Micelas de Puntos Cuánticos de Silicio Conjugadas con CKAP4: Nuevo Agente de Imagen Dirigido para Cáncer de Pulmón

Resumen

Actualmente, diversos nanomateriales fluorescentes se han diseñado y sintetizado como agentes de contraste óptico para navegación quirúrgica. Sin embargo, no hay reportes sobre preparación de agentes de contraste fluorescentes para navegación quirúrgica de cáncer de pulmón usando puntos cuánticos de silicio (Si QDs). Este estudio mejoró y modificó las micelas Si QD dispersables en agua reportadas por Pi et al. para preparar micelas Si QD-CKAP4. Los datos mostraron que micelas Si QD-CKAP4 eran partículas esféricas con hidrodiametro medio ~78.8 nm. Absorción UV-vis de micelas Si QD-CKAP4 varió 200-500 nm. Con longitud onda excitación 330 nm, fluorescencia fuerte a 640 nm observada en espectros emisión. Microscopía confocal láser y ensayo microscopía fluorescencia mostraron que micelas Si QD-CKAP4 exhiben buena capacidad direccionamiento a células y tejidos cáncer pulmón in vitro. Ensayo imagen fluorescencia in vivo mostró que micelas Si QD-CKAP4 metabolizadas por hígado y excretadas por riñón. Además, micelas Si QD-CKAP4 dirigieron específicamente tejido cáncer pulmón in vivo comparado con tejido pulmón sano. Ensayos citotoxicidad y tinción hematoxilina-eosina mostraron que micelas Si QD-CKAP4 exhiben alta bioseguridad in vitro e in vivo. Micelas Si QD-CKAP4 son agente imagen dirigido específicamente para cáncer pulmón y se espera sean agente contraste fluorescente para navegación quirúrgica cáncer pulmón futuro.

Introducción

El cáncer es una de las principales enfermedades que amenazan la salud humana mundialmente. Entre ellos, incidencia y mortalidad cáncer pulmón son las más altas entre todos los tumores malignos y muestran tendencia creciente anual. Resección quirúrgica es tratamiento primario tumores sólidos. Sin embargo, métodos diferenciar tejido maligno de sano se limitan principalmente a señales táctiles y visuales y experiencia cirujano. En años recientes, cirugía guiada fluorescencia se ha vuelto popular en investigación guía intraoperatoria tiempo real resección tumores. Con ayuda agente contraste fluorescencia e sistema imagen fluorescencia, cirujanos pueden usar guía imagen tiempo real para reseccionar tumores primarios e identificar tumores residuales en cavidad operatoria. Comparado con métodos imagen biomédica tradicionales, sistema imagen fluorescencia ofrece ventajas: ausencia radiación ionizante y alta resolución espacial. Actualmente, investigadores han reportado diversos nanomateriales fluorescentes para imagen biológica. Entre ellos, puntos cuánticos silicio (Si QDs) se han vuelto populares en campo imagen biológica. Sin embargo, no hay reportes sobre preparación agentes contraste fluorescentes para navegación quirúrgica cáncer pulmón usando Si QDs. En 2014, Pi et al. reportaron método síntesis micelas Si QD dispersables en agua novedosas. Datos mostraron ventajas: tamaño controlable, alta eficiencia cuántica fluorescencia, excelente estabilidad lumínica. Este estudio busca mejorar y modificar micelas Si QD solubles en agua reportadas por Pi et al. para preparar nuevo agente contraste fluorescente, esperado para navegación cirugía cáncer pulmón futuro. En 2018, Yanagita et al. reportaron CKAP4 altamente expresado en suero y tejidos cáncer pacientes pulmón, pudiendo usarse como nuevo biomarcador diagnóstico temprano cáncer pulmón. Por tanto, micelas Si QD conjugadas anticuerpo CKAP4 podrían ser nuevo agente contraste fluorescente para navegación cirugía cáncer pulmón. En este estudio, DSPE-PEG-COOH usado para preparar micelas Si QD con grupos carboxilo en superficies. Luego conjugamos anticuerpo CKAP4 con micelas Si QD usando EDC. Resultados mostraron micelas Si QD-CKAP4 dispersaron bien en solución acuosa. Exhibieron fluorescencia roja fuerte bajo irradiación luz UV 365 nm. Debido conjugación anticuerpo, micelas Si QD-CKAP4 mostraron buena capacidad direccionamiento células y tejidos cáncer pulmón tanto in vitro como in vivo. Además, micelas Si QD-CKAP4 exhibieron alta bioseguridad tanto in vitro como in vivo. En este estudio, preparamos agente contraste fluorescente potencial para navegación cirugía cáncer pulmón.

