CKAP4 Micelas de punto cuántico de Si conjugadas con anticuerpo para la obtención de imágenes dirigidas del cáncer de pulmón

Métodos

Reactivos

La albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Sigma (ensayo ≥ 98%; Missouri, EE. UU.); tetrahidrofurano (THF) de Adamas-beta (pureza:99,9%; Basilea, Suiza); DSPE-PEG-COOH de Aladdin (Shanghai, China); Anticuerpo CKAP4 de Abcam (0,55 mg / ml; Cambridge, Reino Unido); Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) y solución salina tampón fosfato (PBS) de Hyclone (Utah, EE. UU.); suero fetal bovino (FBS) y tirisina de Gibco (Nueva York, EE. UU.); paraformaldehído (4%), tampón de permeabilización de inmunotinción con Triton X-100 y tampón de bloqueo para inmunotinción de Beyotime (Shanghai, China); glicerina de Solarbio (pureza ≥ 99%; Beijing, China); y tripsina de Kingmorn (0,25%; Shanghai, China).

Instrumentación

Se tomaron imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) usando microscopía electrónica JEM-2100F (JEOL, Tokio, Japón). El hidrodiámetro se determinó usando JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Los espectros de absorción UV-Vis se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.). El espectro de emisión de fluorescencia se obtuvo usando un espectrofotómetro F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokio, Japón). La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó utilizando un sistema ESCA PHI-5000C mejorado con RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.). Los rendimientos cuánticos (QY) de fotoluminiscencia (PL) se estimaron utilizando un espectrómetro fluorescente (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Inglaterra). La espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se realizó utilizando Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.). La difracción de rayos X (XRD) fue probada por SmartLab (Rigaku Corporation, Tokio, Japón).

Celdas

Las líneas de células T A549 y 293 se compraron en el Instituto de Biología Celular de Shanghai (Shanghai, China).

Preparación de micelas de Si QD

En primer lugar, se prepararon QD con dodecly-Si mediante una reacción de hidrosililación y se disolvieron en THF para preparar una solución de QD con dodecly-Si (15 mg / ml) de acuerdo con un método previamente informado [12]. Luego, se disolvieron 20 mg de DSPE-PEG-COOH y se mezclaron en 10 ml de agua desionizada para preparar una solución de DSPE-PEG-COOH (2 mg / ml, 10 ml). Posteriormente, se añadió lentamente una solución de dodecly-Si QDs (15 mg / ml, 66 µl) a una solución de DSPE-PEG-COOH de 10 ml gota a gota. Después de agitación ultrasónica durante 3 min, se obtuvo una solución clara y transparente. A continuación, la solución se colocó en una campana extractora y se agitó durante 12 h en la oscuridad. Posteriormente, la solución se dializó durante 24 hy luego se liofilizó durante 3 días para obtener las micelas de Si QD.

Preparación de Si QD Micelles-CKAP4

En este estudio, el anticuerpo CKAP4 se conjugó con micelas de Si QD activando el grupo carboxilo por EDC [14]. El método fue el siguiente:se dispersaron 4 mg de micelas de Si QD en 900 µl de PBS para preparar la solución de micelas de Si QD. Se añadió EDC (10 mg) a 100 µl de PBS para preparar la solución de EDC. A continuación, se añadieron lentamente 100 µl de solución de EDC a 900 µl de micelas de Si QD, con agitación ultrasónica durante 5 min. Además, se añadieron lentamente 20 µl de anticuerpo CKAP4 y la mezcla de solución se agitó durante 2 ha temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, el producto se ultrafiltró a 4000 rpm durante 15 min. Después de lavar con PBS tres veces, el producto se denominó Si QD micelas-CKAP4.

