Nanopartículas de lípidos de PLGA trazadas con 131I como portadores de administración de fármacos para el tratamiento quimioterapéutico dirigido del melanoma
Resumen
En este documento, los compuestos de poli (d, l-lactida-co-glicólido) (PLGA) -lípidos (FA-PL) conjugados con ácido fólico (FA) se desarrollaron como nanoportadores para la administración dirigida del fármaco anticanceroso insoluble paclitaxel (PTX), nanopartículas de FA-PLP resultantes. Además, 131 I, como trazador radiactivo, se usó para etiquetar nanopartículas de FA-PLP (FA-PLP- 131 I) evaluar su actividad de captación celular, circulación sanguínea in vivo y biodistribución. El FA-PLP- 131 Las nanopartículas I tenían una morfología esférica con gran estabilidad, una distribución de tamaño estrecha (165,6 y 181,2 nm) y -22,1 mV en potencial zeta medio. La microscopía de barrido láser confocal indicó que la molécula de orientación FA promueve PLP- 131 I captado por las células del melanoma B16F10, que fue confirmado por la tasa de incorporación celular a través de 131 I detección de actividad medida por un contador gamma. FA-PLP- 131 Yo sin PTX (FA-PL- 131 I) muestra citotoxicidad menor, buena biocompatibilidad, mientras que FA-PLP- 131 Se demostró que tenía una supresión eficiente de la viabilidad celular en comparación con PTX y PLP- 131 libres I. Después de la inyección intravenosa, la vida media en la circulación sanguínea de la PTX libre ( t 1/2 =5,4 ± 0,23 h) se prolongó a 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP- 131 I. A través de la focalización de FA, la captación tumoral de FA-PLP- 131 Estaba aproximadamente 4,41 y 12,8 veces más alto que el de PLP- 131 Yo y PTX gratis- 131 Yo, respectivamente. Además, después de 40 días de tratamiento, FA-PLP- 131 Mostré un efecto de inhibición tumoral mejorado en comparación con PTX y PLP- 131 libres I, sin recaída y sin toxicidad sistémica in vivo notable. Los resultados demuestran que el 131 La nanopartícula de lípidos PLGA marcada con I se puede aplicar simultáneamente para la administración de fármacos dirigida y el seguimiento fiable de fármacos in vivo.
Antecedentes
Uno de los cánceres de piel más agresivos, el melanoma, se origina a partir de la transformación maligna de los melanocitos [1, 2]. Dada su fácil recaída y su alto potencial de metástasis, la supervivencia a 5 años de los pacientes con melanoma metastatizado es solo del 10%. Hasta la fecha, el tratamiento más común para los pacientes con melanoma es la quimioterapia, que se acompaña de efectos secundarios graves indeseables, baja biodisponibilidad, escasa selectividad tumoral y toxicidad sistémica limitante de la dosis, que presenta importantes desafíos en la quimioterapia tumoral [3, 4].
El paclitaxel (PTX), un extracto vegetal natural derivado de las raíces, ramas, hojas y corteza secas de taxus, un género de coníferas [5, 6], muestra una actividad antitumoral eficaz contra varios tipos de tumores, incluidos el carcinoma de ovario y el de pulmón. cáncer [7, 8, 9]. Además, también se ha informado que la PTX es eficaz contra el melanoma humano [10, 11]. Sin embargo, además de los inconvenientes antes mencionados de los fármacos quimioterapéuticos, un Cremophor EL y el alcohol deshidratado (1:1, v / v ) se utiliza en la práctica clínica actual como medio de dilución de PTX, lo que puede provocar efectos secundarios graves, incluida la hipersensibilidad [12, 13]. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias novedosas para mejorar la solubilidad acuosa y la acumulación de tumores de agentes quimioterapéuticos para reducir su exposición periférica y minimizar su toxicidad in vivo es primordial. El reciente desarrollo de nanoportadores de fármacos biocompatibles ofrece el potencial de mejorar la estabilidad fisiológica de la PTX [14, 15, 16]. Además, la conjugación de moléculas diana con estos nanoportadores permitiría la administración selectiva de agentes quimioterapéuticos a los sitios tumorales con exposición periférica reducida a través de un efecto dirigido mediado por el receptor de la superficie de la célula tumoral [17,18,19].