Métodos

Reactivos

Albúmina sérica bovina (BSA) Sigma (ensayo ≥98%; Missouri, EE.UU.); tetrahidrofurano (THF) Adamas-beta (pureza 99.9%; Basilea, Suiza); DSPE-PEG-COOH Aladdin (Shanghai, China); anticuerpo CKAP4 Abcam (0.55 mg/mL; Cambridge, UK); medio DMEM y tampón fosfato salino (PBS) Hyclone (Utah, EE.UU.); suero fetal bovino (FBS) y tripsina Gibco (Nueva York, EE.UU.); paraformaldehído (4%), tampón permeabilización inmunotinción con Triton X-100 y tampón bloqueo inmunotinción Beyotime (Shanghai, China); glicerina Solarbio (pureza ≥99%; Beijing, China); tripsina Kingmorn (0.25%; Shanghai, China).

Instrumentación

Imágenes microscopía electrónica transmisión (TEM) JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japón). Hidrodiametro JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). Espectros absorción UV-Vis Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, EE.UU.). Espectro emisión fluorescencia F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japón). Fotoelectrónica rayos X (XPS) sistema RBD-actualizado PHI-5000C ESCA (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.). Rendimientos cuánticos fotoluminiscencia (PL QYs) estimados espectrómetro fluorescencia (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Inglaterra). Espectroscopía infrarroja transformada Fourier (FTIR) Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.). Difracción rayos X (XRD) SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Japón).

Células

Líneas celulares A549 y 293T compradas Instituto Biología Celular Shanghai (Shanghai, China).

Preparación Micelas Si QD

Primero, dodecil-Si QDs preparados por reacción hidrosililación y disueltos THF para preparar solución dodecil-Si QDs (15 mg/mL) según método reportado previamente. Luego, 20 mg DSPE-PEG-COOH disueltos y mezclados en 10 mL agua desionizada para preparar solución DSPE-PEG-COOH (2 mg/mL, 10 mL). Subsecuentemente, solución dodecil-Si QDs (15 mg/mL, 66 µL) añadida gota a gota a 10 mL solución DSPE-PEG-COOH. Tras agitación ultrasónica 3 min, solución clara y transparente obtenida. Solución colocada campana extracción y agitada 12 h en oscuridad. Posteriormente, solución dializada 24 h y liofilizada 3 días para obtener micelas Si QD.

Preparación Micelas Si QD-CKAP4

Anticuerpo CKAP4 conjugado con micelas Si QD activando grupo carboxilo por EDC. Método: 4 mg micelas Si QD dispersados en 900 µL PBS para preparar solución micelas Si QD. EDC (10 mg) añadido a 100 µL PBS para preparar solución EDC. Luego, 100 µL solución EDC añadidos lentamente a 900 µL micelas Si QD, con agitación ultrasónica 5 min. Además, 20 µL anticuerpo CKAP4 añadidos lentamente, mezcla agitada 2 h temperatura ambiente en oscuridad. Producto ultrafiltrado 4000 rpm 15 min. Tras lavado PBS tres veces, producto denominado micelas Si QD-CKAP4.