Prueba de citotoxicidad

En este estudio, se utilizó azul tripán para probar la bioseguridad de los nanomateriales [15]. Las células T A549 y 293 se incubaron en una placa de 24 pocillos (1 x 10 ⁶ / pocillo) a 37 ° C durante 12 h. Después de descartar el medio, se agregaron una serie de concentraciones de micelas Si QD o micelas Si QD-CKAP4 (concentración de Si:0-152 µg / mL) a una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 2 h. Después de descartar el medio, las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS. Se mezcló azul tripán con la suspensión celular en una proporción de 1:1. El número de células vivas y muertas se detectó y registró utilizando Countstar. Viabilidad celular (%) =número de células vivas / (número de células vivas + número de células muertas) x 100. Se utilizaron tres réplicas biológicas. Para el análisis estadístico se utilizó el software Prism (versión 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional con la prueba posterior de Dunnett. La significancia estadística se estableció en P <0,05. * P <0,05; ** P <0,01; y *** P <0,001.

Los nanomateriales se dirigen a las células del cáncer de pulmón in vitro

La capacidad de direccionamiento de las micelas Si QD y las micelas Si QD-CKAP4 a las células de cáncer de pulmón in vitro se detectó de la siguiente manera:Primero, las células A549 se incubaron en placas confocales con láser (3 × 10 ⁵ células / placa) a 37 ° C durante 12 h. Después de descartar el medio, las células se lavaron tres veces con PBS. Posteriormente, se añadió 1 ml de paraformaldehído (4%) a las células y se incubaron a 25 ° C durante 10 min. Después de descartar el paraformaldehído, las células se lavaron con PBS tres veces. A continuación, se añadió a las células 1 ml de tampón de permeabilización de inmunotinción con Triton X-100 y se incubó a 25 ° C durante 10 min. Después de descartar el tampón de permeabilización de inmunotinción con Triton X-100, las células se lavaron tres veces con PBS. Posteriormente, se añadió a las células 1 ml de tampón de bloqueo para inmunotinción y se incubó a 25 ° C durante 10 min. Después de descartar el tampón de bloqueo para inmunotinción, las células se lavaron tres veces con PBS. Luego, se añadieron 200 µL de micelas de Si QD o micelas de Si QD-CKAP4 (concentración de Si 150 µg / ml) a las células y se incubaron a 37 ° C durante 2 h. Después de descartar los nanomateriales, las células se lavaron tres veces con PBS. Las fotografías se tomaron utilizando un microscopio confocal láser (Leica, Wetzlar, Alemania). La luz de excitación se estableció en 405 nm y la longitud de onda de emisión se estableció en 630 nm.

La capacidad de direccionamiento de las micelas Si QD y las micelas Si QD-CKAP4 a las células normales in vitro se detectó de la siguiente manera:primero, se recogieron 293 células T en tubos Eppendorf de 1,5 ml a una densidad de 1 × 10 ⁶ células / tubo. Después de centrifugar a 1000 rpm durante 5 min, se descartó el sobrenadante. A continuación, se añadió 1 ml de paraformaldehído (4%) a las células y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Después de centrifugar a 1000 rpm durante 5 min, se descartó el sobrenadante. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS. Luego, se añadió a las células 1 ml de tampón de permeabilización de inmunotinción con Triton X-100 y se incubó a 25 ° C durante 10 min. A continuación, las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Después de descartar el sobrenadante, las células se lavaron tres veces con PBS. Luego, se añadió a las células 1 ml de tampón de bloqueo para inmunotinción y se incubó a 25 ° C durante 10 min. A continuación, las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Después de descartar el sobrenadante, las células se lavaron tres veces con PBS. Posteriormente, se añadieron 200 µL de micelas de Si QD o micelas de Si QD-CKAP4 (concentración de Si 150 µg / ml) a las células y se incubaron a 37ºC durante 2 h. Después de centrifugar a 1000 rpm durante 5 min, se descartó el sobrenadante y el sedimento se lavó tres veces con PBS. Las células se recolectaron y se prepararon portaobjetos de microscopio. La microscopía se realizó utilizando un microscopio confocal láser. La luz de excitación se estableció en 405 nm y la longitud de onda de emisión se estableció en 630 nm.

