Nanopartículas de oro bioconjugadas compatibles con el medio ambiente como agentes de contraste eficaces para la obtención de imágenes de cáncer inducido por inflamación

Resumen

Para muchos cánceres, la detección temprana es la clave para mejorar la supervivencia y reducir la morbilidad, que se asocia con resecciones radicales por diagnóstico tardío. Aquí, describimos la eficiencia de las nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos primarios (AuNP) para apuntar específicamente a procesos inflamatorios crónicos, especialmente macrófagos M2, en secciones de tejido de colitis ulcerosa (CU) y esteatohepatitis en ratas que pueden conducir a cáncer colorrectal y carcinoma de hígado. respectivamente. En este estudio, demostramos que los AuNP sintetizados mediante un método simple, económico y compatible con el medio ambiente se pueden conjugar fácilmente con los anticuerpos anti-COX-2, anti-MIF y Alexa Fluor® 488 (ALEXA) para realizar tinción de inmunofluorescencia en inflamados. tejidos. Además, mostramos que las nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos primarios (AuNP) se pueden usar para apuntar a macrófagos M2 mediante citometría de flujo. Diseñamos tres protocolos de tinción de inmunofluorescencia de sección de tejido con AuNP durante 30 min e incubación durante la noche, así como un protocolo de citometría de flujo de etiquetado de macrófagos M2 con AuNP durante 30 min. Los resultados de inmunofluorescencia y citometría de flujo sugieren que la conjugación se logró mediante la adsorción directa de anticuerpos en la superficie de AuNP. En comparación con el protocolo estándar de ALEXA en inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo (FC), nuestro protocolo de incubación de 30 minutos con AuNP en lugar de ALEXA disminuyó de aproximadamente 23 ha 5 h para IF y de 4 ha 1 h para FC, resultando menos laborioso, lo que hace que el método sea apto para el diagnóstico de cáncer inducido por inflamación.

Introducción

En la investigación médica y biológica, está aumentando el interés por las nanopartículas de oro (AuNP) para estudios de microscopía óptica y procedimientos de diagnóstico, especialmente microscopía láser confocal. El uso de conjugados de anticuerpos / AuNP permite la detección en tiempo real de la captación de oro en células vivas (p. Ej., Células cancerosas) a nivel de partículas individuales, lo que permite la estimación de cantidades intracelulares de NP [1,2,3].

Las propiedades fisicoquímicas de las AuNP permiten su uso en muchos estudios médicos, como genómica, biosensibilidad, inmunoensayo, química clínica, detección y fototermólisis de microorganismos y células cancerosas [1]. Faulk y Taylor [4] describieron el primer método de conjugación de anticuerpos con oro coloidal para la visualización microscópica electrónica directa de los antígenos de superficie de las salmonelas. Desde entonces, se han desarrollado numerosos estudios dirigidos a la aplicación de nanopartículas conjugadas con biomacromoléculas, como anticuerpos, lectinas y enzimas, en diferentes campos, por ejemplo, bioquímica, microbiología, inmunología y morfología [1, 4]. En los estudios de cáncer, los agentes de contraste basados en AuNP altamente específicos y sensibles se utilizan para las modalidades de imágenes ópticas y de rayos X, ya que las AuNP pueden mejorar la intensidad de la fluorescencia de las moléculas conjugadas [5, 6].

En 2014, demostramos que las AuNP se pueden aplicar al método de tinción de inmunofluorescencia indirecta (IF) en cultivos celulares [6]. En el presente estudio, describimos tres nuevos métodos para la tinción por inmunofluorescencia (IF) utilizando AuNP. Aquí, usamos secciones de tejido y comparamos la intensidad de fluorescencia de cada uno de estos métodos con el protocolo de tinción estándar con el anticuerpo Alexa Fluor® 488 (ALEXA) (A1) con el objetivo de optimizar una técnica fluorescente para la aplicación clínica [7,8,9 ].