Ensayo Citotoxicidad

Azul tripano usado probar bioseguridad nanomateriales. Células A549 y 293T incubadas placa 24 pocillos (1×10⁶/pocillo) 37 °C 12 h. Tras desechar medio, series concentraciones micelas Si QD o Si QD-CKAP4 (concentración Si: 0-152 µg/mL) añadidas placa 24 pocillos e incubadas 37 °C 2 h. Tras desechar medio, células recogidas y lavadas dos veces PBS. Azul tripano mezclado suspensión celular ratio 1:1. Número células vivas y muertas detectado y registrado usando Countstar. Viabilidad celular (%) = células vivas/(células vivas + muertas) × 100. Tres réplicas biológicas. Software Prism (versión 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.) para análisis estadístico. Datos analizados ANOVA bidireccional con prueba post-hoc Dunnett. Significancia estadística P < 0.05. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

Direccionamiento Nanomateriales Células Cáncer Pulmón In Vitro

Capacidad direccionamiento micelas Si QD y Si QD-CKAP4 a células cáncer pulmón in vitro detectada: Primero, células A549 incubadas platos confocales láser (3×10⁵ células/plato) 37 °C 12 h. Tras desechar medio, células lavadas tres veces PBS. Subsecuentemente, 1 mL paraformaldehído (4%) añadido células e incubado 25 °C 10 min. Tras desechar paraformaldehído, células lavadas PBS tres veces. Luego, 1 mL tampón permeabilización inmunotinción con Triton X-100 añadido células e incubado 25 °C 10 min. Tras desechar tampón, células lavadas tres veces PBS. Subsecuentemente, 1 mL tampón bloqueo inmunotinción añadido células e incubado 25 °C 10 min. Tras desechar tampón, células lavadas tres veces PBS. Luego, 200 µL micelas Si QD o Si QD-CKAP4 (concentración Si 150 µg/mL) añadidos células e incubado 37 °C 2 h. Tras desechar nanomateriales, células lavadas tres veces PBS. Fotografías tomadas microscopio confocal láser (Leica, Wetzlar, Alemania). Luz excitación 405 nm, longitud onda emisión 630 nm. Capacidad direccionamiento micelas Si QD y Si QD-CKAP4 a células normales in vitro detectada similarmente con células 293T. Tres experimentos independientes. Análisis cuantitativo intensidad fluorescencia media realizado software ImageJ (Bethesda, MD, EE.UU.). Prism software (versión 7.01) análisis estadístico. Datos analizados ANOVA unidireccional con prueba post-hoc Dunnett. Significancia P < 0.05. ***P < 0.001.

Modelo Ratones Portadores Tumor

Diez ratones nu/nu machos (5-6 semanas) comprados Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos ratones alojados condiciones SPF Centro Experimental Animales Universidad Tongji (Shanghai, China). Establecer modelo ratón portador tumor, ratones inyectados subcutáneamente 1×10⁶ células A549. Ratones portadores tumor usados experimento cuando diámetro tumor alcanzó 6 mm. Todos experimentos ratones realizados según directrices institucionales y aprobados Comité Uso y Cuidado Animales Institucional Universidad Tongji.

Direccionamiento Micelas Si QD-CKAP4 Tejidos Cáncer Pulmón In Vitro

Ratones portadores tumor sacrificados bajo anestesia. Tumor y tejido pulmón normal recogidos para preparar secciones parafina. Tras deshidratación, recuperación antígeno, bloqueo suero, micelas Si QD o Si QD-CKAP4 (concentración Si 150 µg/mL) añadidos tejidos e incubados 37 °C 2 h. Tras desechar nanomateriales, tejidos lavados tres veces PBS. Tejidos teñidos 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 10 min. Tras lavado tres veces PBS, medio antifade añadido tejidos e incubado 25 °C 5 min. Tras desechar medio antifade, tejidos lavados tres veces PBS. Fotografías tomadas microscopio fluorescencia (Nikon, Tokyo, Japón) longitud onda excitación 405 nm, emisión 630 nm. Tres experimentos independientes. Análisis cuantitativo intensidad fluorescencia roja media software ImageJ. Prism software (versión 7.01) análisis estadístico. Datos analizados ANOVA unidireccional con prueba post-hoc Dunnett. Significancia P < 0.05. ***P < 0.001.