En este documento, preparamos un compuesto de poli (d, l-lactida-co-glicólido) (PLGA) -lípido que conjuga covalentemente el ácido fólico (FA:una molécula dirigida al tumor) y encapsula la PTX como un fármaco quimioterapéutico para el tratamiento del melanoma. Además, 131 I, un marcador radiactivo, se utilizó para radiomarcar las nanopartículas de lípidos PLGA para evaluar claramente su comportamiento in vivo. Debido a su emisión beta negativa, vida media física y una amplia gama de propiedades de descomposición, 131 I se utiliza habitualmente como radiomarcaje en la clínica [20, 21, 22]. La morfología, estabilidad y dispersión del 131 Nanopartículas de lípidos PLGA marcadas con I (FA-PLP- 131 I) fueron evaluados in vitro. Además, la captación celular, la circulación sanguínea y la biodistribución de FA-PLP- 131 Me investigaron midiendo la radiactividad de 131 I. Además, la eficacia anticancerosa dirigida de FA-PLP- 131 Me estudiaron in vitro e in vivo. Los resultados indican que FA-PLP- 131 Puedo ser una nanoplataforma versátil para usar como un potencial nanoportador de administración de fármacos tumorales para fármacos quimioterapéuticos.
Métodos
Materiales
Se adquirieron poli (d, l-lactida-co-glicólido) (PLGA, PM:5000-15 000, lactida:glicólido (50:50)) y cloramina-T de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Na 131 Me obtuvieron de Atomic Hitech (Beijing, China). PTX (99%) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se adquirieron de Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Lecitina de soja compuesta por un 90-95% de fosfatidilcolina, 1,2-diestearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina- N - [folato (polietilenglicol) -2000] (DSPE-PEG 2000 -FA) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N - [carboxi (polietilenglicol) -2000] (DSPE-PEG 2000 -COOH) se obtuvieron de Avanti (Alabaster, AL, EE. UU.). Todos los reactivos de cultivo celular se adquirieron de Sigma Aldrich.
Preparación de nanopartículas FA-PLP
Las nanopartículas de FA-PLP se sintetizaron mediante un método de nanoprecipitación de autoensamblaje [23]. En detalle, se disolvieron 10 mg de PTX en 1 ml de etanol y se disolvieron 2 mg de PLGA en 1 ml de diclorometano. Después de mezclarlos, lecitina / DSPE-PEG 2000 Se añadió gota a gota una solución acuosa de etanol -FA (4:1) (4% en peso) a la solución de mezcla durante 4 h con agitación suave a 25ºC. La mezcla se filtró y se lavó tres veces con agua desionizada usando un tubo de centrífuga de ultrafiltración Millipore para eliminar el fármaco no encapsulado y el disolvente orgánico. Como control, se prepararon nanopartículas sin injerto de moléculas de FA mediante el mismo método, reemplazando DSPE-PEG 2000 -FA con DSPE-PEG 2000 -COOH. Las nanopartículas de FA-PLP purificadas se almacenaron a 4 ° C hasta su uso posterior.
Preparación de 131 Nanopartículas FA-PLP etiquetadas con I
FA-PLP radiactivo (FA-PLP- 131 I) Las nanopartículas se prepararon mediante el método de oxidación de cloramina-T [24]. Una mezcla de 1 mL FA-PLP (1 mg / mL), 500 μCi Na 131 I (que es la radiactividad máxima que se puede injertar en FA-PLP) y se hicieron reaccionar 100 μL de 5 mg / ml de cloramina-T en un tampón fosfato de pH 7,5 durante 10 min a temperatura ambiente. Después, la reacción se interrumpió mediante la adición de 200 µl de metabisulfito de sodio (5 mg / ml). 131 Se prepararon PLP y PTX marcados con I siguiendo el mismo procedimiento. Se purificaron utilizando un tubo de centrífuga (Millipore) para eliminar el Na 131 libre restante. I hasta que no se detectó actividad gamma en la solución de filtrado. El rendimiento del radiomarcaje y la pureza de las nanopartículas marcadas se analizaron utilizando un contador gamma (LKB gamma 1261; LKB Instruments).
Caracterización
Los espectros de absorción UV-vis se registraron utilizando un espectrofotómetro UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) se recogieron en un Zeiss LIBRA 120 TEM. El tamaño, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (PDI) de las nanopartículas se detectaron mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Las fotografías ópticas se tomaron con una cámara digital Nikon D3200.