Las imágenes de fluorescencia (FI) para la selección de células cancerosas utilizan una variedad de tecnologías de imágenes ópticas para mejorar la detección de neoplasias precoces basadas en firmas moleculares específicas para el cáncer [10]. Desde 2013, ha habido un rápido aumento en el número de ensayos clínicos que utilizan FI. Generalmente, se considera la detección para pacientes de alto riesgo, que se basa en una combinación de factores de estilo de vida, genética o antecedentes personales de enfermedad, mientras que la vigilancia se reserva para pacientes con un diagnóstico de displasia / inflamación crónica o aquellos con sospecha de malignidad. FI puede ayudar a identificar lesiones malignas con una mayor especificidad y sensibilidad en comparación con las técnicas actualmente disponibles. Además, el cribado basado en IF puede proporcionar una forma menos invasiva y más rentable de detectar lesiones cancerosas o precancerosas. Específicamente, la capacidad de la IF para detectar lesiones antes que los métodos de detección convencionales no solo dará como resultado mejores resultados del tratamiento, sino también reducirá los costos del tratamiento, ya que evitará la necesidad de atención multimodal, que es necesaria para aquellos diagnosticados en el diagnóstico posterior [11]. . En este estudio, demostramos que los conjugados de anticuerpos / AuNP se pueden aplicar con éxito para obtener imágenes de la inflamación crónica mediante microscopía de fluorescencia.

Métodos / Experimental

Objetivo del estudio

El objetivo de este estudio es demostrar cómo se pueden utilizar las propiedades de fluorescencia de las nanopartículas de oro en técnicas de IF y citometría de flujo. Además, comparamos los protocolos probados con AuNP con el protocolo estándar que usa ALEXA y demostramos que es posible usar AuNP en un protocolo, que es más rápido, pero tan confiable como el protocolo estándar.

Productos químicos y reactivos

El tricloruro de oro (30% en peso en HCl), la polivinilpirrolidona (PVP, PM =10.000), el hidróxido de sodio, la membrana de celulosa del tubo de diálisis y el glicerol eran productos de Sigma-Aldrich Chemical Co (Saint Louis, EE. UU.). El ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno se adquirieron de Vetec (Río de Janeiro, Brasil). La solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la albúmina de suero bovino (BSA, 5%) se adquirieron de Life Technologies Corporation © (California, EE. UU.). Anti-COX-2 (ciclooxigenasa-2 ) y anticuerpos primarios anti-MIF (factor inhibidor de la migración de macrófagos) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (São Paulo, Brasil), mientras que el anticuerpo secundario IgG H&L Alexa Fluor® 488 anti-rata de cabra se adquirió de ABCAM® (Cambridge, Reino Unido). Para la contratinción de ADN se utilizó el medio de montaje Fluoroshield con DAPI (20 ml) de ABCAM® (Cambridge, Reino Unido).

Producción y caracterización de AuNP y espectroscopia de fluorescencia

Se produjeron y caracterizaron AuNP esféricos (7,1 nm) de acuerdo con un estudio de Gasparotto et al. [12]. Brevemente, toda la cristalería se mantuvo en KMnO ₄ + Solución de NaOH durante la noche, enjuagada con agua desionizada, mantenida en H ₂ O ₂ + H ₂ SO ₄ solución (1:1 v / v ) durante 10 min, se enjuaga de nuevo con agua desionizada y se seca antes de su uso. Se disolvieron PVP (0,20 g) y cloruro de oro (6,80 mg) en 10 ml de agua. En un vaso de precipitados separado, se disolvieron glicerol (0,18 g) y NaOH (0,080 g) en 10 ml de agua. A continuación, se añadió la solución de glicerol-NaOH al AuCl ₃ -Solución de PVP para producir las siguientes concentraciones finales:1.0 mmol / L ⁻¹ Au ³⁺ , NaOH 0,10 M, glicerol 0,10 M y 10 g / L ⁻¹ PVP. La mezcla final tenía un color rojo intenso debido a la formación de AuNP. Los espectros de absorción coloidal ultravioleta-visible de los AuNP se adquirieron con un espectrofotómetro UV-visible Evolution 60S (Thermo Scientific, MA, EE. UU.). La espectroscopia de fluorescencia se llevó a cabo con un espectrofluorofotómetro RF-5301 PC (Shimadzu, Kyoto, Japón).