Imagen Fluorescencia In Vivo

Nueve ratones portadores tumor divididos tres grupos (inyección micelas Si QD-CKAP4, inyección micelas Si QD, inyección suero fisiológico). Ratones grupo inyección micelas Si QD-CKAP4 inyectados por vena cola 200 µL micelas Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg). Grupo micelas Si QD inyectados 200 µL micelas Si QD (Si: 4 mg/kg). Grupo suero inyectados 200 µL suero. Imágenes fluorescencia adquiridas diferentes puntos tiempo (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 h). Ratones grupo inyección micelas Si QD-CKAP4 anestesiados y sacrificados 4 h detectar señal fluorescencia corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón, tumor. Imagen fluorescencia realizada VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Corea) set filtro PE (λ_excitación 450-500 nm, λ_emisión 600-650 nm). Prism software (versión 7.01) análisis estadístico. Datos analizados ANOVA unidireccional con prueba post-hoc Dunnett. Significancia P < 0.05. *P < 0.05; **P < 0.01.

Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E)

Doce ratones portadores tumor inyectados suero (200 µL), micelas Si QD (Si: 4 mg/kg, 200 µL), o micelas Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg, 200 µL) vena cola. Tras 24 h, ratones sacrificados. Tinción H&E realizada corazones, hígados, bazos, pulmones, riñones. Cambios patológicos observados microscopio óptico.

Resultados

Preparación y Caracterización Micelas Si QD

Primero, dodecil-Si QDs preparados por hidrosililación según reporte previo (Esquema 1, Paso 1). Similar a datos reportados, dodecil-Si QDs sintetizados por nuestro grupo dispersaron bien en metilbenceno. TEM mostró dodecil-Si QDs esféricos tamaños relativamente uniformes. Diámetro dodecil-Si QDs en imágenes TEM medido software ImageJ: 4.1-5.3 nm, diámetro medio ~4.7 nm (Fig. 1a). En imágenes ampliadas, franjas red evidentes observadas (Fig. 1a). Distancia plano red medida ImageJ: distancia media ~0.35 nm, casi igual reportado dodecil-Si QDs (0.34 nm). Por tanto, dodecil-Si QDs sintetizados mostraron buena cristalinidad. Dispersión luz dinámica (DLS) mostró hidrodiametros dodecil-Si QDs 4.8-13.5 nm, media 6.5 nm (Fig. 1b). Para preparar micelas Si QD dispersables agua, dodecil-Si QDs modificados por autoensamblaje DSPE-PEG-COOH (Esquema 1, Paso 2). Aquí, DSPE-PEG-COOH usado en lugar F127 para preparar micelas Si QD con grupos carboxilo en superficie. Resultados mostraron micelas Si QD dispersaron bien en agua. TEM imágenes mostraron micelas Si QD partículas esféricas con Si QDs insertados. Diámetro micelas Si QD 22.7-54.6 nm, diámetro medio ~34.3 nm (Fig. 1c). DLS mostró hidrodiametros micelas Si QD 43.8-615.9 nm, media 58.7 nm (Fig. 1d). Potencial zeta medio micelas Si QD ~ -20.7 mV. FTIR realizado investigar composición micelas Si QD (Archivo Adicional 1: Figura S1A). Datos mostraron picos absorción vibración estiramiento N-H, C-H, O-H, C=O a 3430, 2920, 2850, 1640 cm⁻¹; picos vibración flexión C-H, O-H a 1460, 1400 cm⁻¹; picos vibración estiramiento Si-C, C-O, P-O-C a 1250, 1100, 951 cm⁻¹; picos vibración flexión Si-H, O=C-N a 850, 526 cm⁻¹. Estos datos muestran grupos característicos DSPE-PEG-COOH (N-H, O-H, C=O, C-O, P-O-C, O=C-N) y grupos característicos dodecil-Si QDs (Si-C, Si-H) encontrados en espectro FTIR micelas Si QD, indicando dodecil-Si QDs encapsulados exitosamente en micelas autoensambladas DSPE-PEG-COOH. Además, micelas Si QD caracterizadas XRD (Archivo Adicional 1: Figura S1B). Pico difracción micelas Si QD agudo, indicando buena cristalinidad. En patrón XRD, picos 2θ 27.073, 28.451, 56.598, 73.145 corresponden planos (100), (002), (112), (203) silicio (PDF #80-0005), indicando Si QDs encapsulados exitosamente en micelas Si QD. Picos 2θ 31.692, 45.431, 66.200, 75.260, 83.955 corresponden planos (200), (220), (400), (420), (422) NaCl (PDF #77-2064). Explicación racional presencia NaCl: tras preparación micelas Si QD, disolvimos micelas Si QD en PBS, llevando presencia NaCl. Espectro absorción UV-vis mostró absorción micelas Si QD 200-500 nm (Fig. 2a). Con longitud onda excitación 330 nm, fluorescencia fuerte 650 nm observada espectros emisión micelas Si QD (Fig. 2b). Solución acuosa micelas Si QD (concentración Si: 80 µg/mL) transparente y clara luz natural; sin embargo, emitía fluorescencia roja fuerte bajo luz UV 365 nm (Fig. 2c). Rendimientos cuánticos absolutos PL probados espectrómetro fluorescencia (FLS1000). Longitud onda excitación 365 nm. Datos mostraron PL QY absoluto micelas Si QD ~14.49%.