Cultivo celular
La línea celular de melanoma de ratón B16F10 se obtuvo del Cell Bank of the Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) y se cultivó en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% y 100 U / mL de penicilina / estreptomicina en un recipiente humidificado. 5% CO 2 atmósfera a 37 ° C.
Ensayos de incorporación in vitro
Se realizaron ensayos de incorporación in vitro dependientes del tiempo para determinar los tiempos óptimos de eficiencia de unión celular para el 131 Compuestos marcados con I [25]. Se sembraron células B16F10 en placas de 24 pocillos a 1 x 10 5 células por pocillo y se cultivaron hasta la confluencia. Muestras radioyodadas ( 131 Yo, PL- 131 Yo, FA-PL- 131 Yo, PLP- 131 Yo, FA-PLP- 131 I) se prepararon en medio DMEM y se añadieron a los pocillos de cultivo celular, por separado. Después de 0,5, 1, 2, 4 y 6 h de incubación, las células se lavaron con PBS tres veces y se midió su radiactividad con un contador gamma (Instituto de Ciencia y Tecnología de China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Los valores de incorporación (%) se calcularon como se describe en la literatura anterior [25]. Además, las nanopartículas se marcaron con el tinte fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC, Sigma) y luego se incubaron con células B16F10. Las imágenes de fluorescencia de las células se capturaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal comercial (FV1200, Olympus, Tokio, Japón).
Ensayo de citotoxicidad in vitro
El ensayo de viabilidad celular MTT se utilizó para estudiar la citotoxicidad de PL- 131 Yo y FA-PL- 131 Yo, así como el de PTX gratuito, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 I, contra células B16F10. Brevemente, las células B16F10 se sembraron en placas de 96 pocillos durante 24 horas y se expusieron a PL- 131 Yo y FA-PL- 131 I (con 0-100 μg / ml de lípidos PLGA) o PTX libre, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 I (a varias concentraciones de 0 a 40 μg / mL) durante 24 h. El experimento se realizó por triplicado. Todos los datos se expresaron como la media ± DE.
Modelo animal
Se adquirieron ratones Balb / c de tres a cinco semanas de edad de Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Fudan, que cumple con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Células B16F10 (1 × 10 6 ) en PBS se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones. El volumen del tumor en crecimiento se midió con un calibre y el volumen del tumor se calculó con la fórmula:volumen =(largo × ancho 2 ) / 2. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 80 mm 3 , los ratones se asignaron al azar a los grupos experimentales.
Estudio de circulación sanguínea y biodistribución
A ratones sanos Balb / c se les inyectó por vía intravenosa PTX- 131 Yo y FA-PLP- 131 I (100 μL de 10 μCi por ratón, 5 mg / kg). La circulación sanguínea se midió extrayendo aproximadamente 10 μL de sangre de la cola de los ratones. La radiactividad en sangre se midió usando un contador gamma. Para detectar la biodistribución de las nanopartículas, se inyectó PTX- 131 a ratones con un tumor B16F10 Yo, FA-PL- 131 Yo, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 Recibí la misma dosis y lo sacrifiqué 24 h después de la inyección. Los órganos principales se pesaron y recolectaron para el recuento gamma.
Quimioterapia tumoral in vivo
Se inyectaron a ratones Balb / c con tumores B16F10 150 μL de solución salina, PTX libre, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 I (a la misma concentración de PTX, 5 mg / kg). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron con un calibre cada 4 días. Los volúmenes tumorales relativos se calcularon como V / V 0 ( V 0 era el volumen tumoral cuando se inició el tratamiento). Después de aproximadamente 40 días de tratamiento, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los órganos principales, se fijaron en formalina al 4%, se incrustaron en parafina y se cortaron en rodajas, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se examinaron con un microscopio digital.