Se realizaron tres experimentos independientes. El análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia media se realizó utilizando el software ImageJ (Bethesda, MD, EE. UU.). Se utilizó el software Prism (versión 7.01) para el análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de Dunnett. La significancia estadística se estableció en P <0,05. *** P <0,001.

Modelo de ratones portadores de tumores

Se adquirieron diez ratones desnudos machos (5-6 semanas de edad) de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Tongji (Shanghai, China). Para establecer el modelo de ratón portador de tumores, los ratones se inyectaron por vía subcutánea con 1 × 10 ⁶ Celdas A549. Se utilizaron ratones portadores de tumores en el experimento cuando el diámetro del tumor alcanzó los 6 mm. Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tongji.

Si QD Micelles-CKAP4 Dirigido a tejidos de cáncer de pulmón in vitro

Los ratones portadores de tumores se sacrificaron bajo anestesia. Se recogieron el tumor y el tejido pulmonar normal para preparar cortes en parafina. Después de la deshidratación, la recuperación del antígeno y el bloqueo del suero, se añadieron a los tejidos micelas de Si QD o micelas de Si QD-CKAP4 (concentración de Si 150 µg / ml) y se incubaron a 37ºC durante 2 h. Después de descartar los nanomateriales, los tejidos se lavaron tres veces con PBS. Los tejidos se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilin-dole (DAPI) durante 10 min. Después de lavar tres veces con PBS, se agregó un medio anti-decoloración a los tejidos y se incubó a 25 ° C durante 5 min. Después de descartar el medio anti-decoloración, los tejidos se lavaron tres veces con PBS. Las fotografías se tomaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokio, Japón) con una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 630 nm. Se realizaron tres experimentos independientes. Se realizó un análisis cuantitativo de la intensidad media de la fluorescencia roja utilizando el software ImageJ. Se utilizó el software Prism (versión 7.01) para el análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de Dunnett. La significancia estadística se estableció en P <0,05. *** P <0,001.

Imágenes de fluorescencia en vivo

En el experimento, nueve ratones portadores de tumores se dividieron en tres grupos (grupo de inyección de micelas de Si QD-CKAP4, grupo de inyección de micelas de Si QD y grupo de inyección de solución salina). A los ratones del grupo de inyección de Si QD micelas-CKAP4 se les inyectaron por vía intravenosa 200 µl de Si QD micelas-CKAP4 (Si:4 mg / kg). A los ratones del grupo de inyección de micelas de Si QD se les inyectaron por vía intravenosa 200 µl de micelas de Si QD (Si:4 mg / kg). Los ratones del grupo de inyección de solución salina se inyectaron por vía intravenosa con 200 µl de solución salina. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron en diferentes puntos de tiempo (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 y 4 h). Los ratones del grupo de inyección de Si QD micelas-CKAP4 fueron anestesiados y sacrificados a las 4 h para detectar la señal de fluorescencia en su corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tumor. En este estudio, las imágenes de fluorescencia se realizaron utilizando un VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Corea) con un conjunto de filtros de PE ( λ _excitación 450–500 nm, λ _emisión 600–650 nm). Se utilizó el software Prism (versión 7.01) para el análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante un ANOVA de una vía con la prueba posterior de Dunnett. La significancia estadística se estableció en P <0,05. * P <0,05; ** P <0.01.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

En este estudio, se inyectaron 12 ratones con tumores con solución salina (200 µL), micelas de Si QD (Si:4 mg / kg, 200 µL) o micelas de Si QD-CKAP4 (Si:4 mg / kg, 200 µL) a través de la vena de la cola. Después de 24 h, los ratones fueron sacrificados. Se realizó tinción con H&E en sus corazones, hígados, bazos, pulmones y riñones. Se observaron cambios patológicos mediante microscopía óptica [14, 16].

