Nanopartículas PLGA-lípido marcadas con ¹³¹I para administración dirigida de paclitaxel e imagen en terapia de melanoma

Resumen

Aquí, conjugados de ácido fólico (FA) con compuestos de poli(d,l-lactida-co-glicólido) (PLGA)-lípido (FA-PL) se desarrollaron como nanotransportadores para administración dirigida de fármaco anticanceroso insoluble paclitaxel (PTX), resultando nanopartículas FA-PLP. Además, ¹³¹I, como trazador radiactivo, se usó para marcar nanopartículas FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) para evaluar su actividad de captación celular, circulación sanguínea in vivo y biodistribución. Las nanopartículas FA-PLP-¹³¹I tuvieron morfología esférica con gran estabilidad, distribución de tamaño estrecha (165,6 y 181,2 nm) y -22,1 mV potencial zeta promedio. Microscopía confocal de barrido láser indicó que molécula diana FA promueve captación de PLP-¹³¹I por células melanoma B16F10, confirmado por tasa de incorporación celular vía detección actividad ¹³¹I medida por contador gamma. FA-PLP-¹³¹I sin PTX (FA-PL-¹³¹I) muestra citotoxicidad menor, buena biocompatibilidad, mientras FA-PLP-¹³¹I demostró supresión eficiente de viabilidad celular comparado a PTX libre y PLP-¹³¹I. Tras inyección intravenosa, la semivida de circulación sanguínea de PTX libre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) se prolongó a 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP-¹³¹I. Mediante direccionamiento FA, la captación tumoral de FA-PLP-¹³¹I fue aproximadamente 4,41 y 12,8 veces mayor comparada a PLP-¹³¹I y PTX libre-¹³¹I respectivamente. Además, tras 40 días de tratamiento, FA-PLP-¹³¹I mostró efecto inhibición tumoral mejorado comparado a PTX libre y PLP-¹³¹I, sin recaída y sin toxicidad sistémica in vivo notable. Resultados demuestran que nanopartícula PLGA-lípido marcada con ¹³¹I puede aplicarse simultáneamente para administración dirigida de fármaco y rastreo fiable de fármacos in vivo.

Antecedentes

Uno de los cánceres de piel más agresivos, melanoma, origina de transformación maligna de melanocitos. Dada su fácil recaída y alto potencial metastásico, supervivencia a 5 años de pacientes con melanoma metastásico es solo 10 %. Hasta la fecha, tratamiento más común para pacientes melanoma es quimioterapia, acompañada por efectos secundarios severos indeseables, baja biodisponibilidad, pobre selectividad tumoral y toxicidad sistémica limitante de dosis, presentando retos mayores en quimioterapia tumoral.

Paclitaxel (PTX), extracto natural de planta derivado de raíces secas, ramas, hojas y corteza de taxus, género de árboles coníferos, muestra actividad antitumoral efectiva hacia varios tumores, incluyendo carcinoma ovárico y cáncer pulmonar. Además, PTX también se reporta eficiente contra melanoma humano. Sin embargo, además de inconvenientes mencionados de fármacos quimioterapéuticos, mezcla Cremophor EL y alcohol deshidratado (1:1, v/v) se usa en práctica clínica actual como medio dilución para PTX, que puede causar efectos secundarios serios, incluyendo hipersensibilidad. Por tanto, desarrollo de estrategias novedosas para mejorar solubilidad acuosa y acumulación tumoral de agentes quimioterapéuticos para reducir exposición periférica y minimizar toxicidad in vivo es primordial. El desarrollo reciente de nanotransportadores de fármacos biocompatibles provee potencial para mejorar estabilidad fisiológica de PTX. Adicionalmente, conjugación de moléculas diana a estos nanotransportadores permitiría entrega selectiva de agentes quimioterapéuticos a sitios tumorales con exposición periférica reducida mediante efecto dirigido mediado por receptor de superficie de célula tumoral.

