medida que aumenta la temperatura por irradiación con láser NIR, se liberaron los fármacos de nanocomposites PNIPAM termo-sensibles y posteriormente se activó el efecto fototérmico. Debido al ácido fólico conjugado (FA), los nanocompuestos basados en PNIPAM mostraron una eficacia terapéutica significativamente mejorada hacia las células de cáncer de mama MDA-MB-231.

Materiales y métodos

Materiales

NIPAM, N, N ′ -Metilenbisacrilamida (MBA), persulfato de potasio (KPS, 99%), N- (3-dimetilaminopropil) - N Clorhidrato de ′ -etilcarbodiimida (EDC) y N -La hidroxisuccinimida (NHS) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La polivinilpirrolidona (PVP) y el pirrol (98%) se obtuvieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EE. UU.). AAc se adquirió de Dae Jung Chemicals &Materials. Co. Ltd (Corea). FA-PEG-amina (FA-PEG-NH ₂ , PM:5 kDa) fue proporcionado por Nanocs, Inc. (Nueva York, NY, EE.UU.). El clorhidrato de doxorrubicina (Dox) se obtuvo de Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokio, Japón). Todos los productos químicos y materiales se utilizaron comercialmente sin purificación adicional.

Síntesis de nanopartículas PNIPAM-AAc decoradas con ppy

El PNIPAM termo-sensible copolimerizado con nanopartículas AAc se sintetizó de acuerdo con el informe anterior [15]. Se disolvieron 1,13 g de monómero NIPAM, 0,077 g de MBA y 0,136 g de AAc en 100 ml de agua desionizada y se añadieron en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 250 ml. Después de 30 min, se aumentó la temperatura de reacción a 80ºC y se agitó vigorosamente durante 1 h. Para inducir la polimerización, se añadió KPS (1,5 mg) a la mezcla, seguido de agitación durante 4 h. La mezcla se dializó contra una membrana de diálisis de 12-14 kDa de corte de peso molecular (MWCO) en agua desionizada durante 7 días para eliminar el monómero sin reaccionar, el iniciador, los iones dispensables y la nanopartícula de PNIPAM-AAc se obtuvo mediante liofilización durante 48 h. Para funcionalizar el efecto fototérmico, ppy se decoró en nanopartículas PNIPAM-AAc [25]. Se agregaron rápidamente PVP (50 y 100 mg) y monómero de pirrol (50 y 100 μL) en 10 mg / mL de solución de PNIPAM-AAc y se agitaron durante 12 ha temperatura ambiente. Luego, se insertó KPS (3,4 mg) en la solución de PNIPAM-AAc y se agitó adicionalmente durante 14 h. El PNIPAM-AAc decorado con ppy se centrifugó tres veces con agua destilada. El PNIPAM-ppy-5 y PNIPAM-ppy-10 se obtuvieron mediante liofilización durante 48 h.

Síntesis de nanocompuestos PNIPAM-ppy dirigidos al cáncer

Para obtener nanocompuestos PNIPAM-ppy dirigidos al cáncer (PNIPAM-ppy-FA), se disolvieron 10 mg de PNIPAM-ppy en solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 ml, pH 5,5) y se sometieron a ultrasonidos durante 5 min. Se añadieron EDC (15 mg, 0,078 mmol) y NHS (15 mg, 0,13 mmol) a la solución de PNIPAM-ppy. Después de 1 h, FA-PEG-NH ₂ (5 mg) y se agitó adicionalmente durante la noche. FA-PEG-NH ₂ sin reaccionar , EDC y NHS en solución PNIPAM-ppy se eliminaron mediante una membrana de diálisis (MWCO 6-8 kDa) y los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se liofilizaron durante 48 h.