Resultados

Preparación y caracterización de micelas de Si QD

En primer lugar, las QD de dodecil-Si se prepararon mediante hidrosililación de acuerdo con un informe publicado anteriormente (Esquema 1, Paso 1) [12]. De manera similar a los datos reportados, los QD de dodecil-Si sintetizados por nuestro grupo se dispersaron bien en metilbenceno [12]. TEM mostró que los QD de dodecil-Si eran esféricos con tamaños relativamente uniformes. Los tamaños de los QD de dodecil-Si en las imágenes TEM se midieron utilizando el software ImageJ. Los datos mostraron que el diámetro de los QD de dodecil-Si oscilaba entre 4,1 y 5,3 nm, con un diámetro medio de aproximadamente 4,7 nm (Fig. 1a). En las imágenes ampliadas de los QD de dodecil-Si, se pueden observar franjas de celosía evidentes (Fig. 1a). En este estudio, la distancia del plano de la celosía se midió utilizando el software ImageJ. Los datos mostraron que la distancia promedio entre las franjas de celosía es de aproximadamente 0,35 nm, que es casi la misma que la de los QD de dodecil-Si previamente informados (0,34 nm). Por lo tanto, los QD de dodecil-Si sintetizados en este estudio mostraron una buena cristalinidad [12]. La dispersión dinámica de la luz (DLS) mostró los diámetros hidrodinámicos de los QD de dodecil-Si en un rango de 4.8 a 13.5 nm con un promedio de 6.5 nm (Fig. 1b).

Esquema de la preparación de Si QD micelas-CKAP4 e imagenología biológica dirigida en tejidos de cáncer de pulmón

un Imágenes TEM de dodecil-Si QD; b distribución de hidrodiámetro de dodecil-Si QD; c Imágenes TEM de micelas de Si QD; d distribución hidrográfica de micelas de Si QD; e Imágenes TEM de micelas de Si QD-CKAP4; f distribución del hidrodiámetro de las micelas de Si QD-CKAP4; g Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de C1s de micelas de Si QD; h Espectros C1s XPS de micelas de Si QD-CKAP4

Para preparar micelas de Si QD dispersables en agua, se modificaron los dodecil-Si QD por autoensamblaje a partir de DSPE-PEG-COOH (Esquema 1, Paso 2) [12]. Aquí, se usó DSPE-PEG-COOH en lugar de F127 para preparar micelas de Si QD con grupos carboxilo en la superficie. Los resultados mostraron que las micelas de Si QD se dispersaron bien en agua. Las imágenes TEM mostraron que las micelas de Si QD eran partículas esféricas con Si QD insertadas. El diámetro de las micelas de Si QD variaba de 22,7 a 54,6 nm, con un diámetro medio de aproximadamente 34,3 nm (Fig. 1c). DLS mostró que los diámetros hidrodinámicos de las micelas Si QD variaban de 43,8 a 615,9 nm, con un promedio de 58,7 nm (Fig. 1d). El potencial zeta medio de las micelas de Si QD fue de aproximadamente -20,7 mV. En este estudio, FTIR se realizó para investigar la composición de las micelas Si QD (archivo adicional 1:Figura S1A). Los datos mostraron que los picos de absorción de vibraciones de estiramiento de N – H, C – H, O – H y C =O estaban en 3430, 2920, 2850 y 1640 cm ⁻¹ , respectivamente; los picos de absorción de vibración de flexión de C – H y O – H estaban en 1460 y 1400 cm ⁻¹ , respectivamente; los picos de absorción de vibraciones de estiramiento de Si – C, C – O y P – O – C estaban en 1250, 1100 y 951 cm ⁻¹ , respectivamente; los picos de absorción de vibración de flexión de Si – H y O =C – N estaban en 850 y 526 cm ⁻¹ , respectivamente. Estos datos muestran que los grupos característicos de DSPE-PEG-COOH (como N – H, O – H, C =O, C – O, P – O – C y O =C – N) y los grupos característicos de Los QD de dodecil-Si (como Si-C y Si-H) se pueden encontrar en el espectro FTIR de las micelas de Si QD, lo que indica que los QD de dodecil-Si se encapsularon con éxito en micelas autoensambladas por DSPE-PEG-COOH. Además, las micelas de Si QD se caracterizaron por XRD (archivo adicional 1:Figura S1B). El pico de difracción de las micelas de Si QD era nítido, lo que indica que la cristalinidad de las micelas de Si QD era buena. En el patrón XRD, los picos son 2 θ de 27.073, 28.451, 56.598 y 73.145 corresponden a los planos de cristal (100), (002), (112) y (203) de silicio (PDF # 80-0005), lo que indica que los QD de Si se encapsularon con éxito en el Micelas Si QD. Los picos en 2 θ de 31.692, 45.431, 66.200, 75.260 y 83.955 corresponden a los planos cristalinos (200), (220), (400), (420) y (422) de NaCl (PDF n. ° 77-2064). Una explicación racional de la presencia de NaCl en las micelas de Si QD podría ser la siguiente:después de la preparación de las micelas de Si QD, disolvimos las micelas de Si QD en PBS, lo que dio lugar a la presencia de NaCl en las micelas de Si QD.