Diseño experimental

Los tres protocolos se probaron en grupos de control de dos modelos inflamatorios crónicos, colitis ulcerosa (CU) inducida por ácido acético [7] y esteatohepatitis inducida por alcohol [8, 9] en ratas.

La CU inducida por ácido acético se realizó en ratas Wistar hembra (220 ± 20 g de peso corporal), obtenidas del Centro de Biotecnología / Universidade Federal da Paraiba. Los animales se dividieron en dos grupos ( n =5 por grupo):control de ácido acético y ratas no colíticas. Los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche y se anestesiaron con ketamina (70 mg / kg, 10%) y xilacina (10 mg / kg, 2%). La CU fue inducida de acuerdo con métodos originalmente descritos por MacPherson y Pfeiffer [13] y modificados por Millar et al. [14]. Se insertó cuidadosamente un catéter en el colon. Luego, se instiló ácido acético al 10% (0,5 ml) en solución salina al 0,9% en el lumen del colon. El grupo no colítico recibió 0,5 ml de solución salina al 0,9% por vía intracolónica. Las ratas se mantuvieron en posición supina de Trendelenburg durante 30 s para evitar la fuga de la instilación intracolónica.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche y se sacrificaron con una sobredosis de tiopental, 48 h después de la inducción. A continuación, el colon se extrajo asépticamente, se enjuagó con PBS y se colocó en una placa helada. El colon se limpió de grasa y mesenterio. Luego, se pesó cada muestra y se midió su longitud bajo una carga constante (2 g). Posteriormente, el colon se abrió longitudinalmente y se puntuó por daño macroscópicamente visible en una escala de 0 a 10 según los criterios descritos por Bell et al. [15].

Se indujo esteatohepatitis alcohólica en ratas Wistar macho (290 ± 10 g de peso corporal) obtenidas del Departamento de Biofísica y Farmacología - Universidad Federal de Rio Grande do Norte (UFRN). Los animales se dividieron en dos grupos ( n =5 por grupo):ratas alcohólicas y no alcohólicas. Solución de etanol (7 g / kg de peso corporal al 30% v / v ) se utilizó como dosis crónica para el grupo alcohólico. Los animales del grupo sin alcohol recibieron por vía oral un volumen equivalente de solución salina (NaCl al 0,9%) por sonda. Los procedimientos de sonda se realizaron una vez al día en ambos grupos durante 28 días.

El día 29, se realizó la eutanasia mediante inyección intraperitoneal de 7,5 ml / kg de ketamina (50 mg / ml) y 2,5 ml / kg de xilacina (20 mg / ml). Antes de la eutanasia, todos los grupos de animales se mantuvieron en ayunas durante 12 h. Una vez inconscientes, los animales se sometieron a una punción cardíaca seguida de la extracción del hígado. Los fragmentos de hígado se sumergieron en formaldehído tamponado al 10% para el análisis histopatológico.

Los animales de CU inducida por ácido acético y esteatohepatitis inducida por alcohol se alojaron en condiciones estándar (ciclo de luz / oscuridad de 12 h, 22 ± 0,1 ° C y 50-55% de humedad) con ad libitum acceso a alimentos y agua. Los animales fueron tratados de acuerdo con los principios éticos para la experimentación animal.

Histología

Se utilizaron cinco bloques de parafina de los controles positivos (control de ácido acético y control alcohólico) de cada modelo de inflamación para la tinción IF indirecta. Se descubrió que los anticuerpos primarios anti-COX-2 y anti-MIF son buenos marcadores de inflamación en la CU inducida por ácido acético y la esteatohepatitis inducida por alcohol, respectivamente, al proporcionar una tinción confiable en términos de intensidad de fluorescencia que se puede usar para comparar diferentes protocolos.

Los tejidos se fijaron en formaldehído tamponado al 10%, se deshidrataron con alcohol etílico (70%, 80%, 90%, 95% y P.A.), se aclararon en Xylol e impregnaron en parafina siguiendo el protocolo estándar [8]. Antes de la preparación de las secciones para la tinción IF indirecta, los portaobjetos se mantuvieron en un horno a 60 ° C durante 24 h.