Síntesis de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA cargados con fármacos anticáncer

Se disolvieron 10 mg de PNIPAM-ppy-FA en agua desionizada y se sometieron a ultrasonidos durante 5 min. Se añadió gota a gota 0,5 mg / ml de Dox a la solución de PNIPAM-ppy-FA, agitando vigorosamente a temperatura ambiente. El Dox no cargado se eliminó mediante centrifugación (14.000 rpm, 10 min) y se purificó con agua desionizada. Se obtuvo PNIPAM-ppy-FA (Dox @ PNIPAM-ppy-FA) cargado con Dox mediante liofilización durante 48 h.

Caracterización de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA termorresponsables y NIR

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japón) para caracterizar el tamaño, la morfología y la distribución de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA. Para la medición de TEM, las muestras se prepararon colocando una gota de la solución de muestra en agua desionizada (concentración:1 g / L) sobre una rejilla de cobre de malla 200 recubierta con carbón. La distribución de tamaño y la carga superficial de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA, que se disolvieron en agua desionizada y se sometieron a ultrasonidos durante 5 min, se midieron utilizando un Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Reino Unido). La modificación de la superficie y la unión química de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se confirmaron mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR). Los espectros FT-IR se registraron en los gránulos de KBr utilizando un instrumento Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., EE. UU.) En el rango de 400 a 4000 cm ⁻¹ a una resolución de 4 cm ⁻¹ . La propiedad óptica y la capacidad de carga Dox en nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se observaron mediante espectroscopía UV-Vis (UV 1800, Shimazu, Japón).

Propiedad fototérmica y fotoestabilidad de NIR y nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA termo-sensibles

La propiedad fototérmica de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA cargados con Dox (Dox @ PNIPAM-ppy-FA) se evaluó mediante la detección de cambios de temperatura en tiempo real. Dox @ PNIPAM-ppy-FA se disolvió en solución acuosa con diferentes concentraciones de 0.05, 0.1 y 0.2 mg / mL y se irradió durante 20 min utilizando un láser NIR de 808 nm (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) a una densidad de potencia de 2 W / cm ² . La influencia de la densidad de potencia del láser NIR se estudió mediante la irradiación de láser NIR durante 20 min con una densidad de potencia de 1, 2 y 3 W / cm ² , respectivamente. Además, para investigar la estabilidad fototérmica frente al láser NIR, se expuso la solución Dox @ PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg / ml) durante 15 minutos y después del proceso de enfriamiento natural cinco veces. Durante la irradiación con láser NIR, la temperatura de la solución Dox @ PNIPAM-ppy-FA se midió mediante un termopar conectado a un termómetro digital (DTM-318, Tecpel Co., Taiwán) cada 60 s durante 15 min.

Liberación de NIR y de fármaco termo-sensible de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA

Para estudiar los perfiles de liberación de Dox por termorrespuesta, se prepararon soluciones de Dox @ PNIPAM-ppy-FA (1 mg / mL) en viales de 5 mL y luego se agitaron a 25, 37 y 50 ° C. En un tiempo de liberación definido (0 a 72 h), el sobrenadante de cada muestra se recogió por centrifugación y se reemplazó con un volumen igual de medio fresco. La cantidad de Dox liberada de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se estimó mediante la medición de espectroscopía UV-Vis a 480 nm. Además, el comportamiento de liberación de Dox a través de la solución Dox @ PNIPAM-ppy-FA respondida a estímulos láser NIR (1 mg / ml) se agitó vigorosamente a 37 ° C y se irradió durante 10 min en puntos de tiempo predeterminados (1, 2, 3 , 4 y 5 h). Como control, se utilizó la solución Dox @ PNIPAM-ppy-FA sin irradiación con láser NIR. El Dox liberado se determinó mediante el método mencionado anteriormente.

