Carbon Dots @ Platinum Porfirina Composite como nanoagente teranóstico para una terapia fotodinámica eficaz contra el cáncer

Métodos

El dicloruro de transplatino diamina (transplatino) se adquirió de Aladdin®. El 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) se obtuvo de Sigma-Aldrich. Todos los disolventes se adquirieron en Tianjin Fu Chen Chemical Reagents. Los otros productos químicos se compraron a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. y se utilizaron tal como se recibieron.

Síntesis de [Trans-PtCl (NH ₃ ) ₂ ] ₄ -5,10,15,20-Tetra (4-piridil) -Nitrato de porfirina

Se disolvieron transplatino (0,193 mmol, 58 mg) y nitrato de plata (0,193 mmol, 33 mg) en 5 ml de DMF. Después de hilar durante 24 h, el cloruro de plata blanco formado se eliminó de la solución turbia resultante mediante centrifugación para adquirir la solución transparente, que luego se añadió a la suspensión de 5,10,15,20-tetra (4-piridil) porfirina. (0,487 mmol, 30 mg) en 3 ml de DMF. Después de agitar a 50 ° C durante 48 h, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. Luego, se agregaron 10 ml de éter dietílico para obtener el precipitado rojo, que luego se lavó con metanol, diclorometano y éter dietílico. Finalmente, la muestra se secó al vacío para adquirir 81 mg de producto. Rendimiento 86%. ¹ RMN H (400 MHz; DMSO-d ₆ ):δ 9.45 (d, 8H), 9.14 (s, 8H), 8.52 (m-piridilo, d, 8H), 4.70 (NH ₃ , s, 24 H), - 3,04 (s, 2 H); EM (ESI): m / z =1209 [M-3 (NO ₃ ) -2 {PtCl (NH ₃ ) ₂ }] ⁺ , 1074 [M-4 (NO ₃ ) -2 {PtCl (NH ₃ ) ₂ } -2NH ₃ -Cl-2H] ⁺ , 883 [M-4 (NO ₃ ) -3 {PtCl (NH ₃ ) ₂ }] ⁺ , 866 [M-4 (NO ₃ ) -3 {PtCl (NH ₃ ) ₂ } -NH ₃ ] ⁺ , 812 [M-4 (NO ₃ ) -3 {PtCl (NH ₃ ) ₂ } -Cl-2 (NH ₃ )] ⁺ , 574 [M-4 (NO ₃ ) -2 {PtCl (NH ₃ ) ₂ }] ²⁺ .

Preparación de los CQD

Generalmente, se disolvió ácido cítrico (0,45 g) y etilendiamina (500 μL) en agua DI (10 mL). Luego, la solución se transfirió a un autoclave revestido con poli (tetrafluoroetileno) (teflón) (30 ml) y se calentó a 200ºC durante 5 h. Después de la reacción, los reactores se enfriaron a temperatura ambiente con agua o de forma natural. El producto crudo, que era de color marrón oscuro, se purificó en una centrífuga durante 30 min para eliminar las partículas aglomeradas y luego se dializó contra agua desionizada para obtener los CD.

Preparación de los CQDs @ PtPor composite

La molécula de PtPor, que tiene cuatro cargas positivas en un anillo de piridina, puede unirse a las superficies de los CQD con carga negativa a través de una interacción electrostática para obtener el compuesto CQDs @ PtPor. En general, se dispersaron 20 mg de PtPor disueltos en 3 ml de DMSO en 12 ml de agua. La solución se añadió lentamente a la suspensión de CQD (5 mg de CQD disueltos en 15 ml de H ₂ O) bajo sonicación. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 h, la solución se purificó en una centrífuga durante 30 min para eliminar las partículas aglomeradas y luego se dializó contra agua desionizada durante 2 días. La solución acuosa de CQDs @ PtPor se liofilizó a 4 ° C para producir el producto deseado.

El cálculo de los rendimientos cuánticos de CQD

El rendimiento cuántico de CQD se midió con sulfato de quinina como referencia (0,1 M H ₂ SO ₄ solución acuosa, rendimiento cuántico fluorescente ∼ 54%) mediante la siguiente ecuación:

Donde Φ es el rendimiento cuántico de fluorescencia, I es la pendiente de las curvas y η es el índice de refracción del disolvente. El subíndice "st" se refiere a la referencia de rendimiento cuántico conocido (sulfato de quinina en 0,1 M H ₂ SO ₄ ). La absorción se mantuvo por debajo de 0,1 a la longitud de onda de excitación de 360 ​​nm para minimizar la reabsorción.