Diseños de inmunofluorescencia y protocolos

Tres secciones de tejido (4 µm) de cada animal se desparafinaron en xileno y se lavaron en una serie de concentraciones decrecientes de etanol, desde etanol al 99% hasta etanol al 50%. Finalmente, las secciones de tejido se lavaron dos veces en dH ₂ O y un lavado con PBS. La recuperación del antígeno se realizó colocando las secciones en citrato de sodio 10 mM con Tween 20 al 0,05% a 95 ° C durante 30 min y posteriormente a temperatura ambiente (RT) durante 20 min. El ruido de fondo / señal se redujo incubando las secciones en negro de Sudán al 0,1% en alcohol al 70% a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de tres lavados en PBS-Tween 20 al 0,02%. Las muestras se permeabilizaron en Triton-X-100 al 0,2% en PBS (tres lavados, 5 min cada uno), lavado en PBS y luego bloqueado con PBS, 5% BSA, dH ₂ O y Triton-X-100. Los portaobjetos se incubaron con solución de bloque en una cámara de humedad durante 2 h. Como se muestra en la Tabla 1 y la Fig. 1, la incubación de los anticuerpos primarios anti-COX-2 y anti-MIF se realizó siguiendo tres protocolos diferentes (NP1, NP2 y NP3). Estos protocolos se compararon con dos protocolos basados en ALEXA que difieren en el tiempo de incubación del anticuerpo primario:el protocolo estándar ALEXA (incubación nocturna) adoptado por nuestro grupo de investigación como protocolo estándar para la mayoría de los procedimientos (A1) y el protocolo modificado ALEXA (A2; Incubación de 30 min). NP1 es un método de tinción por inmunofluorescencia dependiente de nanopartículas con 30 min de incubación primaria. Los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 1% en proporciones de 1:500 (anti-COX-2) y 1:400 (anti-MIF), y cada muestra se incubó en una cámara de humedad a TA (20 ° C) durante 30 min. . A continuación, se agregaron 100-150 μl de AuNP a las muestras, que se dejaron incubadas a temperatura ambiente (20 ° C) durante otros 30 min. En el segundo protocolo dependiente de nanopartículas (NP2), los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 1% y se aplicaron directamente a los portaobjetos, que se dejaron en el refrigerador durante la noche. Por lo tanto, A2 y NP1 son protocolos de incubación de 30 minutos, pero A2 se realiza con un anticuerpo fluorescente secundario (ALEXA), mientras que NP1 tiene AuNP como fluoróforos. Esto también se aplica a los protocolos de incubación durante la noche A1 y NP2. Después de los respectivos tiempos de incubación, los portaobjetos de cada protocolo se lavaron tres veces con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo primario. Luego, se agregaron 100-150 μl de nanopartículas a cada portaobjetos en NP2, mientras que ALEXA (1:400) se agregó en A1. Después de 1 h de incubación con AuNPs (NP2) y ALEXA (A1), todos los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS.

Imágenes de tinción con hematoxilina y eosina de grupos de control de CU inducida por ácido acético y esteatohepatitis inducida por alcohol. un Control negativo del modelo UC (× 100; barra de escala =100 μm). b CU inducida por ácido acético. La flecha roja indica infiltración de leucocitos en el área de la mucosa (× 100; barra de escala =100 μm). c Control negativo de la esteatohepatitis (× 200; barra de escala =50 μm). d Esteatohepatitis inducida por alcohol. La flecha negra indica infiltración de leucocitos (× 200; barra de escala =50 μm)

El tercer protocolo (NP3) se diseñó para explorar las propiedades amplificadoras de AuNP en sistemas fluorescentes. En NP3, se aplicaron AuNP durante la dilución de ALEXA en BSA al 1%. Se probaron tres diluciones de anticuerpo secundario (1:200, 1:400 y 1:800) en BSA con AuNP para comparar las intensidades de fluorescencia de cada dilución con A1. Las diluciones se prepararon de tal manera que el volumen de AuNPs fuera proporcional al volumen de BSA, por ejemplo, para una dilución 1:200, se diluyeron 2 µl de ALEXA en 199 µl de AuNPs + 199 µl de BSA. El tiempo de incubación de los anticuerpos primarios en A1 y NP3 fue de aproximadamente 18 h (durante la noche), mientras que el tiempo de incubación para la suspensión de ALEXA + AuNPs fue de 1 h.

