Nanoburbujas de quitosano biocompatibles para la administración dirigida de doxorrubicina mediada por ultrasonido

Materiales y métodos

Materiales

Los NB descritos en este estudio se construyeron utilizando perfluoropropano (C3F8, Centro de I + D para gases especiales del Instituto de Investigación de Ingeniería Física y Química de la Industria Nuclear, Beijing, China) como núcleo y un recubrimiento de quitosano como caparazón. Además, Epikuron 200 (lecitina de soja que contiene 95% de dipalmitoilfosfatidilcolina, Lukas Meyer, Hamburgo, Alemania), etanol (grado analítico, Hushi, China), clorhidrato de doxorrubicina (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.), Quitosano (100 ~ 300 kD) , Bozhihuili, Qingdao, China) y ácido palmítico (JINDU, Shanghai, China) también se utilizaron en este estudio. Pluronic F68 se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Línea de celda

La línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.) Y se cultivó en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10% (Gibco, Carlsbad). , CA, EE. UU.). Las células se cultivaron a 37 ° C, 5% CO ₂ y 95% de humedad. Se recolectaron células en la fase de crecimiento logarítmico para experimentos.

Preparación de NB de quitosano cargado con DOX

Hicimos RN de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [18, 19]. Se usó quitosano de peso molecular medio (100 ~ 300 kD) para las cáscaras de los DOX-NB, y se usó perfluoropropano para el núcleo. Para preparar la solución de DOX-quitosano, se disolvió la dosis apropiada de DOX en agua ultrapura y se agregaron 2 ml de solución de DOX (1 mg / ml) a la solución de agua de quitosano mezclando con un mezclador vórtex durante 5 s. La solución de DOX-quitosano se incubó durante 1 ha 65 ° C. Por separado, se añadió una solución de etanol que contenía Epikuron 200 a una solución acuosa de ácido palmítico. Después de añadir el volumen apropiado de agua ultrapura, el sistema de ácido palmítico-Epikuron 200 se homogeneizó usando un mezclador de vórtice. Posteriormente, el sistema de ácido palmítico-Epikuron 200 se dividió en tubos Eppendorf (tubos EP) de 1,5 ml y el aire del tubo se reemplazó con perfluoropropano utilizando una jeringa de 10 ml con una aguja larga y fina. Cada tubo se hizo oscilar durante 120 s en un oscilador mecánico (mezclador de Ag y Hg, Xi’an, China). A continuación, todo el líquido de los tubos EP de 1,5 ml se vertió en un tubo de centrífuga y se combinó con la solución de DOX-quitosano en un baño de hielo. Posteriormente, la mezcla se incubó durante 30 min a -4 ° C. A continuación, una solución acuosa de Pluronic F68 (0,01%, w / w ), un agente estabilizante, se añadió a la mezcla anterior mientras se agitaba. A continuación, se realizó una etapa de purificación por diálisis (tubo de ultrafiltración para centrífuga, Millipore, 30 kDa) para eliminar cualquier DOX libre residual.

Observación de las propiedades físicas de los RN

La suspensión de DOX-NB se diluyó añadiendo una cantidad apropiada de PBS (solución salina tamponada con fosfato). A continuación, se observó la forma de los DOX-NB y se obtuvieron imágenes bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una lente de objetivo de inmersión en aceite × 100 (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Japón). Las imágenes de fluorescencia se evaluaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Nikon TE2000-S, Japón). La morfología de los DOX-NB también se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (JEOL, Tokio, Japón). Las suspensiones acuosas de nanoburbujas diluidas se rociaron sobre una rejilla de cobre recubierta con Formvar y se tiñeron con 4% de w / v acetato de uranilo durante 10 min. Luego, las muestras se visualizaron y se tomaron imágenes usando TEM. El tamaño y el potencial zeta de la superficie de los DOX-NB se midieron mediante un analizador de tamaño de partícula y potencial zeta Delsa Nano C (Beckmann Instruments, EE. UU.). Todas las mediciones se realizaron por triplicado para calcular el valor medio.