Generación de oxígeno singlete

Se irradió una solución de la muestra y 3-difenilisobenzofurano en una cubeta de vidrio (3 mL), a temperatura ambiente. Se midió la disminución de la absorción de DPBF a 415 nm a intervalos de irradiación de 3 min hasta 30 min. La producción de oxígeno singlete se evaluó cualitativamente a través del DPBF, un extintor de oxígeno singlete. El porcentaje de disminución de la absorción de DPBF, proporcional a la producción de ¹ O ₂ , se evaluó por la diferencia entre la absorbancia inicial y la absorbancia después de un período determinado de irradiación. Cada experimento se repitió tres veces.

Ensayo de citotoxicidad de CQD, PtPor y CQD @ PtPor

Se cultivaron células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 5%, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 μg / ml a 37 ° C y CO2 al 6% ₂ . El ensayo de viabilidad del metiltiazoliltetrazolio (MTT) se realizó de acuerdo con un método estándar. En resumen, las células HeLa (3 × 10 ³ / pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos durante 24 h antes de la exposición a los fármacos. Las células se trataron con muestras durante la noche en la oscuridad. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de reducción de MTT. Las monocapas de células se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubaron con 50 μL de solución de MTT (0,5 mg / ml) a 37 ° C durante 3 h. Una vez que se retiraron los medios, se agregaron 100 μL de DMSO. La solución se agitó durante 30 min para disolver los cristales de formazán formados en células vivas. La absorbancia se midió a una longitud de onda dual, 540 nm y 690 nm, en un lector de microplacas Labsystem Multiskan (Merck Eurolab, Suiza). Cada concentración dosificada se realizó en pocillos por triplicado y se repitió dos veces para el ensayo MTT.

La fotocitotoxicidad de las muestras se evaluó mediante un protocolo similar. En general, las células HeLa (3 × 10 ³ por pocillo) se incubaron en placas de 96 pocillos durante 24 h antes de su exposición a los fármacos. Las células se trataron con las muestras en la oscuridad durante la noche. Posteriormente, las células se expusieron a una lámpara de xenón de 50 W equipada con un filtro de aislamiento térmico y un filtro de paso largo de 500 nm durante 10 min. La tasa de fluencia fue de 6 mW / cm ² . La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de reducción de MTT.

Aplicaciones de bioimagen de CQDs @ PtPor

Las imágenes celulares se evaluaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Células HeLa (5 × 10 ⁴ células por pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron adherir durante 12 h. A continuación, las células se trataron con CQDs @ PtPor (0,25 mg / ml) a 37 ° C durante 1 h. Después de eso, el sobrenadante se eliminó cuidadosamente y las células se lavaron tres veces con PBS. Posteriormente, los portaobjetos se montaron y observaron mediante microscopio confocal (Microscopio confocal de barrido láser Zeiss; LSM7 DUO) utilizando el software ZEN 2009 (Carl Zeiss).

Resultados

Preparación de CQDs @ PtPor

Los CQD se prepararon mediante una reacción hidrotermal en un recipiente de acuerdo con el método descrito en la literatura [38], como se muestra en el Esquema 1. El PtPor se sintetizó mediante la complejación de transplatino sustituido con 5, 10, 15, 20-Tetra (4-piridil ) porfirina según el método notificado [37]. Dado que la molécula de PtPor tiene cuatro cargas positivas en el anillo de piridina, que podrían unirse a las superficies de los CQD con carga negativa a través de una interacción electrostática, produciendo el compuesto CQD @ PtPor deseado.

Caracterización de CQDs @ PtPor

Las imágenes del microscopio electrónico de transmisión (TEM) (Fig. 1 a la izquierda) muestran que los CQD y CQD @ PtPor preparados están distribuidos homogéneamente con tamaños uniformes. El tamaño de partícula que se muestra en la Fig. 1 a la derecha es estrecho (1–9 nm) y el tamaño promedio, determinado por el histograma, es de 2,5 y 7,6 nm para CQD y CQD @ PtPor, respectivamente. El tamaño medio de los CQD @ PtPor es mayor que el de los CQD, probablemente debido a la adsorción de la molécula de PtPor en la superficie de los CQD a través de una interacción electrostática.

