Quantum Dots PEG-CdTe con carga de doxorrubicina como un sistema inteligente de administración de fármacos para el tratamiento del mieloma múltiple extramedular

Materiales y métodos

Materiales

Se adquirieron PEG-CdTe QD y el kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) Pierce ™ de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE. UU.). DOX se obtuvo de Dalian Meilun Biology Technology Co. (Dalian, República Popular de China). El PRMI-1640 se obtuvo de Gibco Chemical Co. (Carlsbad, CA, EE. UU.). El suero fetal bovino (FBS) se adquirió de Wisent Inc. (Montreal, Canadá). El kit de detección de apoptosis de anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el ensayo del kit de recuento celular-8 (CCK-8) se obtuvieron de Beyotime Biotechnology Co., Ltd. (Nantong, República Popular de China), y anticuerpos monoclonales contra Bax, Caspase- 3, Bcl2, β-actina se obtuvieron de Cell Signaling Technology, plc. (Boston, Estados Unidos). Un microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue aceptado por un Laboratorio de Óptica Electrónica de Japón, Ltd. (Tokio, HT700, Japón). Los diámetros hidrodinámicos y la distribución de tamaños de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX se midieron con el analizador de tamaño Zetasizer sizer NanoZs (Malvern, Zetasizer Ultra, Reino Unido). La concentración de DOX se detectó mediante HPLC (Jasco, LC-2000, Japón). La entrega de DOX se ha detectado mediante microscopio confocal de barrido láser (Nikon, C 2, Japón). La apoptosis y la intensidad de fluorescencia de las células PRMI 8226 mediante citómetro de flujo (BD, Biosciences Accuri C6, EE. UU.). Las transferencias de proteínas se detectaron mediante el sistema de detección ECL (Tanon, 5200 Multi, China).

Preparación de PEG-CdTe-DOX

DOX se absorbió en PEG-CdTe QD mediante interacción electrostática de manera eficiente. Brevemente, se mezclaron 100 μl de PEG-CdTe (1 mg / ml) y 100 μl de DOX (1 mg / ml) en 800 μl de agua destilada con agitación de 100 rpm durante 24 ha 37 ° C en la oscuridad. Se recogió PEG-CdTe-DOX y se centrifugó durante 30 min (4 ° C, 30.000 rpm). Se mezcló PEG-CdTe-DOX y se centrifugó dos veces a la temperatura mencionada anteriormente. El DOX sin reaccionar se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [19]. La eficiencia de encapsulación (EE) y la carga de fármaco (DL) se calcularon de la siguiente manera:

La morfología de las QD de PEG-CdTe se caracterizó por TEM. Los diámetros hidrodinámicos de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX se midieron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) en el PBS. En resumen, se transfirieron 20 ml de PEG-CdTe-DOX (DOX, 1 mg / ml) a bolsas de diálisis (corte de peso molecular de 3500 Da), que luego se sumergieron en 180 ml de PBS a pH 5,0, 6,0, 7,4 o 8.0, bajo giro constante (a 100 rpm) a 37 ° C. Luego, se recogieron 0,1 ml de PBS cada 2 hy se sustituyeron por un volumen equivalente de PBS. La concentración de DOX se cuantificó mediante espectrofotometría a 450 nm, y se representó gráficamente la liberación acumulada de DOX del PEG-CdTe de acuerdo con la relación de liberación a lo largo del tiempo.

Microscopía de fluorescencia confocal

La entrada de DOX en las células PRMI 8226 (línea de mieloma múltiple) se confirmó visualmente bajo microscopía confocal. Las células PRMI 8226 se trataron con PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX durante 4 h. Luego, se recolectaron las células PRMI 8226, se centrifugaron y se suspendieron en 70 μl de PBS. Luego, las células se transfirieron a portaobjetos de vidrio. Después de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min, se tomaron imágenes de fluorescencia confocal con un microscopio confocal invertido. La longitud de onda de emisión de DAPI y DOX fue de 450 y 585 nm, respectivamente.

Cultivo celular

Las líneas celulares PRMI 8226 (células de mieloma múltiple) y 293 t (células de riñón embrionario humano) se adquirieron del Instituto de Células de Shanghai (Academia de Ciencias de China, Shanghai, China). Se cultivaron células PRMI 8226 en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 suplementado con FBS al 10%, se cultivaron células 293 t en un medio de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suplemento de medio con FBS al 10% y 100 U / ml de penicilina. y 100 μg / ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada con dióxido de carbono al 5% (CO ₂ ).