Estabilidad de DOX-NBs

El tamaño y la morfología de los DOX-NB se midieron a lo largo del tiempo para observar la estabilidad de estas nanoburbujas. Algunas partes de los DOX-NB se almacenaron en el frigorífico a 4 ° C durante 24 o 48 h. Los demás se mantuvieron a temperatura ambiente durante 6 h. La estabilidad de las nanoburbujas a 25 ° C también se investigó en suero humano liofilizado (Seronorm ™ Human, Noruega). Para ello, se añadió 1 ml de la suspensión acuosa de DOX-NBs a 1 ml de suero y se incubó durante 6 ha 25 ° C. Luego, todos los DOX-NB se midieron mediante análisis morfológico utilizando microscopía óptica para evaluar la integridad de sus estructuras. El tamaño de los NB se midió con un analizador de tamaño de partícula y potencial zeta Delsa Nano C (Beckmann Instruments, EE. UU.).

Determinación de la capacidad de carga de DOX de los NB

Se preparó una curva estándar de concentración de DOX usando diluciones de DOX en serie a concentraciones de 0.025, 0.05, 0.1 y 0.2 mg / mL y se midió usando un espectrofotómetro UV (UV-2450, SHIMADZU). Posteriormente, se evaluó la eficiencia de carga de DOX a 480 nm utilizando NB en blanco como control, y se calculó la concentración de DOX en DOX-NB en base a la curva estándar establecida anteriormente. Para evitar la fotodegradación de DOX durante el proceso de purificación y medición, todos los procedimientos se realizaron protegidos de la luz. Posteriormente, la suspensión de DOX-NB se liofilizó durante 1,5 días con un liofilizador a -55 ° C y por debajo de 0,080 mbar [20]. A continuación, se pesaron los DOX-NB liofilizados para calcular la capacidad de carga del fármaco en términos de eficiencia de encapsulación del fármaco (EE) de la siguiente manera:EE = A / B × 100%, donde A es la cantidad de DOX cargada en NB, y B es la cantidad inicial de DOX en la solución. Los experimentos se repitieron tres veces.

Lanzamiento DOX mediado por ultrasonido

La cinética de liberación in vitro de DOX de los DOX-NB se determinó en presencia y ausencia de ultrasonido (EE. UU.) Mediante la técnica de la bolsa de diálisis a 37 ° C. Los DOX-NB se encerraron en una membrana de diálisis (Spectra / Por, corte 12.000-14.000 Da), que se colocó en un recipiente de 100 ml de PBS con agitación a 100 rpm. El grupo de EE. UU. Fue tratado con ultrasonidos por EE. UU. (VCX400, Sonics and Materials, EE. UU.; Densidad de potencia, 1,0 W / cm2; frecuencia, 20 kHz) durante 40 s antes de la prueba [21]. Se midió la liberación de DOX hasta por 24 h, extrayendo 1 ml en cada tiempo fijo y reemplazando con 1 ml de PBS nuevo. Las concentraciones de DOX en el tampón externo se midieron a 480 nm mediante un espectrofotómetro UV. Los experimentos de liberación se realizaron por triplicado.

Imágenes por ultrasonido in vitro (curva de tiempo-intensidad)

Las imágenes de EE. UU. Y la estabilidad de DOX-NB bajo ultrasonido se verificaron in vitro en un sistema de escáner de ultrasonido clínico (LOGIQ E9; GE, EE. UU.). El experimento se realizó con frecuencias específicas, potencias de transmisión y duraciones de exposición al ultrasonido. Utilizando un método desarrollado previamente [19] (Fig. 5a), los DOX-NB lograron una mejora del ultrasonido. La estabilidad de las imágenes de ultrasonido de los DOX-NB se evaluó después de su exposición a un estímulo de ultrasonido con un índice mecánico (MI) de 0,10 y una profundidad de imagen de 4,5 cm. Todas las imágenes de EE. UU. Se analizaron sin conexión con Image J. Posteriormente, el análisis de imágenes se realizó utilizando el software integrado de LOGIQ E9 para calcular los valores de escala de grises de las muestras. Para cada uno de los clips de 60 s, que se obtuvieron de 0 a 15 min, primero se realizó la corrección de movimiento para cada fotograma y se obtuvo el valor en decibelios. Cada valor de decibelios se representó en una curva de intensidad de tiempo para reflejar los cambios en la mejora del contraste antes y después de la irradiación ultrasónica. La intensidad máxima y la duración de la mejora se expresaron mediante una curva de intensidad de tiempo. Durante el análisis, los valores de retrodispersión corregidos por rango se obtuvieron restando las señales de fondo correspondientes a una muestra de agua.