Imágenes TEM (izquierda) e histogramas de distribución de tamaño correspondientes (derecha) de a CQD y b CQDs @ PtPor

La Figura 2a muestra el patrón de difracción de rayos X (XRD) de los CQD sintetizados. El pico ancho de XRD de las CQD aparece alrededor de 23 °, lo que indica la estructura desordenada de las CQD [39]. Los grupos funcionales de CQD se caracterizaron por espectroscopia FTIR. Como se muestra en la Fig. 2b, los picos anchos de 3000 a 3500 cm ⁻¹ se atribuyen a vibraciones de estiramiento O-H y N-H, lo que indica la presencia de grupos hidroxilo y amino. Los picos a 1150 y 1230 cm ⁻¹ se atribuyen a las vibraciones de estiramiento C-O y C-N, respectivamente. El enlace amida se confirma mediante los picos típicos a 1678 y 1392 cm ⁻¹ , atribuyéndose a las vibraciones de las amidas C =O y C-N, respectivamente. Finalmente, el pico a 1600 cm ⁻¹ se identifica como enlace C =C / C =N. En comparación con los resultados de FTIR del ácido cítrico, los CQD no mostraron ninguna absorción característica significativa de ácido cítrico (CA), lo que indica que el CA debería carbonizarse principalmente durante el proceso de hidrólisis. Además, un nuevo pico agudo a 1700 cm ⁻¹ , se encontró adscrito al enlace amida, lo que indica que la etilendiamina debe funcionalizarse en la superficie de los CQD a través del enlace -CONH-. El diámetro medio y la distribución del tamaño de partícula de CQD y CQD @ PtPor se determinaron mediante la medición DLS (archivo adicional 1:Figura S1 y Fig. 2c). Como se muestra en la Fig. 2c, el tamaño medio de los CQD @ PtPor es de aproximadamente 9,2 nm, lo que concuerda con el resultado de la prueba TEM. La medición del potencial zeta se realizó además para confirmar la conjugación entre CQD y PtPor. Como se muestra en la Fig. 3d, el potencial zeta de los CQD libres es - 15,6 mV, debido a las cargas negativas en la superficie. Después de la conjugación con PtPor, el potencial zeta del compuesto CQDs @ PtPor se cambió a 4.5 mV, lo que indica la cobertura exitosa de CQDs por las moléculas PtPor.

Patrón XRD de CQD ( a ). El espectro FTIR de CQD ( b ). Distribución del tamaño de partícula de CQDs @ PtPor medida por dispersión dinámica de luz ( c ). Potencial Zeta de CQD y CQD @ PtPor ( d )

Espectro de levantamiento XPS ( a ) y C 1s ( b ), N 1s ( c ) y O 1s ( d ) espectros XPS de alta resolución de CQD

Se realizó espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para investigar más a fondo la composición química de los CQD (Fig. 3) y CQDs @ PtPor (Archivo adicional 1:Figura S2). El espectro de levantamiento de CQD en la Fig. 3a indica que los elementos de existencia en la superficie son C, N y O, con las señales relacionadas en 535, 402 y 283 eV, respectivamente [40]. La señal C 1s que se muestra en la Fig. 3b tiene tres picos distintos a 284,4 eV, 286,3 eV y 288,2 eV, que se asignan al enlace C-C, enlace C-O y enlace C =O, respectivamente. El XPS N 1 de alta resolución que se muestra en la Fig. 3c está equipado con tres picos, con energías de unión a 395,3, 399,1 y 402,2 eV, correspondientes al N similar a piridina, N pirrólico y N cuaternario, respectivamente [41]. La deconvolución de O 1 exhibió los picos C-O y O-H (Fig. 3d), lo que indica la existencia de grandes grupos carboxílicos en la superficie de las CQD.