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo CCK-8. En primer lugar, se sembraron células PRMI 8226 en placas de 96 pocillos que contenían cada una 100 μl de 2 × 10 ⁴ células y tratados con solución salina tampón fosfato (PBS) (el grupo de control), PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX. La concentración de DOX fue de 1,76 μg / ml después de la incubación durante 24, 48 o 72 ha 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se sembraron 293 células T en placas de 96 pocillos que contenían cada una 100 μl de 8 × 10 ⁴ células y tratadas con PEG-CdTe (0, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 o 51,2 μg / ml) durante 24 h. Luego, se añadió CCK-8 (10 µl) en placas de 96 pocillos y se incubó durante otras 3 h. Las viabilidades celulares (%) de las células PRMI 8226 y 293 t se calcularon como (1 - OD _tratamiento / OD _control ) × 100.

Captación celular

La captación celular se midió cuantitativamente mediante citometría de flujo (FCM) para determinar si la concentración de DOX intracelular aumenta en las células tratadas con PEG-CdTe-DOX (Fig. 3). Brevemente, se cultivaron células PRMI 8226 con PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se centrifugaron y lavaron dos veces a 1000 rmp durante 5 min. El precipitado se dispersó en 200 µl de PBS y se analizó mediante FCM. La antifluorescencia de DOX es roja, y la intensidad de fluorescencia relativa (FI) se calculó como FI _{células tratadas} / FI _{Células PEG-CdTe} .

Prueba de estudio de apoptosis celular

Se sembraron células PRMI 8226 en placas de 24 pocillos a una densidad de 3 × 10 ⁵ células. Después de la incubación con PBS, PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX durante 24 h, estas células se recogieron mediante centrifugación a 1000 rpm y se lavaron tres veces con PBS. Las células de diferentes grupos se marcaron con Anexina V-FITC (5 μl) en tampón de unión (100 μl) durante 15 min, seguido de la adición de 5 μl de PI durante 5 min y en la habitación oscura. La tasa de apoptosis celular se midió mediante FCM.

Western Blot

Las células PRMI8226 se recolectaron después de diferentes tratamientos (PBS, PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX) y se sometieron a transferencia Western. Se recogieron las proteínas totales de todos los grupos y se detectó la concentración de proteínas mediante el método de Braford. Las proteínas totales (40 µg) se fraccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS / PAGE) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Luego, se utilizó leche desnatada al 5% como agente bloqueante durante 1 ha temperatura ambiente. La transferencia de Western se realizó utilizando anticuerpos monoclonales:β-actina (control interno), Bax, Bcl2, Caspasa-3. Las transferencias de proteínas se detectaron utilizando el sistema de detección ECL y la banda de proteínas se cuantificó mediante Image J.

Análisis estadístico

Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar. Diferencias entre dos grupos analizados por Student ’ t prueba. Valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los experimentos se realizaron al menos tres repeticiones.

Resultados

Caracterización de PEG-CdTe-DOX

PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX exhibieron una estructura cristalina y se dispersaron bien en PBS, según lo detectado por TEM (Fig. 2a, b). Las distribuciones de tamaño de nanopartículas de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Fig. 2c). El DL y EE de DOX en PEG-CdTe-DOX se determinaron por HPLC (Fig. 2e). La liberación de DOX se maximizó a pH 5,0 y 6,0, ya que aproximadamente el 92,5% y el 88% del DOX cargado se liberó en el PBS en 24 h, y las tasas de liberación fueron más lentas a pH 7,4 y 8,0, lo que sugirió un patrón de liberación activado por el pH. (Figura 2d). La capacidad de liberación de DOX sensible al pH es eficaz porque se forma un entorno ácido en el microambiente del tumor, en el que DOX se libera rápidamente del complejo PEG-CdTe-DOX. Los diámetros hidrodinámicos medios son 8,20 y 78,31 nm, respectivamente; el EE y DL son 77,20% ± 1,12% y 42,12% ± 0,98%, respectivamente; los potenciales Zeta de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX son - 20,12 ± 2,45 y - 10,50 ± 1,26 mV, respectivamente. Estos hallazgos indican la carga favorable de DOX en PEG-CdTe y la síntesis exitosa de PEG-CdTe-DOX. Por lo tanto, se podría lograr una mayor concentración de DOX en el microambiente del tumor y una menor concentración de DOX en los tejidos normales.