Resultados y discusión
Preparación y caracterización de 131 Nanopartículas FA-PLP etiquetadas con I
El esquema de síntesis de FA-PLP- 131 I nanopartículas se muestra en la Fig. 1. En resumen, las nanopartículas de FA-PLP se sintetizaron mediante un método de nanoprecipitación de autoensamblaje y FA-PLP radioactivo (FA-PLP- 131 I) se preparó utilizando el método de oxidación de cloramina-T [23, 24]. Se encapsuló PTX mediante el compuesto PLGA-lípido, que luego se injertó con FA conjugado covalente en la superficie de la cáscara mediante PEGilación. Finalmente, 131 Me injertaron en la superficie exterior de la nanopartícula. Las imágenes TEM indicaron que el FA-PLP- 131 Las nanopartículas I tenían una morfología esférica de distribución de tamaño estrecha (165,6 a 181,2 nm), que se confirmó mediante la dispersión dinámica de la luz (Fig. 2a, b). El potencial zeta osciló entre -39,1 y -3,2 mV (Fig. 2c). Los espectros UV-vis de PTX libre y FA-PLP- 131 I (con la misma concentración de PTX) mostró el mismo pico característico a 233 nm (Fig. 2d), lo que indica que PTX se había encapsulado dentro de FA-PLP- 131 I y esa encapsulación no influyó en la intensidad de absorbancia de PTX. Después del cálculo, la eficiencia de encapsulación de PTX en FA-PLP- 131 Se demostró que estaba en 56,35 ± 1,6%. El rendimiento del radiomarcaje de PTX- 131 Yo, PL- 131 Yo, FA-PL- 131 Yo, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 Tenía 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 y 54,8 ± 2,7, respectivamente.
Síntesis de FA-PLP- 131 I nanopartículas
un Imagen TEM de FA-PLP- 131 I. b Tamaño de partícula y c potencial zeta de FA-PLP- 131 Analicé por dispersión dinámica de luz. d Espectros de absorbancia de PTX libre y FA-PLP- 131 Yo
La estabilidad es esencial para la aplicación biomédica de nanopartículas [26]. Después de 4 semanas de almacenamiento, FA-PLP- 131 Me disolví en agua, medio celular, suero fetal bovino y PBS no mostró cambios en el tamaño promedio, potencial zeta, índice PDI (Fig. 3a-c), lo que indica una gran estabilidad y dispersión. Además, la estabilidad de radiomarcaje de FA-PLP- 131 Me detectaron en plasma de ratón a 37 ° C (Fig. 3d), mostrando menos del 15% de desyodación en 7 días.
un , b Estabilidad coloide y c Prueba PDI de FA-PLP- 131 I en diferentes medios, incluidos agua, DMEM, PBS y suero fetal bovino (FBS). d Curva de estabilidad de radiomarcaje de FA-PLP- 131 I en plasma de ratón a 37 ° C dentro de las 2 semanas de almacenamiento
Captación celular in vitro
La Figura 4 muestra la incorporación dependiente del tiempo in vitro de 131 Yo, PL- 131 Yo, FA-PL- 131 Yo, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 I en células B16F10 medido por un contador gamma. FA-PLP- 131 Yo, así como FA-PL- 131 Yo, mostré los valores de incorporación más altos que el de todos los puntos de tiempo probados, aumentando con el tiempo. Los valores de incorporación de FA-PLP- 131 I a las 6 h era 3,12 y 23,4 veces mayor que los de 131 Yo y PLP- 131 I, de acuerdo con los resultados de las imágenes de microscopía de barrido láser confocal de células B16F10 incubadas con FA-PLP- 131 marcado con isotiocianato de fluoresceína Yo y PLP- 131 I nanopartículas (archivo adicional 1:Figura S1). Estos resultados demuestran la alta captación celular de FA-PLP- 131 Yo, probablemente debido al efecto de focalización mediado por FA en las células B16F10.
Incorporación dependiente del tiempo de 131 Yo, PL- 131 Yo, FA-PL- 131 Yo, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 Yo en celdas B16F10
Citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad de los nanoportadores de control, PL- 131 I y FA-PL- 131 Fui probado por el ensayo MTT. Células tratadas con PL- 131 Yo y FA-PL- 131 I durante 24 h tuve una viabilidad similar al control (Fig. 5a), lo que indica una buena biocompatibilidad. Además, FA-PLP- 131 Fui mucho más eficaz para suprimir la proliferación de células B16F10 que PTX y PLP- 131 libres I a la misma concentración de PTX (Fig. 5b), lo que indica una excelente quimioterapia dirigida a células. Los resultados demuestran que FA-PLP- 131 Tiene un alto efecto quimioterapéutico sin radiotoxicidad ni citotoxicidad.