Aquí, preparamos compuesto PLGA-lípido que conjuga covalentemente ácido fólico (FA: molécula diana tumoral) y encapsula PTX como fármaco quimioterapéutico para tratamiento melanoma. Además, ¹³¹I, marcador radiactivo, se usó para radiomarcar nanopartículas PLGA-lípido para evaluar claramente su comportamiento in vivo. Debido a su emisión beta negativa, semivida física y amplia gama de propiedades de decaimiento, ¹³¹I se usa comúnmente como radiomarcador en clínica. Morfología, estabilidad y dispersidad de nanopartículas PLGA-lípido marcadas con ¹³¹I (FA-PLP-¹³¹I) se evaluaron in vitro. Además, captación celular, circulación sanguínea y biodistribución de FA-PLP-¹³¹I se investigaron midiendo radiactividad ¹³¹I. Además, eficacia anticancerosa dirigida de FA-PLP-¹³¹I se estudió in vitro e in vivo. Resultados indican que FA-PLP-¹³¹I puede ser nanoplataforma versátil para uso como potencial nanotransportador de fármaco tumoral para fármacos quimioterapéuticos.

Métodos

Materiales

Poli(d,l-lactida-co-glicólido) (PLGA, PM: 5000-15000, lactida:glicólido 50:50) y cloramina-T se compraron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Na¹³¹I se obtuvo de Atomic Hitech (Beijing, China). PTX (99 %) y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Lecitina soja consistiendo 90-95 % fosfatidilcolina, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[folato (polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carboxi (polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) de Avanti (Alabaster, AL, USA). Todos reactivos cultivo celular de Sigma Aldrich.

Preparación Nanopartículas FA-PLP

Nanopartículas FA-PLP se sintetizaron por método de nanoprecipitación autoensamblaje. En detalle, 10 mg PTX se disolvieron en 1 mL etanol y 2 mg PLGA en 1 mL diclorometano. Tras mezclarlos, solución acuosa etanol lecitina/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) (4 % p/v) se añadió gota a gota en mezcla por 4 h agitación suave a 25 °C. Mezcla se filtró y lavó tres veces con agua desionizada usando tubo centrífuga ultrafiltración Millipore para remover fármaco no encapsulado y solvente orgánico. Como control, nanopartículas sin injerto molécula FA se prepararon mismo método, reemplazando DSPE-PEG₂₀₀₀-FA con DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH. Nanopartículas FA-PLP purificadas se almacenaron a 4 °C hasta uso.

Preparación Nanopartículas FA-PLP Marcadas con ¹³¹I

Nanopartículas FA-PLP radiactivas (FA-PLP-¹³¹I) se prepararon mediante método oxidación cloramina-T. Mezcla de 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 µCi Na¹³¹I (máxima radiactividad injertable en FA-PLP), y 100 µL cloramina-T 5 mg/mL reaccionaron en tampón fosfato pH 7,5 por 10 min a temperatura ambiente. Reacción se detuvo añadiendo 200 µL metabisulfito sódico (5 mg/mL). ¹³¹I-marcado PLP y PTX se prepararon mismo procedimiento. Se purificaron usando tubo centrífuga (Millipore) para remover Na¹³¹I libre hasta no detectar actividad gamma en solución filtrado. Rendimiento y pureza radiomarcado analizaron con contador gamma (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Caracterización

Espectros absorción UV-vis se registraron con espectrofotómetro UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd.). Imágenes TEM se colectaron en Zeiss LIBRA 120 TEM. Tamaño, potencial zeta e índice polidispersidad (PDI) detectados por dispersión dinámica luz (DLS) usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Fotografías ópticas con cámara digital Nikon D3200.

Cultivo Celular

Línea celular melanoma murino B16F10 obtenida de Banco Células Tipo Colección Cultivo Academia China Ciencias (Shanghai, China) y cultivada en DMEM conteniendo 10 % suero fetal bovino y 100 U/mL penicilina/estreptomicina en atmósfera humidificada 5 % CO₂ a 37 °C.

Ensayos Incorporación In Vitro

Ensayo incorporación in vitro dependiente tiempo se realizó para determinar tiempos óptimos eficiencia unión celular para compuestos marcados con ¹³¹I. Células B16F10 se sembraron en placas 24 pozos a 1 × 10⁵ células/pozo y cultivaron a confluencia. Muestras radioyodadas (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) se prepararon en medio DMEM y añadieron a pozos cultivo por separado. Tras 0,5, 1, 2, 4, 6 h incubación, células se lavaron con PBS tres veces y radiactividad midió con contador gamma. Valores incorporación (%) calculados como literatura previa. Adicionalmente, nanopartículas se marcaron con colorante fluorescente isotiocianato fluoresceína (FITC, Sigma) e incubaron con células B16F10. Imágenes fluorescencia células capturadas con microscopio confocal láser comercial (FV1200, Olympus, Tokyo, Japan).