Características de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX. Notas: a , b Imágenes TEM de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX. c Análisis DLS de PEG-CdTe y PEG-CdTe-DOX. e El sistema optimizado de administración de fármacos PEG-CdTe-DOX que sintetiza a partir de diferentes concentraciones de incubación de DOX a PEG-CdTe. d DOX liberado de PEG-CdTe-DOX en PBS a pH 5,0, 6,0, 7,4 u 8,0 a 37 ° C in vitro. f La viabilidad de las células 293 t después del tratamiento con diferentes concentraciones de PEG-CdTe

Las imágenes de fluorescencia del microscopio confocal muestran que PEG-CdTe-DOX podría administrar DOX en las células PRMI 8226. Además, la fluorescencia roja almacena marcadamente en las células PRMI 8226 el grupo PEG-CdTe-DOX en comparación con el grupo DOX, lo que indica que PEG-CdTe podría fortalecer la captación celular de PEG-CdTe-DOX y la entrega intracelular al dirigirse a las células RPMI 8226.

Captación celular y citotoxicidad de PEG-CdTe-DOX in vitro

Para determinar si PEG-CdTe-DOX puede facilitar exclusivamente la acumulación de DOX en células PRMI 8226, medimos la acumulación de DOX mediante citometría de flujo (FCM) de intensidad de fluorescencia intracelular. La concentración intracelular de DOX en las células PRMI8226 aumentó significativamente en el grupo PEG-CdTe-DOX en comparación con el grupo DOX ( P <0,01, figura 4). La citotoxicidad de PEG-CdTe-DOX contra las células PRMI 8226 está relacionada positivamente con el tiempo de incubación, que también es más largo que en el grupo DOX (72 h, Fig. 4). La viabilidad celular después de la incubación durante 24, 48 y 72 h se examinó utilizando el kit de recuento celular 8 (CCK-8), y las tasas de inhibición correspondientes de PEG-CdTe-DOX fueron del 58%, 70% y 85%, respectivamente. . Los resultados sugirieron que la viabilidad de las células PRMI8226 en el grupo PEG-CdTe-DOX disminuyó significativamente en comparación con el grupo DOX ( P <0,05). Además, no se observó ninguna diferencia significativa en la viabilidad celular entre el grupo de control y el grupo de PEG-CdTe. No hay una diferencia significativa en la viabilidad celular de las células 397 t con PBS y PEG-CdTe (la concentración de PEG-CdTe es la misma que en el experimento RPMI 8226). Estos hallazgos son consistentes con las concentraciones intracelulares de DOX (Figuras 3 y 4) e indican que PEG-CdTe ayuda a la administración dirigida sin interferir con los efectos terapéuticos. Por lo tanto, la apoptosis de las células PRMI 8226 mejoró notablemente, lo que indica que PEG-CdTe-DOX podría usarse como un sistema de administración de fármacos.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de células PRMI 8226 después de recibir PEG-CdTe, DOX o PEG-CdTe-DOX. Notas: a , d PEG-CdTe; b , e DOX; c , f PEG-CdTe-DOX. La fluorescencia roja indica PEG-CdTe-DOX mediante flechas (barra de escala:50 μm, × 400; las longitudes de onda de emisión de DAPI y DOX fueron de 450 y 585 nm, respectivamente)

Intensidad media de fluorescencia en PRMI8226 por citometría de flujo e inhibición del crecimiento de células PRMI8266 con diferentes tratamientos. Notas: a PEG-CdTe; b DOX; c PEG-CdTe-DOX; d la intensidad de fluorescencia de DOX y PEG-CdTe-DOX en comparación con PEG-CdTe (** P <0,01). e Análisis CCK-8 de células PRMI 8226 tratadas con PBS (control), PEG-CdTe, DOX y PEG-CdTe-DOX a las 24, 48 y 72 h (* P <0.05)

Apoptosis de células PRMI8226

Las tasas de apoptosis total de las células PRMI8226 medidas por FCM fueron 4,78%, 6,95%, 34,07% y 66,5% en los grupos de control, PEG-CdTe, DOX y PEG-CdTe-DOX, respectivamente (Fig. 5). La tasa de apoptosis en el grupo PEG-CdTe-DOX aumentó significativamente en comparación con el grupo DOX ( P <0,01). Sin embargo, las tasas de apoptosis no fueron significativamente diferentes entre el grupo de control y el grupo de PEG-CdTe, lo que sugiere que PEG-CdTe era seguro y podría aumentar notablemente la eficacia de DOX.