Análisis de citotoxicidad de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA

La citotoxicidad de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA, incluidos PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA, se verificó utilizando un ensayo MTT. Se sembraron células A549 y MDA-MB-231 en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ células por pocillo en 200 µL de medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO ₂ . Después de 1 día, se trataron 200 µL de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA con varias concentraciones (20-100 µL) en cada célula y la placa se incubó durante 24 h. Las células se lavaron con DPBS y luego el medio se reemplazó con medio fresco con agente MTT (0,5 mg / ml). Después de otra incubación durante 4 h, el medio se retiró con cuidado y se añadieron 200 µl de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán púrpura internalizados. La absorción se midió a 595 nm utilizando un lector de microplacas iMark ™ (Bio-rad, Hercules, CA, EE. UU.).

Análisis de absorción celular de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA

Para evaluar la capacidad de direccionamiento a células cancerosas específicas de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA, se sembraron células A549 y MDA-MB-231 en una placa de 8 pocillos (ibidi, Munich, Alemania) a una densidad de 2 × 10 ⁴ células / mL y se incubaron durante 24 h. A continuación, las células se incubaron con nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA (60 µg / ml) durante 6 h. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con DPBS para eliminar los nanocompuestos restantes y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Después del tratamiento con Triton-X al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente, las células se tiñeron finalmente con Alexa Fluor 488 phalloidin (1:200, Invitrogen, EE. UU.) Durante 1 día a 4 ° C y 4,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) durante 10 min, respectivamente. Las imágenes de captación celular se observaron mediante el uso de un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Alemania).

Efectos anticancerígenos mejorados de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA mediante irradiación láser NIR

La eficacia terapéutica mejorada utilizando NIR y PNIPA-ppy-FA termosensible en células de cáncer de mama se investigó mediante el ensayo MTT. MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ células / ml) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Luego, las células se lavaron con DPBS y se añadieron nanocomposites PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA a varias concentraciones (20, 40, 60, 80 y 100 μg / mL) en cada pocillo de una manera dependiente de la concentración. . Después de la incubación durante la noche, se retiró el medio, seguido de la adición de medio nuevo. Para los grupos de irradiación con láser NIR, las células se trataron con 5 W / cm ² durante 5 min. Luego, se lavaron MDA-MB-231 con DPBS y se añadió el medio fresco que incluía la solución de MTT. Después de 4 h, el medio se retiró con cuidado y se añadieron 200 μL de DMSO en cada pocillo. Finalmente, se midió la absorbancia a 595 nm mediante un lector de microplacas iMark ™ para determinar la viabilidad celular. Como otro método para la observación de los efectos terapéuticos del cáncer, se llevó a cabo el ensayo de vivos y muertos. Se trataron PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA (60 μg / mL) en MDA-MB-231. Después de 24 h, MDA-MB-231 se expuso con o sin irradiación láser NIR (5 W / cm ² , 5 min) y se tiñeron con calceína AM y homodímero-1 de etidio. Después de 30 min, las células se lavaron varias veces con DPBS. Las imágenes vivas / muertas se obtuvieron mediante microscopía de fluorescencia invertida (Olympus Ix73, Japón).

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de nanocompuestos PNIPAM-ppy dirigidos al cáncer NIR y termo-sensibles

Para la generación de nanocompuestos basados en PNIPAM termo-sensibles, se fabricaron nanopartículas de PNIPAM-AAc mediante un método de polimerización por radicales [15]. Para controlar LCST mediante irradiación con láser NIR, se cubrió ppy mediante reacción de polimerización en PNIAPM-AAc preparado. El PNIPAM-ppy-FA dirigido al cáncer se sintetizó conjugando químicamente FA-PEG-NH ₂ al grupo carboxilo en PNIPAM-AAc. De acuerdo con las imágenes TEM de la Fig. 1a, se observaron la morfología, el tamaño y la dispersión de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA. El PNIPAM-AAc tal como se preparó mostró la forma homogénea con un diámetro medio de 274,32 ± 11,62 nm. Después de la decoración del ppy, PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA mostraron tamaños similares con 275,99 ± 11,41 y 285,77 ± 17,92 nm. El tamaño de PNIPAM-ppy-FA cargado con Dox aumentó ligeramente de 285,77 ± 17,92 a 290,73 ± 12,28 nm, lo que indica que los fármacos contra el cáncer se cargaron en nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA [26]. Curiosamente, en comparación con PNIPAM-AAc, la presencia de ppy dentro de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se mostró claramente por pequeños puntos negros. Además, debido a la cadena PEG, los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se dispersaron bien en solución acuosa sin agregación [27]. Los diámetros hidrodinámicos promedio de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA se midieron mediante análisis DLS (archivo adicional 1:Fig. S1). Los diámetros de PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA fueron 432, 450,7, 468,6 y 486,7 nm, respectivamente. Debido a los diferentes métodos analíticos, el diámetro de cada nanocompuesto era mayor que el de TEM, pero el tamaño de partícula y la distribución de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA exhibieron una tendencia similar.