El espectro de absorción UV-visible mostró que la absorción de micelas de Si QD variaba de 200 a 500 nm (Fig. 2a). Con una longitud de onda de excitación de 330 nm, se observó una fuerte fluorescencia a 650 nm en los espectros de emisión de fluorescencia de las micelas de Si QD (Fig. 2b). La solución acuosa de micelas de Si QD (concentración de Si:80 µg / ml) era transparente y clara a la luz natural; sin embargo, emitió una fuerte fluorescencia roja bajo luz UV de 365 nm (Fig. 2c). En este estudio, los PL QY absolutos se probaron utilizando un espectrómetro fluorescente (FLS1000). La longitud de onda de excitación fue de 365 nm. Los datos mostraron que el PL QY absoluto de las micelas Si QD era aproximadamente del 14,49%.

un Espectro de absorción UV-visible de micelas de Si QD y micelas de Si QD-CKAP4; b espectro de emisión fluorescente de micelas de Si QD y micelas de Si QD-CKAP4; c imágenes de micelas de Si QD y micelas de Si QD-CKAP4 expuestas a luz natural (izquierda) y luz UV de 365 nm (derecha)

Preparación y caracterización de Si QD Micelles-CKAP4

Hemos conjugado el anticuerpo CKAP4 con micelas de Si QD usando EDC (Esquema 1, Paso 3) [14]. Las imágenes TEM mostraron que las micelas de Si QD-CKAP4 eran partículas esféricas con Si QD insertadas. El diámetro de las micelas de Si QD-CKAP4 osciló entre 24,4 y 67,7 nm, con un diámetro medio de aproximadamente 35,5 nm (Fig. 1e). DLS mostró que los diámetros hidrodinámicos de las micelas Si QD-CKAP4 variaban de 58,7 a 824,9 nm con un promedio de 78,8 nm, que era ligeramente mayor que el de las micelas Si QD (Fig. 1f). Este aumento puede deberse a la conjugación del anticuerpo CKAP4. Los espectros XPS de C1s mostraron seis tipos de átomos de carbono en la región de C1s:C (O) O (288.81 eV), C =O (286.5 eV), C – O (285.76 eV), C – N (285.25 eV), C –C (284,88 eV) y C – H (284,34 eV) (fig. 1g). Sin embargo, el pico de C (O) O casi desapareció en los espectros XPS de las micelas Si QD-CKAP4, lo que indica que la conjugación entre los grupos carboxilo y las aminas primarias fue exitosa; por lo tanto, el anticuerpo CKAP4 se conjugó con éxito con las micelas Si QD (Fig. 1h). El potencial zeta medio de las micelas de Si QD-CKAP4 fue aproximadamente -10,7 mV, más alto que el de las micelas de Si QD. La explicación del fenómeno anterior podría ser la siguiente:hay muchos grupos carboxilo en la superficie de las micelas de Si QD; por lo tanto, las micelas de Si QD exhibieron una fuerte electricidad negativa. Sin embargo, en las micelas Si QD-CKAP4, el acoplamiento del anticuerpo CKAP4 condujo a la disminución de los grupos carboxilo en la superficie de las micelas Si QD-CKAP4; por lo tanto, el potencial zeta promedio de las micelas Si QD-CKAP4 aumentó.