Preparación y Caracterización Micelas Si QD-CKAP4

Conjugamos anticuerpo CKAP4 con micelas Si QD usando EDC (Esquema 1, Paso 3). TEM imágenes mostraron micelas Si QD-CKAP4 partículas esféricas con Si QDs insertados. Diámetro micelas Si QD-CKAP4 24.4-67.7 nm, diámetro medio ~35.5 nm (Fig. 1e). DLS mostró hidrodiametros micelas Si QD-CKAP4 58.7-824.9 nm, media 78.8 nm, ligeramente mayor que micelas Si QD (Fig. 1f). Incremento puede deberse conjugación anticuerpo CKAP4. Espectros XPS C1s mostraron seis tipos átomos carbono región C1s: C(O)O (288.81 eV), C=O (286.5 eV), C-O (285.76 eV), C-N (285.25 eV), C-C (284.88 eV), C-H (284.34 eV) (Fig. 1g). Sin embargo, pico C(O)O casi desapareció espectros XPS micelas Si QD-CKAP4, indicando conjugación exitosa entre grupos carboxilo y aminas primarias; por tanto, anticuerpo CKAP4 conjugado exitosamente con micelas Si QD (Fig. 1h). Potencial zeta medio micelas Si QD-CKAP4 ~ -10.7 mV, mayor que micelas Si QD. Explicación: muchos grupos carboxilo en superficie micelas Si QD; por tanto, micelas Si QD exhiben electricidad negativa fuerte. Sin embargo, en micelas Si QD-CKAP4, acoplamiento anticuerpo CKAP4 llevó a disminución grupos carboxilo en superficie; por tanto, potencial zeta medio aumentó. Espectro absorción UV-vis mostró absorción micelas Si QD-CKAP4 200-500 nm, similar resultado micelas Si QD (Fig. 2a). Con longitud onda excitación 330 nm, fluorescencia fuerte 640 nm observada micelas Si QD-CKAP4 espectros emisión (Fig. 2b). Resultados indicaron conjugación anticuerpo no influyó significativamente propiedades fluorescencia micelas Si QD-CKAP4. Solución acuosa micelas Si QD-CKAP4 (concentración Si: 80 µg/mL) transparente y clara luz natural. Bajo luz UV 365 nm, emitía fluorescencia roja fuerte, consistente resultados micelas Si QD (Fig. 2c). Pruebas PL QY mostraron PL QY absoluto micelas Si QD-CKAP4 ~16.96%.