Para investigar la influencia de ppy polimerizado en PNIPAM-AAc, los valores LCST de PNIPAM-AAc y Dox @ PNIPAM-ppy-FA se midieron a diferentes temperaturas (Fig. 1b). En comparación con nuestro trabajo anterior [15], la LCST de Dox @ PNIPAM-ppy-FA fue ligeramente menor que la de PNIPAM-AAc (42 ° C). Esta diferencia podría ser causada por la reducción de grupos carboxilo en PNIPAM-AAc debido a ppy polimerizado y ligando conjugado dirigido al cáncer [28]. Posteriormente, monitoreamos el cambio de tamaño de partícula dependiendo de la temperatura en la Fig. 1c. Para ello, se midieron los diámetros de PNIPAM-AAc y Dox @ PNIPAM-ppy-FA en el rango de temperatura de 25 a 50 ° C. A medida que aumentó la temperatura, PNIPAM-AAc disminuyó de 436 a 177 nm. Además, el tamaño de Dox @ PNIPAM-ppy-FA se redujo en gran medida de 630 a 420 nm, lo que indica que los nanocompuestos PNIPAM decorados con ppy no afectó mucho las aplicaciones de DDS controladas y con respuesta térmica [27].

Los valores de potencial zeta de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA mostraron el cambio de superficie de los nanocompuestos antes y después de la modificación (Fig. 2a). El potencial zeta de PNIPAM-AAc fue -37,1 ± 1,61 mV debido a los grupos carboxilo en AAc [29]. Los valores de PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA aumentaron a - 29,6 ± 0,96 y - 15,6 ± 0,26 mV, lo que indica que el polipirrol cargado positivamente y FA-PEG-NH ₂ se introdujeron con éxito en nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA [27]. Debido al Dox cargado negativamente, el potencial zeta de Dox @ PNIPAM-ppy-FA cambió a cargas más negativas (- 28,6 ± 0,23 mV). Como se muestra en la Fig. 2b, la síntesis exitosa de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA se confirmó mediante espectroscopía FT-IR. El espectro de PNIPAM-AAc mostró los picos de vibración de estiramiento de C-N y CH ₂ entre 1100 y 1200 cm ⁻¹ y los picos de C =O, N – H y COOH se observaron a 1545, 1645 y 1750 cm ⁻¹ , que pertenecía a PNIPAM-AAc [15]. El polipirrol en PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA demostró los picos adicionales a 935 y 1050 cm ⁻¹ fueron observados [30]. En los espectros de PNIPAM-ppy-FA, los nuevos picos de vibración aparecieron a 1107 y 2880 cm ⁻¹ , que se atribuye a C – O – C de la cadena PEG. Este resultado indicó la conjugación química exitosa de FA-PEG-NH ₂ [31]. Sin embargo, FT-IR no detectó el ligando de direccionamiento de FA porque su estructura era similar a la de PEG. Para confirmar la presencia de FA en nanocompuestos PNIPAM, se realizaron PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy y PNIPAM-ppy-FA mediante espectroscopía UV-Vis (Fig. 2c). Mientras que los espectros de PNIPAM-AAc y PNIPAM-ppy (sin FA) no mostraron ningún pico de absorción, PNIPAM-ppy-FA mostró el pico adicional a 280 nm, que fue distintivo en FA [32]. Este resultado apoyó que las moléculas de FA se injertaron en nanocompuestos basados en PNIPAM.