El espectro de absorción UV-visible mostró que la absorción de las micelas de Si QD-CKAP4 varió de 200 a 500 nm, similar al resultado de las micelas de Si QD (Fig. 2a). Con una longitud de onda de excitación de 330 nm, se observó una fuerte fluorescencia a 640 nm a partir de las micelas de Si QD-CKAP4 en los espectros de emisión de fluorescencia (Fig. 2b). Estos resultados indicaron que la conjugación de anticuerpos no ejerció una influencia significativa sobre las propiedades de fluorescencia de las micelas Si QD-CKAP4. La solución acuosa de Si QD micelas-CKAP4 (concentración de Si:80 µg / ml) era transparente y clara a la luz natural. Bajo luz UV de 365 nm, podría emitir una fuerte fluorescencia roja, consistente con los resultados de las micelas Si QD (Fig. 2c). Las pruebas PL QY mostraron que el PL QY absoluto de las micelas Si QD-CKAP4 era aproximadamente del 16,96%.

Prueba de citotoxicidad de Si QD Micelles-CKAP4 In Vitro

La línea celular de cáncer de pulmón humano A549 y la línea celular epitelial renal humana 293 T se utilizaron como células diana para investigar la bioseguridad de las micelas Si QD y las micelas Si QD-CKAP4. En este estudio, diferentes concentraciones de micelas de Si QD y micelas de Si QD-CKAP4 (concentración de Si 0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76 y 152 µg / mL) se incubaron primero con células T A549 o 293 a 37ºC. ° C durante 2 h. La viabilidad celular se detectó utilizando azul tripán (Fig. 3) [15]. El ID50 de las micelas Si QD y las micelas Si QD-CKAP4 se obtuvo utilizando el software GraphPad. Los datos mostraron que la ID50 de las micelas de Si QD era superior a 152 µg / ml en las células T A549 y 293. La ID50 de las micelas de Si QD-CKAP4 fue de 25,94 µg / ml en células A549 y de 72,69 µg / ml en células T 293. Estos resultados indicaron que la citotoxicidad de las micelas Si QD-CKAP4 fue significativamente mayor que la de las micelas Si QD y la citotoxicidad de las micelas Si QD-CKAP4 en las células A549 fue significativamente mayor que la de las células T 293. Este fenómeno puede deberse a la citotoxicidad dependiente del complemento [17]. Además, estos resultados también indicaron que Si QD micelas-CKAP4 mostró mayor seguridad biológica en células normales que en células de cáncer de pulmón, lo que sentó las bases para su aplicación in vivo.

Viabilidad celular de A549 a y 293 T b incubadas con diferentes concentraciones de micelas de Si QD y micelas de Si QD-CKAP4 (concentración de Si:0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76 y 152 µg / mL) durante 2 h ( n =3; media ± DE; ANOVA bidireccional con la prueba posterior de Dunnett; * P <0,05; ** P <0,01; y *** P <0,001)

Si QD Micelles-CKAP4 dirigido a células de cáncer de pulmón in vitro

Para investigar más a fondo la función de dirección de las micelas Si QD-CKAP4 en células de cáncer de pulmón in vitro, se utilizaron células T A549 y 293 como células diana. Las micelas Si QD y las micelas Si QD-CKAP4 se incubaron primero con células T A549 y 293 a 37 ° C durante 2 h. El efecto de focalización se detectó mediante microscopía confocal láser (Fig. 4). Los resultados mostraron que la fluorescencia roja en las micelas de Si QD-CKAP4 incubadas en A549 fue significativamente mayor que la de las micelas de Si QD-CKAP4 y el grupo de co-incubación 293 T, las micelas de Si QD y el grupo de co-incubación de A549, y las micelas de Si QD y grupo de co-incubación 293 T. Estos resultados indicaron que el Si QD micelas-CKAP4 podría apuntar específicamente a las células A549 in vitro.