Finalmente, las muestras se montaron utilizando Fluoroshield Mounting Medium con DAPI. Los portaobjetos se almacenaron en una caja protegida contra la luz y se mantuvieron a 4 ° C hasta el análisis microscópico. Las imágenes fluorescentes se obtuvieron con un microscopio vertical Zeiss Observer z.1 para obtener imágenes de fluorescencia y de campo brillante (objetivos × 20 y × 10, Carl Zeiss, Jena, Alemania) con AxioCam MRc. El parámetro de media aritmética del software Zeiss ZEN lite blue edition (Carl Zeiss) se utilizó para evaluar cuantitativamente la intensidad de la fluorescencia píxel por píxel para cada imagen del canal ALEXA. Se analizaron al menos tres muestras de cada animal (cinco animales por grupo) y se tomaron cinco fotografías de cada fragmento con el objetivo × 10.

Inducción de TAM polarizados M2 in vitro

Para la evaluación de nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos primarios (AuNP) en macrófagos M2, células RAW 264.7 (5 × 10 ⁵ células / pocillo en una placa de 12 pocillos) en medio completo con suero bovino fetal al 10% suplementado con 20 ng / ml de IL-4 durante 24 h. Después del tratamiento con IL-4, las células se lavaron tres veces con DMEM sin suero, seguido de cultivo en el mismo medio durante 48 h. Las células se analizaron con un microscopio óptico Telaval 31 (ZEISS, Oberkochen, Alemania).

Citometría de flujo

Después de la incubación con IL-4 durante 48 h, células RAW 264,7 y macrófagos M2 (1,5 × 10 ⁴ células / pocillo en una placa de 12 pocillos) se recogieron con un raspador y se bloquearon con 0,5 g de BSA en 100 ml de PBS (PBA) durante 45 min, seguido de incubación con CD163 anti-ratón conjugado con PerCP (1:1000) y FITC -CD86 anti-ratón conjugado (1:1000) a 4 ° C durante 60 min. Además, los macrófagos M2 se marcaron con anticuerpos primarios COX-2 y MIF y así se conjugaron con AuNP. Se recogieron los TAM polarizados M2 y se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 10 min, seguido de incubación con anti-COX-2 y anti-MIF primario (1:100) durante 60 min a 4 ° C y; Posteriormente, las células se marcaron con anticuerpo secundario conjugado de cabra anti-conejo Alexa® Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific) en solución de incubación (1:100) a temperatura ambiente durante 60 min como se describe en el protocolo estándar de Alexa [16]. Siguiendo el protocolo (N1) donde los AuNPs reemplazan al anticuerpo secundario conjugado con Alexa® Fluor 488 anti-conejo de cabra, se recolectaron macrófagos M2, se lavaron con PBS y se incubaron con el anti-COX-2 y anti-MIF primario (1:100 ) en solución de incubación a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, las células se incubaron con AuNP (1:5) a 4 ° C durante 30 min (excitación de AuNP a 520 nm). Después del paso de lavado final, las células marcadas se analizaron en un software BD FACSCanto II (BD Biosciences, Países Bajos) y FlowJo (versión 10.1; Tree Star Inc., Reino Unido). Todos los análisis de citometría de flujo se realizaron con muestras por triplicado y se repitieron tres veces. La comparación entre los protocolos estándar ALEXA y AuNPs se muestra en la Tabla 2.

Análisis estadístico

Análisis de varianza (ANOVA) y post hoc de Bonferroni Se realizaron pruebas para el análisis de inmunofluorescencia. Para el análisis de citometría de flujo, las diferencias significativas entre los grupos se calcularon utilizando ANOVA y la prueba de Dunn, como se indica. A p <0,05 se consideró estadísticamente significativo para todos los análisis realizados.