Ensayo Citotoxicidad Micelas Si QD-CKAP4 In Vitro

Línea celular cáncer pulmón humano A549 y línea celular epitelial renal humano 293T usadas como células objetivo investigar bioseguridad micelas Si QD y Si QD-CKAP4. Diferentes concentraciones micelas Si QD y Si QD-CKAP4 (concentración Si 0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76, 152 µg/mL) incubadas con A549 o 293T a 37 °C 2 h. Viabilidad celular detectada azul tripano (Fig. 3). ID50 micelas Si QD y Si QD-CKAP4 obtenido software GraphPad. Datos mostraron ID50 micelas Si QD >152 µg/mL en A549 y 293T. ID50 micelas Si QD-CKAP4 25.94 µg/mL en A549 y 72.69 µg/mL en 293T. Resultados indicaron citotoxicidad micelas Si QD-CKAP4 significativamente mayor que micelas Si QD y citotoxicidad micelas Si QD-CKAP4 en A549 significativamente mayor que 293T. Fenómeno puede deberse citotoxicidad dependiente complemento. Además, resultados indicaron micelas Si QD-CKAP4 mostraron mayor seguridad biológica en células normales que cáncer pulmón, sentando base aplicación in vivo.

Direccionamiento Micelas Si QD-CKAP4 Células Cáncer Pulmón In Vitro

Investigar función direccionamiento micelas Si QD-CKAP4 células cáncer pulmón in vitro, A549 y 293T usadas como células objetivo. Micelas Si QD y Si QD-CKAP4 incubadas primero con A549 y 293T a 37 °C 2 h. Efecto direccionamiento detectado microscopía confocal láser (Fig. 4). Resultados mostraron fluorescencia roja en A549 incubadas micelas Si QD-CKAP4 significativamente mayor que grupos co-incubación Si QD-CKAP4/293T, Si QD/A549, Si QD/293T. Resultados indicaron micelas Si QD-CKAP4 podrían dirigirse específicamente células A549 in vitro.

Direccionamiento Micelas Si QD-CKAP4 Tejidos Cáncer Pulmón In Vitro

Explorar posibilidad micelas Si QD-CKAP4 dirigirse tejidos cáncer pulmón, diseñamos experimento in vitro verificar propiedad direccionamiento micelas Si QD-CKAP4 tejidos A549. Células A549 inoculadas subcutáneamente ratones. Tras formación tumor, tejidos tumor A549 y tejidos pulmón normales recogidos e incubados micelas Si QD y Si QD-CKAP4 a 37 °C 2 h. Efecto direccionamiento detectado microscopía confocal láser (Fig. 5). Resultados mostraron tejido tumor A549 incubado micelas Si QD-CKAP4 emitía fluorescencia roja fuerte longitud onda excitación 405 nm. Sin embargo, solo fluorescencia roja débil observada tejidos tumor A549 incubados micelas Si QD, tejido pulmón normal incubado micelas Si QD-CKAP4, y tejido pulmón normal incubado micelas Si QD. Fluorescencia roja en tejido tumor A549 incubado micelas Si QD-CKAP4 significativamente mayor que otros tres grupos. Datos indican micelas Si QD-CKAP4 pueden dirigir eficazmente tejidos cáncer pulmón in vitro, supuesto agente contraste fluorescente potencial cáncer pulmón.