Propiedades fotofísicas de CQDs @ PtPor

Se analizaron los espectros de fluorescencia y absorción de UV-Vis para investigar las propiedades fotofísicas del material compuesto. Como se muestra en la Fig. 4a, el compuesto CQDs @ PtPor mostró los picos característicos de CQDs y porfirina. Por ejemplo, un pico de absorción significativo alrededor de 360 ​​nm probablemente se asignó a la transición n → π * de los CQD [42], mientras que los picos alrededor de 425 nm, 520 nm y 580 nm se atribuyeron a las bandas de dolor y Q de la porfirina. , respectivamente. La solución acuosa de CQD muestra emisión azul bajo la irradiación de una lámpara ultravioleta (UV) de 365 nm. Además, los CQD exhibieron el comportamiento PL dependiente de la excitación, donde el pico de emisión cambió de 460 a 552 nm cuando la longitud de onda de excitación cambió de 280 a 500 nm, como se muestra en la Fig. 4b. El rendimiento cuántico de fluorescencia de las CQD preparadas fue del 36% con sulfato de quinina como referencia.

Absorción UV-Vis ( a ) y fluorescencia ( b ) espectros de CQD, PtPor y CQD @ PtPor. Espectros de fluorescencia ( c ) de CQD con diferentes longitudes de onda de excitación. La fluorescencia decae ( d ) de CQD y CQD @ PtPor. La concentración de muestras:CQD (5 μg / mL), CQD @ PtPor (5 μg / mL, 3 μg / mL) y PtPor (3 μg / mL)

Discusión

El efecto de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en el compuesto CQDs @ PtPor podría investigarse comparando la intensidad de fluorescencia de CQDs @ PtPor con CQDs y PtPor. Los espectros de fluorescencia y las intensidades de CQD, PtPor y CQD @ PtPor con la misma concentración se midieron bajo la excitación de 360 ​​nm (Fig. 4c). Dado que los CQD mostraron una absorción muy fuerte a 360 nm (Fig. 4a) con un rendimiento cuántico de PL tan alto como 36%, emite una fluorescencia muy fuerte. Por el contrario, como la absorción de PtPor a 360 nm es muy baja y su rendimiento cuántico de PL es inferior al 1%, el PtPor presenta una emisión muy débil. Sorprendentemente, la intensidad de la emisión azul (500 nm) en los CQD @ PtPor disminuyó obviamente en comparación con los CQD libres, mientras que la emisión roja (660 nm) se mejora significativamente en relación con la de PtPor solo, lo que indica la transferencia de energía eficiente en el compuesto CQDs @ PtPor . La vida útil de la fluorescencia de los CQD en el compuesto CQD @ PtPor disminuyó en relación con la de los CQD libres, como se muestra en la Fig. 4d. Una disminución tan evidente en la vida útil del donante indica además la transferencia de energía de resonancia efectiva de los CQD a PtPor en el compuesto CQDs @ PtPor.

Dado que la producción de oxígeno singlete es un factor clave en la TFD, el ¹ O ₂ La generación se determinó mediante un método químico utilizando 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) como ¹ O ₂ carroñero. En general, la intensidad de absorción de DPBF disminuirá gradualmente en presencia de oxígeno singlete. Por lo tanto, la tasa de disminución de la intensidad de absorción de DPBF puede usarse para evaluar el rendimiento relativo de oxígeno singlete. En este experimento, se mezclaron CQD (5 mg / mL), PtPor (5 mg / mL) o CQDs @ PtPor (5 mg / mL) con DPBF (10 mM), respectivamente, seguido de la irradiación con lámpara de xenón. Como se muestra en la Fig. 5a, después de la adición de CQD, la absorción de DPBF no mostró ningún cambio con la prolongación del tiempo de irradiación, lo que indica que los CQD no tenían una producción significativa de oxígeno singlete. Además, el compuesto CQDs @ PtPor exhibió una degradación muy obvia de DPBF, que es mucho más alta que la de PtPor, lo que indica que el ¹ O ₂ el rendimiento de porfirina podría mejorarse bajo el papel de los CQD. Mientras tanto, la producción de ¹ O ₂ se cuantificó adicionalmente utilizando el reactivo de diclorofluoresceína (DCFH). La fluorescencia verde (λ _em =525 nm) de DCFH aumenta cuantitativamente cuando reacciona con ¹ O ₂ generado a partir de los fotosensibilizadores. Como se muestra en la Fig. 5b, el compuesto CQDs @ PtPor mostró una mayor eficiencia de ¹ O ₂ producción que la de puro PtPor. Este resultado es muy consistente con el obtenido por el método DPBF.