Resultados

Análisis de microscopía

La sección de la Fig. 1a muestra una sección de tejido teñida con hematoxilina y eosina (control negativo). El proceso inflamatorio crónico inducido por ácido acético se representa en la Fig. 1b, que revela la pérdida de la arquitectura tisular con la consiguiente destrucción del epitelio, una reducción de las células caliciformes, la presencia de hemorragias y leucocitos cerca de los sitios lesionados. En la figura, se observó acumulación de gotitas de grasa e infiltrado inflamatorio (neutrófilos y linfocitos) en los hígados de ratas sometidas a exposición crónica al alcohol.

En términos de intensidad de fluorescencia, los AuNP se parecían a ALEXA, que es un fluoróforo convencional para la tinción IF. Tanto en muestras de hígado como de colon, las diferencias en la intensidad de fluorescencia de NP1 y NP2 fueron mínimas o inexistentes en comparación con A1. En la Fig. 2, se muestran múltiples comparaciones entre los protocolos de IF probados usando anticuerpos primarios anti-COX-2 y anti-MIF. Las figuras 2a yd demuestran que las intensidades de fluorescencia de A2, NP1 y NP2 no son significativamente diferentes en comparación con el protocolo A1 (^# p > 0.05), lo que sugiere que los protocolos de incubación de 30 minutos (ya sea usando ALEXA o AuNP) pueden ser aplicables en un contexto de diagnóstico.

Comparación de la intensidad de la fluorescencia entre grupos. un Intensidad de fluorescencia de AuNP en A2, NP1 y NP2 en comparación con UC inducida por ácido acético solo A1 (anticuerpo anti-COX-2). b Todas las diluciones de NP3 (1:200, 1:400 y 1:800) en comparación con la intensidad de fluorescencia de A1 (1:400) -sólo UC inducida por ácido acético (anticuerpo anti-COX-2). c Comparación de la intensidad de fluorescencia entre animales inducidos por ácido acético y controles negativos después de un período de incubación corto (A2 y NP1) y durante la noche (A1 y NP2). d Intensidad de fluorescencia de AuNP en A2, NP1 y NP2 en comparación con la esteatohepatitis inducida por alcohol solo A1 (anticuerpo anti-MIF). e Todas las diluciones de NP3 (1:200, 1:400 y 1:800) en comparación con la intensidad de fluorescencia de A1 (1:400), solo inducida por alcohol de esteatohepatitis (anticuerpo anti-MIF). f Comparación de la intensidad de fluorescencia entre animales con esteatohepatitis inducida por alcohol y controles negativos después de 30 min de incubación (A2 y NP1) e incubación durante la noche (A1 y NP2). Estadísticas:ANOVA y prueba post hoc de Bonferroni, ^# p ≥ 0,05, ** p <0.01, *** p <0.001 y **** p <0,0001

Además, el protocolo NP3 (Fig. 2b, e) demostró que es posible combinar las AuNP con ALEXA de modo que la intensidad de fluorescencia detectada se incrementó (*** p <0,001), lo que permite incluso el doble de la dilución de ALEXA sin que la fluorescencia disminuya en relación con la dilución 1:400 probada originalmente en A1 (^# p > 0,05).

Finalmente, comparamos los grupos enfermos con los grupos sanos (Fig. 2f) para demostrar que todos los protocolos probados, ya sea con ALEXA o con AuNP, son efectivos para detectar la aparición de procesos inflamatorios caracterizados por antígenos COX-2 y MIF. Las figuras 3 y 4 respaldan los datos que se muestran gráficamente en la figura 2. Tanto ALEXA como AuNP están representadas en tinción verde, cuya distribución corresponde a sitios de mayor infiltración de leucocitos y lesión tisular.