Imagen Fluorescencia In Vivo

Nueve ratones portadores tumor divididos tres grupos. Ratones grupo inyección micelas Si QD-CKAP4 inyectados por vena cola 200 µL micelas Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg). Grupo micelas Si QD inyectados 200 µL micelas Si QD (Si: 4 mg/kg). Grupo suero inyectados 200 µL suero. Imágenes fluorescencia adquiridas diferentes puntos tiempo (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 h). Señales fluorescencia significativas no observadas tejidos cáncer pulmón entre todos ratones tres grupos (datos no mostrados). Puede deberse penetración fluorescencia débil micelas Si QD-CKAP4 y Si QD. Ratones grupo inyección micelas Si QD-CKAP4 anestesiados y sacrificados 4 h detectar señal fluorescencia corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón, tumor. Datos mostraron señal fluorescencia significativa observada hígado, riñón, tejidos tumor. Sin embargo, no señal significativa corazón, bazo, tejidos pulmón sanos (Fig. 6). Señal significativa hígado y riñón indicó micelas Si QD-CKAP4 metabolizadas por hígado y excretadas por riñón. Además, señal fluorescencia tejidos tumor A549 significativamente mayor que tejidos pulmón sanos. Fenómeno contribuyó capacidad direccionamiento micelas Si QD-CKAP4 tejidos cáncer pulmón. Resultados indican micelas Si QD-CKAP4 dirigen específicamente tejido cáncer pulmón, esperado agente contraste fluorescente navegación quirúrgica cáncer pulmón futuro.

Evaluación Bioseguridad Micelas Si QD-CKAP4 In Vivo

Finalmente, investigamos toxicidad aguda micelas Si QD-CKAP4 in vivo. Doce ratones portadores tumor inyectados por vena cola suero (200 µL), micelas Si QD (Si: 4 mg/kg, 200 µL), o micelas Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg, 200 µL) y sacrificados 24 h después. Imágenes tinción H&E corazón, hígado, bazo, pulmones, riñones mostradas Fig. 7. Comparado ratones inyectados suero, no cambios patológicos evidentes órganos principales ratones inyectados micelas Si QD y micelas Si QD-CKAP4. Datos indicaron micelas Si QD (Si: 4 mg/kg) y micelas Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg) no mostraron toxicidad significativa in vivo.

Discusión

Actualmente, diversos nanomateriales fluorescentes diseñados y sintetizados como agentes contraste óptico navegación quirúrgica. En 2020, On et al. prepararon nanopartículas quitosano glicol conjugadas fluoróforo [verde indocianina (ICG) o cianina 5.5 (Cy5.5)] como agente contraste fluorescente navegación cirugía cáncer pulmón. Sin embargo, no reportes sobre preparación agentes contraste fluorescentes navegación cirugía cáncer pulmón usando Si QDs. Este estudio sintetizó exitosamente micelas Si QD-CKAP4, que podrían dirigir imagen tejidos cáncer pulmón. Micelas Si QD-CKAP4 esperadas usarse como agente contraste óptico navegación cirugía cáncer pulmón futuro. Ventajas micelas Si QD-CKAP4: (1) Sintetizamos primer agente contraste fluorescente navegación cirugía cáncer pulmón usando Si QDs, expandiendo caja herramientas biblioteca navegación cirugía cáncer pulmón. (2) Optimizamos micelas Si QD dispersables agua reportadas Pi et al. para añadir capacidad direccionamiento micelas Si QD. Proporciona nueva posibilidad aplicar Si QDs campo biomédico. (3) Principio direccionamiento micelas Si QD-CKAP4 cáncer pulmón basado alta expresión proteína CKAP4 tejido cáncer pulmón. Debido conjugación anticuerpo CKAP4, micelas Si QD-CKAP4 podían dirigir activamente tejido cáncer pulmón. Comparado nanomateriales dirigen pasivamente tumores vía efecto EPR, micelas Si QD-CKAP4 mostraron mayor especificidad tejido cáncer pulmón. (4) Micelas Si QD-CKAP4 mostraron toxicidad selectiva células tumorales rango concentraciones específico. Por tanto, micelas Si QD-CKAP4 mostraron alta seguridad biológica rango concentraciones fármaco racionales, exhibiendo valor aplicación clínica potencial. Pruebas PL QY mostraron PL QY absoluto micelas Si QD ~14.49% y micelas Si QD-CKAP4 ~16.96%. Estudio Pi et al. mostró PL QY dodecil-Si QDs ~26%, muy alto para Si QDs emiten luz roja pico PL <700 nm. Sin embargo, PL QY micelas Si QD este estudio ~14.49%, menor que dodecil-Si QDs. Puede deberse defectos superficie introducidos durante proceso emulsión, casi consistente con disminución PL QY micelas Si-QD (dodecil-Si QDs encapsulados micelas autoensambladas F127 en emulsión) estudio reportado Pi et al. En este estudio, PL QY micelas Si QD-CKAP4 ~16.96%, ligeramente mayor que micelas Si QD (14.49%). Podría ser porque en micelas Si QD-CKAP4, acoplamiento anticuerpo CKAP4 reparó algunos defectos superficie micelas Si QD, llevando ligera mejora PL QY. Como sabemos, hay desafío aplicaciones imagen biológica Si QDs: Aunque Si exhibe poca citotoxicidad, partículas Si pueden exhibir citotoxicidad al disminuir tamaño cierto extent. En este estudio, ensayos citotoxicidad mostraron micelas Si QD-CKAP4 exhibieron citotoxicidad selectiva células cáncer pulmón 9.5-19 µg/mL. Por resultado conjugación anticuerpo CKAP4, citotoxicidad micelas Si QD-CKAP4 células normales significativamente menor que células cáncer pulmón, proporcionando condición poderosa aplicación biológica micelas Si QD-CKAP4. En este estudio, línea celular cáncer pulmón humano A549 y línea celular epitelial renal humano 293T usadas investigar capacidad direccionamiento micelas Si QD y Si QD-CKAP4. A549 y 293T células adherentes y semi-adherentes respectivamente. Durante experimento, número células 293T disminuyó por centrifugados y lavados repetidos. Por tanto, como muestra Fig. 4, número células 293T menor que A549. Además, debe notarse que células A549 pertenecen línea celular cáncer pulmón tipo salvaje p53. Por tanto, solo células A549 no reflejan completamente capacidad direccionamiento micelas Si QD-CKAP4 cáncer pulmón. Estudios futuros probarán capacidad direccionamiento e imagen micelas Si QD-CKAP4 líneas celulares p53-negativas (ej. H1299) base experimental sólida aplicación clínica micelas Si QD-CKAP4.