Propiedad fototérmica de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA mediante irradiación láser NIR

Para utilizar nanocompuestos basados en PNIPAM para la terapia fototérmica, se examinó la propiedad óptica de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA mediante espectroscopía UV-Vis. Como se muestra en la Fig. 2c, PNIPAM-AAc no mostró ninguna absorbancia en la región NIR (λ =700-1000 nm). Sin embargo, los espectros de PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA obviamente mostraron la fuerte absorbancia en el mismo rango debido a las nanopartículas de ppy polimerizadas. Estos resultados de absorbancia demostraron que los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA podrían convertir la luz NIR en calor [26]. A continuación, evaluamos la propiedad fototérmica de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA mediante irradiación con láser NIR (Fig. 3). Para optimizar el efecto fototérmico, se prepararon PNIPAM-FA (sin pirrol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μL) y PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) a la misma concentración (0,1 mg / mL). ) y luego se expusieron a irradiación láser NIR de 808 nm a una densidad de 2 W / cm ² durante 20 min (Fig. 3a). La temperatura de PNIPAM-ppy-10-FA aumentó a 14,5 ° C, que fue 2 veces más alta que la de PNIPAM-ppy-5-FA. Como control, se irradió PNIPAM-FA sin ppy, pero la temperatura aumentó de manera insignificante (2,4 ° C). Por lo tanto, elegimos PNIPAM-ppy-10-FA para investigar experimentos fototérmicos adicionales. Para observar los cambios de temperatura por concentraciones, se irradió láser NIR a PNIPAM-ppy-FA a diferentes concentraciones (0.05, 0.1 y 0.2 mg / mL). En la Fig. 3b, dependiendo de la concentración, la temperatura aumentó a 10, 14,5 y 18 ° C, respectivamente. Además, la solución PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg / ml) se irradió con varias densidades de potencia láser (1-3 W / cm ² ) en la Fig. 3c. Como era de esperar, el aumento de temperatura del nanocompuesto dependía en gran medida de la potencia del láser. Posteriormente, observamos la estabilidad fototérmica de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA en la Fig. 3d. Aunque la irradiación con láser NIR se realizó de forma repetida al menos 5 veces, la temperatura aumentó constantemente a 33 ° C, lo que demuestra que el nanocompuesto PNIPAM-ppy-FA era un nanoportador adecuado como terapia fototérmica.

Liberación de fármacos con respuesta térmica y NIR de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA

Para evaluar los perfiles de liberación de fármacos a través de NIR y termorespuesta, analizamos las propiedades de encapsulación y liberación de los nanocompuestos Dox @ PNIPAM-ppy-FA. Inicialmente, medimos los espectros de absorción UV-Vis del PNIPAM-ppy-FA cargado con el fármaco y se observó un fuerte pico de absorción cerca de 480 nm (Fig. 2c). Este resultado indicó que Dox se cargó con éxito en nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA. La eficiencia de carga Dox de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA se calculó al 15% utilizando la curva de calibración Dox (datos no mostrados). En la Fig. 4a, se estudió el perfil de liberación de Dox de PNIPAM-ppy-FA a diferentes temperaturas. Observamos el comportamiento de liberación de Dox durante 72 ha 25 ° C, 37 ° C y 50 ° C y la liberación acumulada de Dox de PNIPAM-ppy-FA fue del 15%, 42% y 67%, respectivamente. Dado que la LCST de PNIPAM-ppy-FA disminuyó ligeramente a 42 ° C, se encontró que la liberación acumulada a la temperatura corporal era relativamente más alta que la temperatura ambiente. Se liberó una gran cantidad de Dox, sin embargo, el Dox liberado no afectó la eficacia terapéutica, porque los nanocompuestos Dox @ PNIPAM-ppy-FA podrían internalizarse solo en células positivas para receptores de folato, como se describió anteriormente [26, 32]. Por encima de LCST (50 ° C), la cantidad de Dox de los nanocompuestos PNIAPM-ppy-FA se liberó cuatro veces más alta que la temperatura ambiente, lo que sugiere que los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA podrían usarse en un sistema de liberación controlada de fármacos a través de una respuesta térmica. Además, investigamos el comportamiento de liberación desencadenado por luz NIR de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA en la Fig. 4b. La solución Dox @ PNIAPM-ppy-FA (1 mg / ml) se expuso a láser NIR (3 W / cm ² ) irradiación durante 10 min y esta operación se repitió cada 1 h. Durante 6 h, la cantidad total de Dox mediante irradiación con láser NIR alcanzó el 35%, mientras que el perfil de liberación de Dox sin irradiación con láser NIR mostró alrededor del 5% y el 15% (25 ° C y 37 ° C). Este resultado mostró que la irradiación con láser NIR dio como resultado una temperatura más alta que la LCST de los nanocompuestos e indujo la liberación de Dox de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA.

Análisis de citotoxicidad y absorción celular de nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA

Según la literatura, se investigó la citotoxicidad de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA hacia las células de cáncer de pulmón y de mama (Archivo adicional 1:Fig. S2) [33, 34]. Independientemente de las concentraciones de la muestra, después de la incubación con PNIPAM-ppy-FA durante 24 h, se observaron ambas viabilidades celulares (> 85%). Por lo tanto, nuestros nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA no mostraron citotoxicidad como nanoportador para aplicaciones de administración de fármacos [35, 36]. Para investigar si PNIPAM-ppy-FA podría entregar selectivamente a las células cancerosas, examinamos las señales fluorescentes de nanocomposites intracelulares PNIPAM-ppy-FA utilizando microscopía de barrido láser confocal (archivo adicional 1:Fig. S3). Los comportamientos de captación celular de PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA se evaluaron en líneas celulares negativas para el receptor de folato (A549) y positivas (MDA-MB-231) [37]. Después de incubar células de cáncer de mama MDA-MB-231 con Dox @ PNIPAM-ppy-FA, se observó una fuerte fluorescencia roja, lo que muestra que Dox @ PNIAPM-ppy-FA se internalizó en lisosomas de células MDA-MB-231. De manera constante, cuando se trataron PNIPAM-ppy-FA y Dox @ PNIPAM-ppy-FA con células A549, no se observaron señales de Dox. Estas imágenes confocales demostraron que los nanocompuestos PNIAPM-ppy-FA podrían internalizarse selectivamente en células cancerosas sobreexpresadas por receptores de folato a través de la vía de endocitosis mediada por receptores, como se describió anteriormente [38, 39].

Efectos anticáncer quimio-fototérmicos de NIR y nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA termo-sensibles