Generación de oxígeno singlete de CQD, PtPor y CQD @ PtPor a partir del método DPBF ( a ) y método DCFH ( b )

La citotoxicidad de CQD, PtPor y CQD @ PtPor en células HeLa se evaluó mediante el ensayo de metiltiazoliltetrazolio (MTT). Como se muestra en la Fig. 6a, las tres muestras exhibieron una citotoxicidad insignificante contra las células HeLa después del tratamiento durante 24 h en la oscuridad. Más del 90% de las células cancerosas aún estaban vivas y su concentración aumentó a 50 μg / ml, lo que sugiere que las tres muestras no tuvieron ningún efecto adverso sobre las células cancerosas en la oscuridad. Además, la fotocitotoxicidad de tres muestras se evaluó adicionalmente utilizando un método similar. Como se muestra en la Fig. 6b, después del tratamiento de células cancerosas con CQDs @ PtPor durante 24 h seguido de irradiación de luz, la viabilidad celular disminuyó gradualmente con el aumento de la concentración de la muestra. Cuando la concentración de CQD @ PtPor fue de 50 μg / mL, la tasa de supervivencia de las células cancerosas fue solo del 8%, que aparentemente fue más baja que la de PtPor solo (18%) y CQD (90%). Es decir, el compuesto CQDs @ PtPor exhibió una eficacia terapéutica más fuerte que el de PtPor solo, lo que sugiere que CQDs @ PtPor es ventajoso sobre la formulación convencional, que probablemente se atribuye a la eficiencia mejorada de la generación de oxígeno singlete de PtPor por CQDs.

Citotoxicidad oscura ( a ) y fotocitotoxicidad ( b ) de CQD, PtPor y CQD @ PtPor en diferentes concentraciones

La captación celular de CQD puros, PtPor y CQD @ PtPor se estudió utilizando un microscopio de barrido láser confocal bajo excitación de un láser de 405 nm. Como se muestra en la Fig. 7, el compuesto CQDs @ PtPor se distribuye principalmente en el citoplasma de las células HeLa. Además, las imágenes de fluorescencia azul de los CQD casi se superponen con la emisión roja de la de PtPor en el compuesto CQDs @ PtPor, lo que indica que los CQDs y PtPor permanecieron en estado de unión después de que el compuesto CQDs @ PtPor ingresara en las células. Estos resultados verifican que el compuesto CQDs @ PtPor es estable en el entorno celular y aún podría realizar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia en las células.

Las imágenes de microscopía de fluorescencia confocal de células HeLa bajo excitación de 405 nm después del tratamiento con 50 μg / ml de CQD puros ( a - c ), PtPor ( d - f ) y CQD @ PtPor ( g - yo ) durante 24 h. un , d , g Campo Claro. b , e , h El canal de imágenes CQDs, detectado en la región de longitud de onda de 410–450 nm. c , f , yo El canal de imágenes PtPor, detectado con la región de paso largo de 590 nm; (barra de escala =20 μm)

Conclusiones

Se diseñó y desarrolló con éxito un nuevo nanoagente teranóstico (CQDs @ PtPor) a través de la interacción electrostática entre el complejo de porfirina tetraplatinizada (PtPor) y los CQD cargados negativamente. El compuesto CQDs @ PtPor preparado exhibió alta dispersabilidad en agua, buena estabilidad y biocompatibilidad, y mejor detección de fluorescencia por fotosensibilizador. El efecto PDT de CQDs @ PtPor se mejoró significativamente en comparación con el de PtPor solo, lo que sugiere que CQDs @ PtPor es ventajoso sobre la formulación convencional debido a la eficiencia mejorada de ¹ O ₂ generación de PtPor por CQDs. Por lo tanto, este nanoagente basado en CQD mostró una eficacia terapéutica mejorada sobre las células cancerosas, así como bajos efectos secundarios in vitro, mostrando un gran potencial para aplicaciones en la clínica para tratar pacientes con cáncer en un futuro cercano.

Historial de cambios

Abreviaturas

CA:

Ácido cítrico

CQD:

Puntos cuánticos de carbono

DPBF:

1,3-difenilisobenzofurano

EDA:

Etilendiamina

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio

PDT:

Terapia fotodinámica

PS:

Fotosensibilizadores

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

UV:

Ultravioleta

XPS:

Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

XRD:

Difracción de rayos X

Transporte Spin-Polarized y Spin Seebeck Effect en Triple Quantum Dots con Acoplamientos Interdot Spin-Dependientes Síntesis en solución fácil de nanopartículas de fósforo rojo para ánodos de baterías de iones de litio