Conclusiones

Este estudio mejoró y modificó micelas Si QD reportadas Pi et al. para preparar micelas Si QD-CKAP4 dispersables agua. Micelas Si QD-CKAP4 partículas esféricas hidrodiametro medio ~78.8 nm. Absorción UV-vis micelas Si QD-CKAP4 200-500 nm. Con longitud onda excitación 330 nm, fluorescencia fuerte 640 nm observada espectros emisión. Micelas Si QD-CKAP4 exhibieron buena capacidad direccionamiento células cáncer pulmón y tejidos cáncer pulmón tanto in vitro como in vivo. Además, ensayo imagen fluorescencia in vivo mostró micelas Si QD-CKAP4 metabolizadas por hígado y excretadas por riñón. Ensayos citotoxicidad y tinción H&E mostraron micelas Si QD-CKAP4 exhibieron alta bioseguridad tanto in vitro como in vivo. Micelas Si QD-CKAP4 son agente imagen dirigido específicamente cáncer pulmón y se espera sean agente contraste fluorescente navegación quirúrgica cáncer pulmón futuro.

Disponibilidad Datos y Materiales

Datos y análisis trabajo actual disponibles autores correspondientes solicitud razonable.

Abreviaturas

Si QD:

Punto cuántico Si

Si QD micelles-CKAP4:

Micelas punto cuántico Si conjugadas anticuerpo CKAP4

Dodecyl-Si QDs:

Si QDs pasivados dodecilo

BSA:

Albúmina sérica bovina

THF:

Tetrahidrofurano

DMEM:

Medio modificado Dulbecco eagle

PBS:

Tampón fosfato salino

FBS:

Suero fetal bovino

TEM:

Microscopía electrónica transmisión

DLS:

Dispersión luz dinámica

XPS:

Fotoelectrónica rayos X

FTIR:

Espectroscopía infrarroja transformada Fourier

XRD:

Difracción rayos X

SPF:

Libre patógenos específicos

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-fenilindol

H&E:

Hematoxilina eosina