Imágenes de anti-COX-2 IF de muestras de colon de la solución salina (control negativo) y los grupos UC inducidos por ácido acético teñidos con compuestos fluorescentes verdes (ALEXA, AuNP o ambos) y DAPI (azul) para los núcleos. un Control negativo teñido con protocolo estándar ALEXA (A1) con anti-COX-2 y ALEXA (verde). b Control negativo teñido con protocolo ALEXA modificado (A2) con anti-COX-2 y ALEXA. c Control negativo teñido con el protocolo de nanopartículas 1 (NP1) con anti-COX-2 y AuNPs (verde) en lugar de ALEXA. d Control negativo teñido con el protocolo de nanopartículas 2 (NP2) con anti-COX-2 y AuNP en lugar de ALEXA. e Control positivo teñido con A1. f Control positivo teñido con A2. g Control positivo teñido con NP1. h Control positivo teñido con NP2. yo Control positivo teñido con protocolo de nanopartículas (NP3) con anti-COX-2 + AuNPs con ALEXA 1:200. j Control positivo teñido con NP3 (con dilución 1:400 de ALEXA). k Control positivo UC teñido con NP3 (con dilución 1:800 de ALEXA). Ampliaciones, × 200. Barra de escala =50 μm

Imágenes de anti-MIF IF de muestras de hígado de los grupos de esteatohepatitis inducida por alcohol y solución salina (control negativo) teñidos con compuestos fluorescentes verdes (ALEXA, AuNP o ambos) y DAPI (azul) para los núcleos. un Control negativo teñido con protocolo estándar ALEXA (A1) con anti-MIF y ALEXA (verde). b Control negativo teñido con protocolo modificado ALEXA (A2) con anti-MIF y ALEXA. c Control negativo teñido con el protocolo de nanopartículas 1 (NP1) con anti-MIF y AuNPs (verde) en lugar de ALEXA. d Control negativo teñido con el protocolo de nanopartículas 2 (NP2) con anti-MIF y AuNP en lugar de ALEXA. e Control positivo teñido con A1. f Control positivo teñido con A2. g Control positivo teñido con NP1. h Control positivo teñido con NP2. yo Control positivo teñido con nanopartículas protocolo 3 (NP3) con anti-MIF + AuNPs con ALEXA 1:200. j Control positivo teñido con NP3 con una dilución 1:400 de ALEXA. k Control positivo teñido con NP3 con una dilución 1:800 de ALEXA. Ampliaciones, × 200. Barra de escala =50 μm

En términos de aplicación clínica, el protocolo NP1 resultó ser el más prometedor, ya que, comparado con el protocolo estándar A1, permite un ahorro de 18 h.

Citometría de flujo:Nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos primarios (AuNP) - Macrófagos M2 etiquetados

Para caracterizar aún más los macrófagos M2, se analizó la expresión de los fabricantes relacionados con M1 (CD86) y M2 (CD163) en células RAW 264.7 estimuladas con IL-4 en citometría de flujo. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que los marcadores relacionados con M2, como el receptor CD163, eran significativamente más altos que los de la célula nativa (Fig. 5a, c, p <0,001) mientras que la expresión del receptor CD86 no mostró ninguna diferencia entre los macrófagos M2 y las células vírgenes (Fig. 5b, c, p > 0,05). Los resultados sugirieron que IL-4 (20 ng / ml) indujo con éxito la alteración de macrófagos clásicos a macrófagos M2. Después de este paso, los macrófagos M2 se incubaron con anticuerpos primarios COX-2 y MIF y luego se marcaron con AuNP para comparar la eficiencia de las nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos primarios (AuNP) con el protocolo estándar (ALEXA). Los resultados mostraron que las nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos COX-2 y MIF (Fig. 5d, f, p <0.001) o ALEXA (Fig. 5e, f, p <0,001) mostraron una mayor intensidad de fluorescencia en los macrófagos M2 en comparación con las muestras sin teñir.

