Compuesto de puntos cuánticos de carbono-pórfirina de platino: Agente teranóstico de doble función para terapia fotodinámica de cáncer mejorada

Resumen

Los fotosensibilizadores (PS) son notoriamente hidrofóbicos, limitando su utilidad clínica en terapia fotodinámica (PDT). Para superar esto, diseñamos un nuevo nanoagente teranóstico, CQDs@PtPor, mediante unión electrostática de un complejo de porfirina tetraplatinada (PtPor) a puntos cuánticos de carbono (CQDs) cargados negativamente. Caracterización exhaustiva (XRD, TEM, XPS, FTIR) confirmó el ensamblaje exitoso de CQDs y PtPor en una sola nanoestructura. El análisis espectroscópico reveló transferencia de energía por resonancia eficiente desde CQDs a PtPor, resultando en producción marcadamente mejorada de oxígeno singlete (¹O₂). Estudios in vitro en células HeLa demostraron que CQDs@PtPor logró fototoxicidad superior comparado con PtPor libre exhibiendo citotoxicidad oscura despreciable, subrayando su potencial como plataforma terapéutica contra el cáncer segura y efectiva.

Antecedentes

La PDT ha emergido como estrategia no invasiva para tratar trastornos cutáneos, degeneración macular y varios cánceres ^[1]. La terapia se basa en PS activados por luz que generan especies reactivas de oxígeno (ROS) tras irradiación, matando selectivamente células tumorales mientras preservan tejido sano ^[2-6]. Aunque PS activables como derivados de porfirina y ftalocianina pueden servir roles duales en imagen y terapia, su traducción clínica se ve obstaculizada por pobre solubilidad acuosa, fotosensibilidad cutánea prolongada, penetración tisular limitada y absorción subóptima más allá de 700 nm ^[7-11]. Varios nanocarriers —liposomas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de oro, nanotubos de carbono, grafeno y puntos cuánticos de carbono (CQDs)— se han explorado para mejorar entrega y rendimiento de PS ^[12-22].

Los CQDs, una clase versátil de nanomateriales de carbono, exhiben propiedades ópticas excepcionales, alta solubilidad en agua, baja toxicidad, excelente biocompatibilidad y funcionalización superficial fácil ^[23-27]. Sus abundantes grupos superficiales permiten unión covalente o no covalente de fármacos, proteínas o ligandos diana, volviéndolos portadores atractivos para aplicaciones teranósticas ^[31-33]. Estudios previos demostraron que CQDs conjugados con PS (ej. Ce6, ZnPc, TMPyP) pueden mejorar imagen de fluorescencia y eficacia fotodinámica mediante mecanismos de transferencia de energía ^[34-36].

Recientemente, un complejo de porfirina tetraplatinada exhibió baja citotoxicidad oscura pero valores IC₅₀ tan bajos como 19 nM tras irradiación a 420 nm, indicando actividad anticancerígena potente ^[37]. Sin embargo, su hidrofobicidad y biocompatibilidad limitada impiden uso clínico. Por tanto diseñamos CQDs@PtPara aprovechar la solubilidad y química superficial de CQDs mientras retenemos la potencia terapéutica de PtPor. El ensamblaje electrostático entre PtPor cargado positivamente y CQDs cargados negativamente no solo mejora dispersabilidad en agua sino que también promueve transferencia de energía, amplificando generación de ¹O₂ y fototoxicidad.

Métodos

Materiales
Diacetato de trans-platino (trans-platino) (Aladdin®), 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF) (Sigma-Aldrich), y todos los solventes se compraron de Tianjin Fu Chen Chemical Reagents o Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Todos los reactivos se usaron tal como se recibieron.

Síntesis de [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Tetra(4-piridil)-Porfirina Nitrato

Trans-platino (0.193 mmol, 58 mg) y AgNO₃ (0.193 mmol, 33 mg) se disolvieron en 5 mL DMF y agitaron 24 h. El precipitado blanco de AgCl resultante se removió por centrifugación, produciendo solución clara. Esto se añadió a una suspensión de 5,10,15,20-Tetra(4-piridil)porfirina (0.487 mmol, 30 mg) en 3 mL DMF, seguido por agitación a 50 °C durante 48 h. Tras enfriar, se añadieron 10 mL éter dietílico para precipitar el producto rojo, que se lavó con metanol, diclorometano y éter. Secado al vacío dio 81 mg de producto (86 % rendimiento). La estructura se confirmó por ¹H RMN y ESI-MS.

Preparación de CQDs

Ácido cítrico (0.45 g) y etilendiamina (500 µL) se disolvieron en 10 mL agua DI y sometieron a tratamiento hidrotérmico a 200 °C por 5 h en autoclave revestido PTFE. La solución marrón-negra resultante se purificó por centrifugación y diálisis contra agua DI para obtener CQDs.

Preparación del Compuesto CQDs@PtPor

PtPor (20 mg en 3 mL DMSO) se dispersó en 12 mL agua y se añadió lentamente a una suspensión de CQDs (5 mg en 15 mL H₂O) bajo sonicación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente 24 h, luego purificó por centrifugación y diálisis 2 días. La solución acuosa final se liofilizó a 4 °C para obtener el compuesto.

Medición de Rendimiento Cuántico

El rendimiento cuántico (Φ) de CQDs se calculó relativo a sulfato de quinina (Φ_st ≈ 54 %) usando método comparativo estándar. La absorbancia se mantuvo bajo 0.1 a 360 nm para evitar efectos de reabsorción.