Ensayo Citotoxicidad In Vitro

Ensayo viabilidad celular MTT usado para estudiar citotoxicidad nanotransportadores control PL-¹³¹I y FA-PL-¹³¹I, así como PTX libre, PLP-¹³¹I y FA-PLP-¹³¹I contra células B16F10. Brevemente, células B16F10 se colocaron en placas 96 pozos por 24 h y expusieron a PL-¹³¹I y FA-PL-¹³¹I (0-100 µg/mL PLGA-lípido), o PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I (varias concentraciones 0-40 µg/mL) por 24 h. Experimento triplicado. Datos expresados como media ± DE.

Modelo Animal

Ratones Balb/c 3-5 semanas comprados de Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos experimentos animales aprobados por Comité Cuidado Uso Animales Universidad Fudan, cumpliendo Guía NIH Cuidado Uso Animales Laboratorio.

Células B16F10 (1 × 10⁶) en PBS inyectadas subcutáneamente en flanco derecho ratones. Volumen tumoral creciente medido con calibrador, volumen calculado fórmula: volumen = (largo × ancho²)/2. Cuando volumen tumoral alcanzó ~80 mm³, ratones aleatorizaron en grupos experimentales.

Estudio Circulación Sanguínea y Biodistribución

Ratones Balb/c sanos inyectados intravenosamente con PTX-¹³¹I y FA-PLP-¹³¹I (100 µL 10 µCi por ratón, 5 mg/kg). Circulación sanguínea medida extrayendo ~10 µL sangre cola ratones. Radiactividad en sangre medida con contador gamma. Para detectar biodistribución nanopartículas, ratones con tumor B16F10 inyectados con PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I misma dosis y sacrificados 24 h post-inyección. Órganos mayores pesados y colectados para conteo gamma.

Quimioterapia Tumoral In Vivo

Ratones Balb/c con tumores B16F10 inyectados con 150 µL salino, PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I (misma concentración PTX, 5 mg/kg). Tamaño tumoral y peso corporal medidos calibrador cada 4 días. Volúmenes tumorales relativos calculados V/V₀ (V₀ volumen tumoral al iniciar tratamiento). Tras ~40 días tratamiento, ratones sacrificados y órganos mayores colectados, fijados 4 % formalina, incluidos parafina, seccionados, teñidos hematoxilina-eosina, examinados microscopio digital.

Resultados y Discusión

Preparación y Caracterización Nanopartículas FA-PLP-¹³¹I

Esquema síntesis FA-PLP-¹³¹I mostrado Fig. 1. Brevemente, nanopartículas FA-PLP sintetizadas mediante nanoprecipitación autoensamblaje y FA-PLP radiactivo (FA-PLP-¹³¹I) preparado usando oxidación cloramina-T. PTX encapsulado por compuesto PLGA-lípido, injertado covalentemente FA en superficie cubierta vía PEGilación. Finalmente, ¹³¹I injertado superficie externa nanopartícula. Imágenes TEM indicaron nanopartículas FA-PLP-¹³¹I morfología esférica distribución tamaño estrecha (165,6-181,2 nm), confirmado DLS (Fig. 2a,b). Potencial zeta varió -39,1 a -3,2 mV (Fig. 2c). Espectros UV-vis PTX libre y FA-PLP-¹³¹I (misma concentración PTX) mostraron mismo pico característico 233 nm (Fig. 2d), indicando PTX encapsulado dentro FA-PLP-¹³¹I y encapsulación no influyó intensidad absorbancia PTX. Tras cálculo, eficiencia encapsulación PTX en FA-PLP-¹³¹I fue 56,35 ± 1,6 %. Rendimiento radiomarcado PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I fue 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5, 54,8 ± 2,7 respectivamente.

Estabilidad es esencial para aplicación biomédica nanopartículas. Tras 4 semanas almacenamiento, FA-PLP-¹³¹I disuelto en agua, medio celular, suero fetal bovino, PBS mostraron sin cambios tamaño promedio, potencial zeta, índice PDI (Fig. 3a-c), indicando gran estabilidad y dispersidad. Además, estabilidad radiomarcado FA-PLP-¹³¹I detectada en plasma ratón a 37 °C (Fig. 3d), mostrando <15 % des-yodación dentro 7 días.