un Viabilidad celular de las células B16F10 después del tratamiento con PL- 131 Yo y FA-PL- 131 Yo por 24 h. b Viabilidades celulares de las células B16F10 después de la incubación con diferentes concentraciones de PTX libre, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 Yo por 24 h
Estudio de circulación sanguínea y biodistribución
Se ha informado que el radiomarcaje es más fiable que las imágenes de fluorescencia para el seguimiento cuantitativo y preciso in vivo de nanopartículas [27, 28]. 131 Se prepararon nanopartículas de FA-PLP marcadas con I para investigar su comportamiento in vivo, incluida la circulación sanguínea y la biodistribución, medida con un contador gamma. La vida media de la circulación sanguínea de la PTX libre ( t 1/2 =5,4 ± 0,23 h) se prolongó a 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP- 131 I (Fig. 6a) debido a la encapsulación de nanopartículas, que fue favorable para la acumulación de dirección tumoral [29, 30, 31]. A continuación, la biodistribución de PTX- 131 gratis Yo, PLP- 131 Yo y FA-PLP- 131 Se investigó I en ratones portadores de tumor B16F10 1 día después de la inyección (Fig. 6b). FA-PLP- 131 Yo, así como FA-PL- 131 Yo, exhibí una mejora obvia de la captación tumoral, que fue 4,41 y 12,8 veces mayor que la de PLP- 131 Yo y PTX gratis- 131 I, respectivamente, probablemente debido a la circulación sanguínea prolongada de FA-PLP- 131 Yo, FA-PL- 131 I, y su efecto de focalización FA. Además, el hígado y el bazo también exhibieron una captación relativamente alta debido a su metabolismo de nanopartículas, que eran los órganos metabólicos normales [32, 33].
un La curva de circulación sanguínea de FA-PLP- 131 Yo después de la inyección intravenosa. b Biodistribución de PTX- 131 Yo, FA-PL- 131 Yo, FA-PLP- 131 Yo y PLP- 131 I en ratones portadores de tumores B16F10
Quimioterapia tumoral in vivo
PTX gratis, PLP- 131 I- y FA-PLP- 131 Los ratones tratados con I exhibieron inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control de solución salina (Fig. 7a). En general, FA-PLP- 131 Fui el más eficaz en la supresión del crecimiento tumoral sin recaída en comparación con todos los grupos tratados después de aproximadamente 40 días de tratamiento. Estos resultados son los esperados considerando la circulación sanguínea significativamente prolongada de FA-PLP- 131 I y, por lo tanto, su capacidad para promover la acumulación dirigida a tumores mediada por FA. Además, la acumulación dirigida al tumor también condujo a una reducción en la exposición periférica de PTX, minimizando así la toxicidad sistémica. Como era de esperar, durante todo el proceso de tratamiento, no hubo una pérdida notable de peso corporal (Fig. 7b), y los órganos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, el pulmón y el riñón, no mostraron lesiones histológicas obvias en ningún grupo ( Figura 7c).
un El volumen relativo del tumor y b peso corporal de los ratones portadores de tumores después de la inyección en la vena de la cola con solución salina (control), PTX libre, PLP- 131 Yo y FA- PLP- 131 I. b Peso corporal de los ratones portadores de tumores después de la inyección en la vena de la cola con solución salina (control), PTX libre, PLP- 131 Yo y FA- PLP- 131 I. c Las imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina de los órganos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones. Barra de escala =100 μm
Conclusiones
En resumen, hemos sintetizado 131 Nanopartículas de lípidos PLGA marcadas con I como portadores de administración de fármacos para la quimioterapia dirigida al melanoma. Midiendo la radiactividad de 131 I, los comportamientos in vitro e in vivo de FA-PLP- 131 Se estudiaron nanopartículas. El FA-PLP- 131 obtenido Mostré gran dispersión y estabilidad coloidal y radiomarcada. Los nanoportadores de control, PL- 131 I y FA-PL- 131 También mostré una buena biocompatibilidad. Después de la encapsulación de PTX, FA-PLP- 131 Fui el más eficaz para suprimir la proliferación de células B16F10 sin citotoxicidad, atribuida al efecto de focalización de FA. Además, FA-PLP- 131 Se demostró que prolongaba significativamente la circulación sanguínea de PTX y que me acumulaba eficazmente dentro de la región del tumor objetivo. Por tanto, FA-PLP- 131 Tuve una excelente inhibición del crecimiento tumoral y una gran biocompatibilidad in vivo. Los resultados destacan el potencial prometedor de estos versátiles FA-PLP- 131 I nanoportadores como agentes fiables de seguimiento de fármacos, así como su aplicación en la terapia dirigida a tumores.
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