Ensayo de citotoxicidad para RN vacíos

La bioseguridad de los NB de quitosano vacíos se probó utilizando un kit de ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Antes del ensayo, las células MCF-7 se sembraron en placas a una densidad de 2 × 10 ³ células / pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se sometieron a tratamiento mediante concentraciones variables de NB de quitosano y condiciones de ultrasonido. La bioseguridad de los NB de quitosano se evaluó incubando células MCF-7 a concentraciones seriadas de NB de 0 a 30%. Se utilizó un equipo de estimulación por ultrasonido de baja intensidad (US10, Cosmogamma Corporation, Italia) para realizar la estimulación por ultrasonido a una frecuencia fija de 1 MHz, utilizando un ciclo de trabajo del 70% y una frecuencia de pulso de 100 Hz. Cada grupo procesó con diferente tiempo de irradiación y diferente intensidad de sonido. Por razones de seguridad, se utilizó ultrasonido a una intensidad de 0,5 W / cm ² o 1,0 W / cm ² con una duración de pulso de 30 o 60 s (Tabla 1). La profundidad, frecuencia y otras condiciones de ultrasonido se mantuvieron constantes durante todos los experimentos de ultrasonido [22]. Después de los tratamientos, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 24 h más. Posteriormente, se utilizó un medio de mantenimiento que contenía 1% de FCS para reemplazar el medio que contenía el fármaco y se añadió una solución de CCK-8 a las placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de una incubación adicional de 2,5 h a 37 ° C, se determinó la absorbancia espectrofotométrica en cada pocillo utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, EE. UU.) A una longitud de onda de 450 nm.

Absorción intracelular de fármacos in vitro

La captación intracelular de DOX se determinó mediante citometría de flujo (Beckman Coulter, Miami, EE. UU.). En resumen, las células MCF-7 se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 2,5 × 10 ⁵ células / pocillo en medio DMEM suplementado con FBS al 10%. Después del cultivo durante la noche, el medio se reemplazó por un medio de cultivo que contenía DOX-NB o DOX libre a la misma concentración, y las células se trataron con o sin ultrasonido. Teniendo en cuenta la viabilidad celular y la alta eficiencia de sonoporación, se eligió una concentración de DOX-NB del 20% para los experimentos posteriores, mientras que el tratamiento con ultrasonido se estableció en una intensidad de 0,5 W / cm ² con una duración de pulso de 30 o 60 s. Posteriormente, después de 1 hora de incubación, se eliminó el medio celular y las células se lavaron tres veces con PBS reciente para eliminar DOX-NB o DOX libres y no unidos. A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación (5 min, 1000 rpm), se resuspendieron en 500 μL de PBS antes de la captación intracelular de DOX y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur. Durante el análisis, la puerta se estableció arbitrariamente para la detección de fluorescencia roja y se analizaron 10,000 células para cada muestra.

Los efectos de los DOX-NB en las células MCF-7 in vitro

Se utilizaron ensayos de CCK-8 y citometría de flujo para realizar una evaluación cuantitativa de la proliferación y apoptosis de células MCF-7 después de la captación de DOX. En resumen, las células MCF-7 se sembraron en placas y se incubaron en placas de 96 pocillos o placas de 6 pocillos y se trataron usando los procedimientos descritos anteriormente. Para el ensayo de proliferación, las células tratadas se incubaron a 37 ° C durante 24 h, seguido de tinción con CCK-8 durante 2 hy lectura de absorbancia en un lector de microplacas. La apoptosis inducida por DOX se determinó mediante un ensayo de Anexina V-APC de la siguiente manera:después de un tratamiento de seis horas, las células se tiñeron agregando 0.5 μL de V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China) en cada pocillo y análisis de citometría de flujo (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) Se utilizó para cuantificar las células apoptóticas.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresaron como la media. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS Versión 18.0. A p valor <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización fisicoquímica de DOX-NB

Los RN preparados mostraron una morfología esférica. Bajo un microscopio invertido, las imágenes de los RN mostraron contornos esféricos discretos e intactos (Fig. 1a), lo que coincidía con la imagen del microscopio de fluorescencia de los NB-DOX (Fig. 1b). En la figura 1c se muestra una imagen TEM representativa de la solución de DOX-NB. Las propiedades físicas de los NB se determinaron mediante el tamaño de partícula y el analizador de potencial zeta. Como se muestra en la Fig.2, el diámetro promedio de DOX-NBs fue 641 nm, P.I. 0,256. El potencial zeta de DOX-NB fue de + 67,12 ± 2,1 mV, que era lo suficientemente alto como para hacer que se repelen entre sí, lo que ayuda a prevenir la agregación de NB y respalda su estabilidad a largo plazo.