Detección de la capacidad de las micelas de Si QD-CKAP4 dirigidas a células A549 in vitro. un Se incubaron A549 y 293 T con micelas de Si QD-CKAP4 y micelas de Si QD (la concentración de Si 150 µg / ml) a 37 durante 2 h. Después de descartar el sobrenadante y lavar dos veces, las células se representaron mediante un microscopio de barrido láser confocal (Bar, 25 µm). b ImageJ ( n midió un análisis cuantitativo de la intensidad fluorescente media =3; media ± DE; ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Dunnett; *** P <0,001)

Si QD Micelles-CKAP4 Dirigido a tejidos de cáncer de pulmón in vitro

Para explorar la posibilidad de que Si QD micelas-CKAP4 se dirija a tejidos de cáncer de pulmón, diseñamos un experimento in vitro para verificar la propiedad de focalización de Si QD micelas-CKAP4 a los tejidos A549. En este estudio, se inocularon células A549 por vía subcutánea en los ratones. Después de la formación del tumor, se recogieron tejidos tumorales A549 y tejidos pulmonares normales y se incubaron con micelas Si QD y micelas Si QD-CKAP4 a 37ºC durante 2 h. El efecto de focalización se detectó mediante microscopía confocal láser (Fig. 5). Los resultados mostraron que el tejido A549 incubado con Si QD micelas-CKAP4 podía emitir una fuerte fluorescencia roja a una longitud de onda de excitación de 405 nm. Sin embargo, sólo se observó una débil fluorescencia roja en los tejidos A549 incubados con micelas de Si QD, tejido pulmonar normal incubado con micelas Si QD-CKAP4 y tejido pulmonar normal incubado con micelas Si QD. La fluorescencia roja en el tejido A549 incubado con micelas Si QD-CKAP4 fue significativamente mayor que la de los tejidos A549 incubados con micelas Si QD, tejido pulmonar normal incubado con micelas Si QD-CKAP4 y tejido pulmonar normal incubado con micelas Si QD. Estos datos indican que el Si QD micelas-CKAP4 podría dirigirse eficazmente a los tejidos del cáncer de pulmón in vitro, que se supone que es un agente de contraste fluorescente potencial para el cáncer de pulmón.

Detección de la capacidad de direccionamiento de Si QD micelas-CKAP4 al tejido A549 in vitro. un Se cultivaron tejido A549 y tejido pulmonar normal con micelas de Si QD-CKAP4 y micelas de Si QD (la concentración de Si:150 µg / ml) a 37 durante 2 h. Después de lavar dos veces, los tejidos se tiñeron con DAPI para visualizar el núcleo. Los tejidos se fotografiaron mediante un microscopio de barrido láser confocal (Bar, 200 µm). b ImageJ ( n midió un análisis cuantitativo de la intensidad media de fluorescencia roja) =3; media ± DE; ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Dunnett; *** P <0,001)

Fluorescence-Imaging In Vivo

Nine tumor-bearing mice were divided into three groups (Si QD micelles-CKAP4 injection group, Si QD micelles injection group, and saline injection group). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

un Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n  = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *P  < 0.05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Discussion

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Conclusions

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Disponibilidad de datos y materiales

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abreviaturas

Si QD:

Si quantum dot

Si QD micelles-CKAP4:

CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles

Dodecyl-Si QDs:

Dodecyl-passivated Si QDs

BSA:

Albúmina de suero bovino

THF:

Tetrahidrofurano

DMEM:

Dulbecco’s modified eagle’s medium

PBS:

Phosphate buffer saline

FBS:

Fetal bovine serum

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

DLS:

Dispersión de luz dinámica

XPS:

Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

FTIR:

Fourier transform infrared spectroscopy

XRD:

Difracción de rayos X

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole

H&E:

Hematoxylin and eosin

Ge MOSFET de canal N con dieléctrico ZrO2 Logrando una movilidad mejorada Los fotodetectores basados ​​en heterouniones laterales monocapa MoS2 / WS2