Para confirmar la eficacia terapéutica de la combinación in vitro de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA, los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA se evaluaron en células MDA-MB-231 con o sin irradiación láser NIR y las viabilidades celulares se evaluaron mediante el ensayo MTT en la figura 5a. . Para la terapia fototérmica, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 con PNIPAM-ppy-FA se incubaron durante 12 hy posteriormente se expusieron a láser NIR (5 W / cm ² , 5 minutos). La viabilidad celular de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 disminuyó a 70-90% dependiendo de las concentraciones de PNIPAM-ppy-FA. Para confirmar el único efecto quimioterapéutico, se trataron nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA cargados con Dox. Observamos que las viabilidades disminuyeron al 50% debido a la liberación de Dox de los nanocompuestos, correspondiente al perfil de liberación de la Fig. 4. Curiosamente, después de la irradiación con láser NIR en las células MDA-MB-231 con nanocompuestos Dox @ PNIPAM-ppy-FA, la la viabilidad celular disminuyó drásticamente hasta un 24%, que fueron más altos que los de los grupos de control (PNIPAM-ppy-FA con irradiación con láser NIR, Dox @ PNIPAM-ppy-FA sin irradiación con láser NIR). Este resultado indicó un efecto de sinergia óptimo de la terapia de combinación quimio-fototérmica mediada por irradiación con láser NIR. Además, para observar directamente la eficacia terapéutica en las células cancerosas, se realizó el ensayo vivo / muerto en la Fig. 5b. Como grupo de control, observamos la viabilidad de solo células MDA-MB-231 con o sin irradiación láser NIR (5 W / cm ² , 5 min) y la mayoría de las células mostraron fluorescencia verde (células vivas). Demostró que la irradiación con láser NIR no afectó evidentemente la viabilidad celular. Además, las células MDA-MB-231 con PNIPAM-ppy-FA bajo irradiación con láser NIR mostraron una pequeña fluorescencia roja (células muertas), lo que indica un efecto terapéutico fototérmico causado por los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA. A pesar de que no hubo irradiación con láser NIR en las células MDA-MB-231 con Dox @ PNIPAM-ppy-FA, se observó una fluorescencia roja esporádica, lo que indica quimioterapia. Además, cuando las células MDA-MB-231 se trataron con nanocompuestos e irradiación con láser NIR, la mayoría de las células cancerosas exhibieron una pequeña fluorescencia roja [39, 40]. Estos resultados respaldaron los efectos terapéuticos sinérgicos de la terapia quimio-fototérmica a través de la irradiación láser NIR y los nanocompuestos termo-sensibles Dox @ PNIPAM-ppy-FA.

Conclusión

Hemos construido con éxito un NIR dirigido al cáncer y nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA termo-sensibles para la terapia de combinación quimio-fototérmica. Para inducir la liberación controlada y el efecto fototérmico mediante irradiación con láser NIR de 808 nm, se decoraron uniformemente nanopartículas ppy en PNIPAM-AAc mediante el método de polimerización. PNIPAM-ppy-FA cargado con Dox mostró un efecto fototérmico y una fotoestabilidad significativos. Además, Dox @ PNIPAM-ppy-FA mostró propiedades favorables de transición termosensible en diferentes condiciones y la liberación del fármaco de los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA podría controlarse mediante la luz NIR y la termorespuesta. Los estudios in vitro verificaron que los nanocompuestos PNIPAM-ppy-FA mostraron una excelente biocompatibilidad y una eficacia terapéutica mejorada hacia las células de cáncer de mama. Esta mayor eficacia contra el cáncer a través de nanocompuestos contribuyó a las siguientes razones:(1) captación celular específica de nanocompuestos en endocitosis mediada por receptores de folato, (2) liberación acumulada de Dox de PNIPAM-ppy-FA a través de NIR y termorespuesta, y (3) ) efecto terapéutico sinérgico por combinación quimio-fototérmica. Por lo tanto, nuestro nanocompuesto PNIPAM-ppy-FA podría usarse potencialmente como un nanoportador multifuncional para enfoques terapéuticos sinérgicos hacia diferentes tipos de cánceres con efectos secundarios reducidos.

Disponibilidad de datos y materiales

Los datos y el análisis del trabajo actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Abreviaturas

PTT:: Terapia fototérmica
NIR:: Infrarrojo cercano
FA:: Ácido fólico
FA-PEG-NH ₂ :: Amina FA-PEG
LCST:: Baja temperatura crítica de la solución
PNIPAM:: Poli ( N -isopropilacrilamida)
ppy:: Polipirrol
TEM:: Microscopía de transmisión
UV – Vis:: Espectroscopía ultravioleta visible

Nanoskeína de polianilina:método sintético, caracterización y detección redox Absorción óptica mejorada en células solares en tándem de perovskita / Si con matriz de nanoagujeros

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

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Especias