Captación Celular In Vitro

Figura 4 muestra incorporación in vitro dependiente tiempo de ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I en células B16F10 medido por contador gamma. FA-PLP-¹³¹I, así como FA-PL-¹³¹I, mostraron valores incorporación mayores que todos puntos tiempo probados, aumentando con tiempo. Valores incorporación FA-PLP-¹³¹I a 6 h fueron 3,12 y 23,4 veces mayores que ¹³¹I y PLP-¹³¹I, concordando con resultados imágenes microscopía confocal barrido láser células B16F10 incubadas con nanopartículas FA-PLP-¹³¹I y PLP-¹³¹I marcadas FITC (Archivo adicional 1: Figura S1). Resultados demuestran alta captación celular FA-PLP-¹³¹I, probablemente debido efecto direccionamiento mediado FA en células B16F10.

Citotoxicidad In Vitro

Citotoxicidad nanotransportadores control PL-¹³¹I y FA-PL-¹³¹I probada por ensayo MTT. Células tratadas PL-¹³¹I y FA-PL-¹³¹I por 24 h tuvieron viabilidad similar a control (Fig. 5a), indicando buena biocompatibilidad. Adicionalmente, FA-PLP-¹³¹I fue mucho más efectivo suprimiendo proliferación B16F10 que PTX libre y PLP-¹³¹I a misma concentración PTX (Fig. 5b), indicando excelente quimioterapia dirigida celular. Resultados demuestran FA-PLP-¹³¹I alto efecto quimioterapéutico sin radiotoxicidad ni citotoxicidad.

Estudio Circulación Sanguínea y Biodistribución

Radiomarcado reportado más fiable que imagen fluorescencia para rastreo cuantitativo preciso nanopartículas in vivo. Nanopartículas FA-PLP marcadas ¹³¹I preparadas investigar comportamiento in vivo, incluyendo circulación sanguínea y biodistribución, medido por contador gamma. Semivida circulación sanguínea PTX libre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) prolongada a 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP-¹³¹I (Fig. 6a) debido encapsulación nanopartícula, favorable para acumulación tumoral dirigida. Luego, biodistribución PTX libre-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I en ratones con tumor B16F10 a 1 día post-inyección investigada (Fig. 6b). FA-PLP-¹³¹I, así como FA-PL-¹³¹I, exhibieron mejora obvia captación tumoral, 4,41 y 12,8 veces mayor que PLP-¹³¹I y PTX libre-¹³¹I respectivamente, probablemente debido circulación sanguínea prolongada FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I y efecto direccionamiento FA. Además, hígado y bazo también exhibieron captación relativamente alta debido su metabolismo nanopartículas, órganos metabólicos normales.

Quimioterapia Tumoral In Vivo

Ratones tratados PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I exhibieron inhibición crecimiento tumoral comparado grupo control salino (Fig. 7a). Globalmente, FA-PLP-¹³¹I fue más efectivo suprimiendo crecimiento tumoral sin recaída comparado todos grupos tratados tras ~40 días tratamiento. Resultados esperados considerando circulación sanguínea significativamente prolongada FA-PLP-¹³¹I y por tanto capacidad promover acumulación tumoral dirigida mediada FA. Además, acumulación tumoral dirigida también redujo exposición periférica PTX, minimizando toxicidad sistémica. Como esperado, durante todo proceso tratamiento, no hubo pérdida notable peso corporal (Fig. 7b), y órganos mayores, incluyendo corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón, no mostraron lesiones histológicas obvias en ningún grupo (Fig. 7c).

Conclusiones

En resumen, sintetizamos nanopartículas PLGA-lípido marcadas ¹³¹I como transportadores fármaco para quimioterapia melanoma dirigida. Midiendo radiactividad ¹³¹I, comportamientos in vitro e in vivo nanopartículas FA-PLP-¹³¹I estudiados. FA-PLP-¹³¹I obtenido mostró gran dispersidad y estabilidad coloidal y radiomarcado. Nanotransportadores control PL-¹³¹I y FA-PL-¹³¹I también mostraron buena biocompatibilidad. Tras encapsulación PTX, FA-PLP-¹³¹I fue más efectivo suprimiendo proliferación B16F10 sin citotoxicidad, atribuido efecto direccionamiento FA. Además, FA-PLP-¹³¹I demostró prolongar significativamente circulación sanguínea PTX y acumular efectivamente región tumoral dirigida. Así, FA-PLP-¹³¹I tuvo excelente inhibición crecimiento tumoral y gran biocompatibilidad in vivo. Resultados destacan potencial prometedor estos nanotransportadores FA-PLP-¹³¹I versátiles como agentes rastreo fármacos fiables y su aplicación en terapia tumoral dirigida.