Las nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos COX-2 y MIF (AuNP) tienen una alta afinidad en la superficie de los macrófagos M2. un - c Se estimularon células RAW 264.7 con IL-4 (20 ng / ml) durante 24 h, seguido de análisis de citometría de flujo para cuantificar la cantidad de CD163, un marcador de macrófagos M2, y CD86, un marcador M1. d , f Nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos COX-2 y MIF o e , f ALEXA 488 mostró una mayor intensidad de fluorescencia en los macrófagos M2 en comparación con las muestras sin teñir. Los datos se expresan como media ± DE, ^# p > 0.05, *** p <0,001, p <0,0001. Los datos de flujo representativos que se muestran son de experimentos realizados de forma independiente al menos tres veces

Espectroscopia de fluorescencia

Para medir los espectros de emisión de fluorescencia para AuNP purificados en ausencia y presencia de anti-COX-2 (Fig. 6a), anti-MIF (Fig. 6b) y ALEXA (Fig. 6c), se fijó la longitud de onda de excitación a 320 nm y la emisión se registró en el intervalo de 650 a 900 nm. Un aumento de la longitud de onda de excitación no cambió el rango de emisión de las partículas, excluyendo así la posibilidad de un proceso de dispersión. Las emisiones de fluorescencia aumentaron ligeramente con la absorción de anti-COX-2 (aumento de 11,93 unidades de absorbancia (au) para la concentración más alta de anticuerpos), anti-MIF (aumento de 12,15 au para la concentración más alta de anticuerpos) y ALEXA (aumento de 3,18 au para la concentración más alta de anticuerpos) en combinación con AuNP.

Espectros de emisión de fluorescencia de AuNP excitados a 320 nm en presencia de anti-COX-2 ( a ), anti-MIF ( b ) y ALEXA ( c ). La imagen TEM de las nanopartículas esféricas utilizadas en este estudio, que muestra su tamaño y distribución ( d ). Las rendijas de excitación y emisión fueron de 10 nm. La concentración de AuNP se mantuvo constante en 29,6 ng / ml ^-1 . Las concentraciones de anticuerpo son 100 ng / ml ⁻¹ (curva azul), 150 ng / ml ⁻¹ (curva roja) y 200 ng / ml ⁻¹ (curva verde)

Discusión

Se ha demostrado que las AuNP tienen propiedades de fluorescencia, debido a su estructura química y tamaño, y pueden actuar como moléculas amplificadoras de señales fluorescentes. Más específico, la propia fluorescencia de AuNP se origina a partir de interacciones aurofílicas en la superficie de los átomos de oro [17, 18]. Los datos de la Fig. 6 son similares a los resultados de los estudios sobre nanopartículas de plata, que deben el aumento de la emisión de fluorescencia a la competencia entre las especies adsorbentes y el oxígeno molecular disuelto en solución. Por lo tanto, el aumento de la emisión de fluorescencia de las nanopartículas de oro podría atribuirse al hecho de que BSA se adsorbe en su superficie [19].

La señal de fluorescencia es una función del fenómeno de resonancia del plasmón de superficie (SPR). Por lo tanto, el aumento en la cantidad de electrones libres conduce a una señal SPR más intensa, ya que SPR es la oscilación colectiva de electrones libres. La BSA adsorbida evita que los electrones libres de la superficie se unan a las moléculas de oxígeno, lo que provoca un aumento de la señal de fluorescencia [20, 21]. Anti-COX-2, anti-MIF y ALEXA pueden haberse adsorbido en los AuNP, evitando así que O ₂ de alcanzar la superficie de las nanopartículas. Esto está respaldado por la Fig. 6, donde el aumento de la señal de fluorescencia se produjo a concentraciones muy bajas de los diferentes anticuerpos. Vale la pena notar, sin embargo, que ALEXA requirió una concentración más alta para causar O ₂ aislamiento de la superficie AuNPs.

El proceso de inflamación crónica se caracteriza por la infiltración de células inmunes, principalmente macrófagos, en los sitios de lesión causados por ácido acético o etanol en el modelo respectivo. La inflamación también se caracteriza por la liberación dependiente de leucocitos de varias citocinas y mediadores en respuesta a un patógeno o una condición estresante. Entre estas citocinas, se sabe que COX-2 y MIF son marcadores de varios procesos de inflamación, ya que son citocinas proinflamatorias. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Conclusions

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.