NB observados bajo un microscopio óptico (aumento × 1000) ( a ) y la imagen de microscopio de fluorescencia de NB cargados con DOX ( b ) e imagen TEM de NB cargados con DOX ( c )

La distribución de tamaño de los NB cargados con DOX

Estabilidad y eficiencia de carga de fármacos de los DOX-NB

Los DOX-NB se mantuvieron estables en suspensión durante 48 ha 4 ° C. Después de almacenarse a temperatura ambiente, se encontró que el tamaño de los DOX-NB era ligeramente mayor tanto en PBS como en suero humano (Fig. 3). La capacidad de carga final de DOX-NB fue de 64,12 mg DOX / g DOX-NB, lo que correspondió a un EE de 54,18%.

Imágenes ópticas de DOX-NB a a temperatura ambiente, b después de 6 ha 25 ° C en PBS, y c después de 6 ha 25 ° C en el suero

Lanzamiento de DOX por DOX-NBs in vitro

La Figura 4 muestra el perfil de liberación in vitro de DOX de DOX-NB en PBS en presencia o ausencia de tratamiento con EE. UU. Para evaluar los efectos de la sonicación sobre la liberación de DOX. La cantidad de DOX liberada de DOX-NB fue significativamente diferente entre el grupo estadounidense y el grupo no estadounidense. Después de 5 h, los DOX-NB en el grupo de EE. UU. Habían liberado el 46,45% del DOX encapsulado en comparación con solo el 9,3% de liberación en el grupo de fuera de EE. UU. El grupo no estadounidense liberó solo el 19,4% de DOX después de 24 h. Por el contrario, casi el 80% de DOX se vertió en el grupo estadounidense. Los resultados sugirieron que la irradiación estadounidense puede promover la liberación de DOX de DOX-NB debido a un efecto de cavitación.

Liberación de doxorrubicina de DOX-NB con o sin irradiación ultrasónica (2 kHz, 1,0 W / cm ² )

Estabilidad de ultrasonido de DOX-NB

Los DOX-NB lograron una mejora de los ultrasonidos in vitro, como se muestra en la Fig. 5b. La atenuación ultrasónica del valor de decibelios se muestra en la Fig. 5c. Los resultados mostraron que los DOX-NB lograron una buena mejora del ultrasonido y la curva suave demuestra que el proceso de atenuación del ultrasonido en las suspensiones NB fue relativamente lento. Esto indica que la señal de ultrasonido de DOX-NB puede ser lo suficientemente estable para la mejora de la imagen y el contraste.

Una ilustración esquemática de la configuración experimental in vitro ( a ), imágenes de ultrasonido de NB cargados con DOX (0, 5, 10 y 15 min) utilizando una sonda de 9,0 MHz ( b ) y mediciones de intensidad de tiempo de contraste ultrasónico y NB cargados con DOX ( c )

Bioseguridad de los NB vacíos

La viabilidad de las células MCF-7 se midió cultivando con NB vacíos (sin DOX) durante 24 h después del ultrasonido. Como se muestra en la Fig. 6, los NB vacíos no afectaron significativamente la viabilidad celular bajo ciertas intensidades ultrasónicas. Cuando se utiliza una intensidad ultrasónica de 0,5 W / cm ² y un tiempo de irradiación de 30 s, 99,53% y> 80% de las células MCF-7 estaban vivas en suspensiones de NB al 10% y 30%, respectivamente (grupo 1), y la disminución de la viabilidad de las células MCF-7 dependía de la dosis. Además, la intensidad ultrasónica y el tiempo de irradiación fueron otros dos factores que afectaron la viabilidad de las células MCF-7. En particular, cuando la concentración de NB vacíos era del 30%, las células MCF-7 tratadas a 0,5 W / cm ² durante 30 s mostró una mayor viabilidad que los tratados a 0,5 W / cm ² durante 60 so 1 W / cm ² durante 30 s (0,84% frente a 0,75% frente a 0,63%). Por lo tanto, una intensidad de ultrasonido de 0,5 W / cm ² y un tiempo de irradiación de 30 s / 60 s para los experimentos de captación celular.