Generación de Oxígeno Singlete

Muestras (5 mg mL⁻¹) se mezclaron con 10 mM DPBF en cubeta 3 mL e irradiaron con lámpara xenón 50 W (filtro pasa-largo 500 nm, 6 mW cm⁻²) hasta 30 min. La disminución de absorbancia DPBF a 415 nm se monitorizó cada 3 min para cuantificar producción de ¹O₂. Fluorescencia DCFH (λ_em = 525 nm) también se usó como sonda cualitativa.

Ensayos de Citotoxicidad

Células HeLa se cultivaron en DMEM con 5 % FBS, 100 U mL⁻¹ penicilina y 100 µg mL⁻¹ estreptomicina a 37 °C, 6 % CO₂. Para citotoxicidad oscura, células se incubaron con concentraciones variables de CQDs, PtPor o CQDs@PtPor 24 h, luego evaluaron por ensayo MTT. Para fototoxicidad, células se irradiaron tras 24 h incubación, y viabilidad se determinó nuevamente por MTT.

Imagen Celular

Células HeLa (5 × 10⁴ células mL⁻¹) se incubaron con 0.25 mg mL⁻¹ CQDs@PtPor 1 h, lavaron, e imagaron por microscopía confocal (Zeiss LSM7 DUO) usando láser 405 nm.

Resultados

Preparación y Caracterización de CQDs@PtPor

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló partículas uniformes, monodispersas: CQDs promediaron 2.5 nm, mientras CQDs@PtPor promediaron 7.6 nm, reflejando adsorción de PtPor (Fig. 1). Patrones XRD mostraron pico ancho a ~23°, indicativo de estructura de carbono amorfo. Espectros FTIR confirmaron presencia de grupos hidroxilo, amino y amida (Fig. 2b). Dispersión dinámica de luz (DLS) midió diámetro hidrodinámico medio de 9.2 nm para CQDs@PtPor, corroborando datos TEM. Potencial zeta cambió de -15.6 mV (CQDs libres) a +4.5 mV tras conjugación con PtPor, confirmando unión electrostática (Fig. 3d).

Compuesto de puntos cuánticos de carbono-pórfirina de platino: Agente teranóstico de doble función para terapia fotodinámica de cáncer mejorada — Figura 1. Imágenes TEM (izquierda) y histogramas de distribución de tamaño (derecha) de a) CQDs y b) CQDs@PtPor.

Propiedades Foto-físicas

Espectros UV-Vis mostraron absorción característica CQD (~360 nm) y bandas Soret/Q de porfirina (~425, 520, 580 nm). CQDs exhibieron fotoluminiscencia (PL) dependiente de excitación con emisión desplazándose de 460 a 552 nm en excitación 280-500 nm, y rendimiento cuántico de 36 %. En el compuesto, intensidad PL a 500 nm disminuyó mientras emisión a 660 nm aumentó, evidenciando transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) eficiente. Medidas de vida de fluorescencia confirmaron vida donante acortada en CQDs@PtPor, apoyando transferencia de energía (Fig. 4).

Producción Mejorada de Oxígeno Singlete

Experimentos de degradación DPBF revelaron que CQDs@PtPor produjo significativamente más ¹O₂ que PtPor libre, mientras CQDs solos mostraron actividad despreciable (Fig. 5a). Fluorescencia DCFH corroboró hallazgos, con CQDs@PtPor produciendo señal más fuerte (Fig. 5b).

Fototoxicidad en Células HeLa

Ensayo de citotoxicidad oscura mostró >90 % viabilidad a 50 µg mL⁻¹ para todas las muestras (Fig. 6a). Ensayos de fototoxicidad, sin embargo, demostraron reducción dependiente de dosis en viabilidad: CQDs@PtPor a 50 µg mL⁻¹ logró solo 8 % supervivencia, superando PtPor (18 %) y CQDs (90 %) (Fig. 6b). Esta eficacia superior se atribuye a generación mejorada de ¹O₂ mediada por CQDs.

Captación Celular y Estabilidad

Imagen confocal reveló que CQDs@PtPor se localizó predominantemente en citoplasma de células HeLa, con fluorescencia azul CQD solapando emisión roja PtPor, indicando formación estable de complejo post-captación (Fig. 7).

Discusión

La pronunciada FRET desde CQDs a PtPor, evidenciada por emisión donante reducida y vida acortada, se traduce directamente en mayor producción de ¹O₂ y fototoxicidad mejorada. El tamaño pequeño (~10 nm) de CQDs@PtPor facilita acumulación tumoral vía efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR), mientras la dispersabilidad en agua mejorada y biocompatibilidad reducen toxicidad sistémica. La naturaleza modular del ensamblaje electrostático permite fácil sustitución de diferentes PS o ligandos diana, posicionando CQDs@PtPor como plataforma versátil para PDT personalizada.

Conclusiones

Hemos fabricado exitosamente un nanoagente CQDs@PtPor que combina propiedades ópticas superiores de CQDs con potente actividad anticancerígena de porfirina tetraplatinada. El compuesto exhibe alta estabilidad acuosa, baja toxicidad oscura, transferencia de energía eficiente y eficacia fotodinámica marcadamente mejorada in vitro. Estos atributos hacen de CQDs@PtPor un candidato prometedor para futura traducción clínica en terapia contra el cáncer.