Inmunofluorescencia Basada en Nanopartículas de Oro Permite Detección Rápida y Sensible de Biomarcadores de Cáncer Asociados a Inflamación

Resumen

La detección temprana del cáncer depende de identificar señales inflamatorias que preceden a la malignidad. Evaluamos nanopartículas de oro (AuNPs) conjugadas con anticuerpos primarios como agentes de contraste dirigidos para inflamación crónica en modelos de colitis ulcerosa (CU) y esteatohepatitis, condiciones que predisponen a cáncer colorrectal y hepático. AuNPs (7,1 nm) se sintetizaron mediante una ruta rentable y ecológica y se conjugaron con anti-COX-2, anti-MIF y Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Se compararon tres protocolos de inmunofluorescencia (IF) —incubación de 30 min y durante la noche, más un protocolo de amplificación— con el flujo de trabajo estándar de IF con ALEXA. La citometría de flujo (FC) usó AuNPs para marcar macrófagos M2. La conjugación se logró por adsorción directa, confirmada por intensidad de fluorescencia comparable a ALEXA. El protocolo AuNP de 30 min redujo el tiempo total de IF de 23 h a 5 h y el de FC de 4 h a 1 h, ofreciendo una alternativa viable clínicamente para diagnóstico de cáncer impulsado por inflamación.

Introducción

Las nanopartículas de oro (AuNPs) han surgido como sondas versátiles para imágenes ópticas, ofreciendo propiedades ópticas ajustables por tamaño, alta biocompatibilidad y facilidad de funcionalización. Conjugados anticuerpo-AuNP permiten detección en tiempo real de captación de oro en células vivas, facilitando cuantificación precisa de distribución de nanopartículas en estados de enfermedad. Históricamente, el oro coloidal se empleó para microscopía electrónica de antígenos bacterianos, y luego se extendió a diversas aplicaciones biomédicas, incluyendo genómica, biosensores y terapia fototérmica. En oncología, las AuNPs mejoran señales de fluorescencia y atenuación de rayos X, mejorando la sensibilidad de imagen tumoral.

Basándonos en nuestro trabajo previo demostrando anticuerpos conjugados con AuNPs para imagen de carcinoma colorrectal, este estudio introduce tres protocolos IF que reemplazan fluoróforos convencionales con AuNPs, acelerando el teñido y reduciendo consumo de reactivos. También validamos AuNPs en FC para marcar macrófagos M2, actores clave en inflamación asociada a tumores.

Métodos

Objetivo

Demostrar que AuNPs pueden reemplazar fluoróforos convencionales en IF y FC, proporcionando teñido más rápido e igualmente confiable para biomarcadores de cáncer impulsados por inflamación.

Reactivos

AuCl₃, PVP (PM 10 000), NaOH, glicerol, PBS, BSA (5 %), anti-COX-2, anti-MIF, anticuerpo secundario Alexa Fluor® 488, y Fluoroshield con DAPI.

Síntesis y Caracterización de AuNPs

AuNPs esféricas (7,1 nm) se prepararon reduciendo AuCl₃ en presencia de PVP, glicerol y NaOH, produciendo un coloide rojo intenso. Espectros UV-vis y mediciones de fluorescencia confirmaron monodispersidad y resonancia plasmónica superficial. Los anticuerpos se adsorbieron directamente sobre AuNPs, logrando conjugados estables.

Modelos Animales

CU inducida por ácido acético en ratas Wistar hembras (n = 5) y esteatohepatitis inducida por alcohol en ratas Wistar machos (n = 5) se establecieron según protocolos estándar. Los tejidos se fijaron, incluyeron y seccionaron (4 µm) para IF.

Protocolos de Inmunofluorescencia

Se evaluaron tres protocolos basados en AuNPs:

• NP1 (30 min): Anticuerpo primario (1:500 COX-2, 1:400 MIF) incubado 30 min, seguido de 30 min adición de AuNP.
• NP2 (durante la noche): Anticuerpo primario incubado 18 h, luego 1 h incubación con AuNP.
• NP3 (amplificación): ALEXA diluido (1:200–1:800) mezclado con AuNPs; 1 h incubación.

Protocolos estándar ALEXA (A1 durante la noche, A2 30 min) sirvieron como controles. Las secciones se imagenaron en un Zeiss Observer z.1 con análisis cuantitativo de fluorescencia píxel a píxel.

Marcado de Macrófagos M2 y Citometría de Flujo

Células RAW 264.7 se polarizaron a M2 con IL-4 (20 ng mL⁻¹) durante 48 h. Las células se incubaron con anticuerpos primarios COX-2/MIF y se marcaron con ALEXA o AuNPs (protocolo N1). Tras fijación, las muestras se analizaron en un BD FACSCanto II; los datos se procesaron con FlowJo.

Análisis Estadístico

ANOVA con post-hoc Bonferroni (IF) y prueba de Dunn (FC) evaluaron significancia; p < 0,05 considerado significativo.

Resultados

Microscopía

Imágenes H&E confirmaron patología inflamatoria esperada. La intensidad de fluorescencia de NP1 y NP2 igualó a A1, y NP3 amplificó la señal, permitiendo dilución doble de ALEXA sin pérdida de brillo. Protocolos de tiempo corto (30 min) (A2, NP1) produjeron teñido comparable a estándares nocturnos, demostrando factibilidad para diagnóstico rápido.

Citometría de Flujo

Células RAW polarizadas con IL-4 exhibieron CD163 elevado (marcador M2) y CD86 inalterado (M1). AuNPs conjugados con COX-2/MIF produjeron intensidades de fluorescencia comparables a ALEXA, confirmando unión superficial eficiente y uso mínimo de reactivos.

Espectroscopía de Fluorescencia

AuNPs exhibieron emisión a 650-900 nm tras excitación a 320 nm. La adsorción de anticuerpos aumentó la fluorescencia en ~12 a.u., indicando conjugación exitosa y señal mejorada debido a reducción de quenching por oxígeno.

Discusión

Las AuNPs poseen fluorescencia intrínseca y actúan como amplificadores de señal al bloquear el acceso de oxígeno a electrones superficiales, mejorando así la resonancia plasmónica superficial. La conjugación por adsorción directa proporciona un enfoque simple y escalable, evitando química covalente y preservando la actividad del anticuerpo. El protocolo NP1 reduce el flujo de trabajo total de IF en 18 h, mientras que el tiempo de FC cae de 4 h a 1 h, ofreciendo eficiencias sustanciales. Importantemente, las AuNPs retienen sensibilidad para COX-2 y MIF, biomarcadores clave en cáncer colorrectal asociado a CU y carcinoma hepatocelular relacionado con esteatohepatitis inducida por alcohol. Dada la alta prevalencia de inflamación crónica en riesgo de cáncer, métodos de detección rápidos y rentables son esenciales.

Conclusiones

Los protocolos IF y FC basados en AuNPs entregan intensidades de fluorescencia a la par con fluoróforos convencionales, mientras reducen drásticamente tiempos de incubación y consumo de reactivos. Estos hallazgos abren vías para adopción clínica de AuNPs en patología diagnóstica y potencialmente en dirigido terapéutico de macrófagos M2.