Citotoxicidad in vitro de diversas concentraciones de NB e intensidad del sonido en células MCF-7

Mejora de la administración de DOX in vitro mediada por DOX-NB e irradiación por ultrasonido

Se fijaron las células MCF-7 tratadas con DOX-NB o DOX libre (a concentraciones iguales de DOX) y se midió su intensidad de fluorescencia mediante citometría de flujo. Las células que no recibieron tratamiento con DOX se utilizaron como controles en blanco. La captación celular de DOX en el grupo de DOX-NB se comparó con la de DOX libre y el grupo de control. En la figura 7, la intensidad de fluorescencia media de las células MCF-7 incubadas con DOX-NB fue mucho menor que la autofluorescencia de las células incubadas con DOX libre, lo que ilustra que la encapsulación de DOX en NB de quitosano podría proteger a las células de la captación de DOX y DOX- lesión inducida.

Análisis de citometría de flujo de la administración de DOX en células MCF-7 mediante NB cargados con DOX (US1 0,5 W / cm ² 30 s, US2 0,5 W / cm ² 60 s)

Sin embargo, la irradiación con ultrasonidos dio como resultado un marcado aumento en la captación de DOX en las células MCF-7 incubadas con DOX-NB; Los DOX-NB podrían suministrar más DOX a las células MCF-7 con la ayuda de la irradiación ultrasónica. Por el contrario, la captación de DOX en células MCF-7 incubadas con DOX libre aumentó solo ligeramente bajo irradiación ultrasónica. Los resultados sugirieron que la captación de DOX en células MCF-7 incubadas con DOX-NB fue mucho mayor que la de las células incubadas con DOX libre bajo irradiación ultrasónica.

Además, la captación de DOX en células MCF-7 incubadas con DOX-NB aumentó ligeramente con un tiempo de irradiación más prolongado. Esto puede deberse a una mayor ruptura de DOX-NB, lo que genera poros transitorios en las membranas de las células MCF-7.

Mejora de la proliferación y apoptosis de células tumorales inducidas por DOX mediante irradiación con ultrasonido

Para investigar los efectos anticancerígenos de la administración de DOX-NB asistida por ultrasonido, se midió la viabilidad de las células MCF-7 utilizando un ensayo CCK-8 y citometría de flujo. Los resultados muestran que la viabilidad de las células MCF-7 en el grupo DOX-NBs fue mayor que en el grupo DOX sin ultrasonido. Mientras tanto, la viabilidad de las células MCF-7 en el grupo DOX-NBs fue significativamente menor que en el grupo DOX con irradiación ultrasónica local. La relación de viabilidad celular en el grupo DOX-NB (21,0 ± 2,2%, p <0,01) fue mucho mayor que en el grupo de DOX libre sin irradiación ultrasónica (6,4 ± 0,7%), lo que sugiere que, como vectores de administración de fármacos, los NB mejoran la disminución de la proliferación celular en la circulación sanguínea inducida por DOX.

Además, la proporción de viabilidad celular disminuyó significativamente en las células tratadas con DOX-NB + US (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%) en comparación con las tratadas con DOX-NB solo (21,0 ± 2,2%, p <0.01), DOX libre solo (6.4 ± 0.7%) y DOX + ultrasonido libre (4.1 ± 0.8%, 3.8 ± 0.6%) (Fig.8). Los datos indicaron que DOX-NBs + US mejoraron significativamente los efectos citotóxicos de DOX en células MCF-7. El grupo DOX-NBs + US también demostró una mayor citotoxicidad en las células MCF-7 que los grupos de ultrasonido DOX libre y DOX + libre.

La comparación de la viabilidad celular en diferentes grupos

La relación de viabilidad celular en el grupo de ecografía DOX libre + (4,1 ± 0,8%) fue menor que en el grupo de DOX libre (6,4 ± 0,7%). Por tanto, la ecografía también redujo la viabilidad de las células MCF-7 tratadas con DOX libre. La relación de viabilidad celular fue de 2,2 ± 0,9% cuando las células se trataron con DOX-NBs + ultrasonido (60 s), que fue menor que cuando se trataron con DOX-NBs + ultrasonido (30 s) (3,1 ± 0,8%), lo que indica que la mayor duración del pulso (60 s) era más eficiente en la entrega de DOX-NB.

Además, la apoptosis de las células MCF-7 se evaluó mediante tinción con Anexina V 6 h después del tratamiento con DOX libre o DOX-NB, con o sin irradiación con ultrasonidos. El porcentaje de células MCF-7 apoptóticas en presencia de DOX libre fue de 4,4 ± 0,9%, mientras que se observó una proporción similar en las células tratadas con DOX libre y ultrasonido (30 s, 60 s). La administración de DOX-NB asistidos por ultrasonido aumentó significativamente el porcentaje de células apoptóticas en comparación con el del grupo de DOX libre (45,7 ± 1,1% frente a 4,4 ± 0,9%, p <0,01). Además, el porcentaje de células apoptóticas en el grupo de DOX-NB sin irradiación con ultrasonido fue menor que el del grupo de tratamiento con DOX libre (3,2 ± 0,9% frente a 4,4 ± 0,9%). De acuerdo con el ensayo de viabilidad celular, estos datos indicaron que la administración de DOX-NB asistida por ultrasonido mejoró el efecto anticanceroso de DOX.

Discusión

El cáncer de mama ha atraído cada vez más atención debido a su alta incidencia y tasas de mortalidad. Según un informe de Globocan, el cáncer de mama es la causa más frecuente de muerte por cáncer entre las mujeres en las regiones menos desarrolladas [23]. DOX es un agente popular contra el cáncer de mama, ya que puede inducir daños en el ADN [24]. Sin embargo, también puede causar efectos secundarios graves, como cardiotoxicidad, en aplicaciones clínicas [25]. Para superar estos efectos tóxicos, se necesitan sistemas eficientes de administración de fármacos que se dirijan solo a las células cancerosas, aumentando así la concentración del fármaco en sus sitios objetivo y reduciéndola en los tejidos no objetivo [26]. En este trabajo, se diseñaron NB de quitosano biológicos cargados con DOX que, cuando se usaban junto con el ultrasonido, podían transportar de manera direccional el DOX al interior de las células del cáncer de mama.

Se han formulado y utilizado NB de quitosano biológico compuestos de lecitina y ácido palmítico para la detección de resonancia magnética / ultrasonido, la administración de genes y la administración de oxígeno [13, 18, 27]. Sin embargo, la capacidad de carga de fármaco y la eficiencia de administración de los NB de quitosano biológico están lejos de ser óptimas. Marano y col. combinó NB de glicol quitosano cargado de DOX y ondas de choque extracorpóreas (ESW) para mejorar la actividad antitumoral de DOX [28]. Pero los ESW no poseen la capacidad de imágenes para evaluar el tamaño del tumor y detectar con precisión su ubicación. Además, aunque los efectos secundarios graves de las ESW son raros, pueden inducir arritmias cardíacas transitorias [29]. Los metabolitos del glicol, incluido el glicolato y la precipitación de oxalato de calcio, también pueden causar acidosis metabólica grave [30]. En comparación con las ESW, la ecografía tiene mayores ventajas debido a su capacidad de obtención de imágenes, no invasividad y seguridad.

En este estudio, se prepararon nuevos DOX-NB utilizando perfluoropropano como núcleo y quitosano como caparazón. El quitosano puede activar los macrófagos y también puede mejorar sus funciones proinflamatorias [31]. Cabe señalar que los DOX-NB cargados positivamente pueden interactuar fuertemente con los componentes sanguíneos, lo que resulta en una rápida eliminación de la sangre y una acumulación dirigida subóptima en el sitio del tumor [32]. To overcome this problem, the surface of DOX-NBs was coated with Pluronic F-68, an amphiphilic and non-ionic block copolymer formed by propylene oxide and ethylene units, which may also prevent the aggregation of nanobubbles by steric stabilization [13, 33].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

Chen y col. showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

Conclusiones

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

Abreviaturas

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE:

Encapsulation efficiency

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction

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