Tasas de apoptosis de células PRMI 8226 con diferentes tratamientos. Notas: a PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX. e Las tasas comparativas de apoptosis de las células PRMI8226 en diferentes grupos se mostraron en el gráfico de barras (** P <0,01 en comparación con el control; ^## P <0.01 en comparación con DOX)

Western Blot

Se realizó una transferencia de Western para medir los niveles de expresión de las proteínas Bax, Caspasa-3 y Bcl-1 asociadas a la apoptosis (Fig. 6). Bax y Caspase-3 se regularon gradualmente al alza en los grupos DOX y PEG-CdTe-DOX. En contraste, la expresión de Bcl2 cambió a la inversa. En el grupo PEG-CdTe-DOX, Bax y Caspase-3 se expresaron fuertemente en comparación con el grupo DOX ( P <0.05), mientras que la expresión Bcl2 fue la más baja. Estos hallazgos confirman que la actividad antitumoral de PEG-CdTe-DOX es la más eficaz entre las demás.

Expresión proteica de genes asociados a apoptosis de células PRMI 8226 con diferentes tratamientos. Notas: a PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX (* P <0.05)

Discusión

La principal causa del fracaso de la quimioterapia tumoral es la intolerancia de los pacientes. El régimen de PAD que comprende bortezomib, DOX y dexametasona es la terapia de primera línea para el mieloma múltiple [9]. DOX juega un papel importante en el tratamiento del mieloma múltiple. DOX inhibe la proliferación e induce la apoptosis de las células tumorales al alterar el ADN [20]. Sin embargo, los fármacos citotóxicos como la DOX inducen diversos efectos adversos en los tejidos y órganos normales, especialmente la cardiotoxicidad [21]. El mieloma se diagnostica con mayor frecuencia entre las personas de 65 a 74 años [22], y los pacientes mayores con mieloma múltiple a menudo sufren disfunción orgánica y no pueden recibir quimioterapia en dosis altas para mejorar los resultados. La tolerancia es una garantía para el tratamiento continuo del mieloma múltiple y, por lo tanto, restringe el uso clínico de DOX. Por lo tanto, numerosos pacientes con EMM no tienen posibilidades de recibir un tratamiento eficaz debido a que no soportan la quimioterapia de dosis alta. Por tanto, es urgente desarrollar métodos que puedan reducir los efectos adversos y potenciar los efectos terapéuticos. En este trabajo, desarrollamos un sistema de administración cargado con DOX utilizando nanopartículas de PEG-CdTe, que eran capaces de concentrar fármacos de forma selectiva en los tejidos tumorales a través de la circulación sistémica.

Nuestro estudio reveló que las nanopartículas de PEG-CdTe podrían cargar DOX con DL y EE elevados (Fig. 2e), lo que coincide con otros estudios [12, 13]. Además, las nanopartículas de PEG-CdTe con un diámetro de 8,2 nm (<10 nm) podrían ser rápidamente metabolizadas por el sistema urinario [23], y las nanopartículas de PEG-CdTe-DOX con un tamaño de 78,31 nm (<200 nm) prolongaron la circulación sanguínea. tiempo y redujo o incluso evitó la opsonización y absorción del plasma en el sistema reticuloendotelial [23]. Como portador de nanopartículas, los fármacos se liberaron de PEG-CdTe en un patrón de pH controlado y activado por pH y prolongaron el período de circulación, que eran importantes para un sistema práctico de administración de fármacos para prevenir respuestas inmunitarias no deseadas y reacciones tisulares contra el portador del fármaco. [24]. El microambiente del tumor estaba bajo un pH más bajo en comparación con los tejidos normales debido al estado hipóxico [25] y, por lo tanto, liberaba más DOX. Se puede mejorar la concentración del fármaco en el microambiente ácido (tejidos tumorales) y, por tanto, la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos [26]. Por lo tanto, el fármaco se liberó masivamente alrededor de las células tumorales, mientras que el fármaco permaneció mayoritariamente en el portador en el entorno fisiológico normal y se liberó menos a los tejidos normales. Los experimentos intracelulares también confirmaron que se administró más DOX a las células PRMI 8226. Por lo tanto, se mejoró la eficacia quimioterapéutica y se indujeron los efectos adversos sobre los tejidos normales.

Los experimentos in vitro mostraron consistentemente que PEG-CdTe-DOX se dirigía a las células tumorales y aumentaba la acumulación de fármaco allí (Fig. 3). De manera similar, la inhibición de la proliferación y la apoptosis de las células PRMI 8226 aumentaron con PEG-CdTe-DOX en comparación con DOX solo a la misma concentración (Fig. 4). Por lo tanto, se requirió una DOX más baja para lograr la misma eficacia quimioterapéutica. Además, la inhibición de la proliferación celular RPMI 8226 y la inducción de la apoptosis pueden incrementarse con PEG-CdTe-DOX, que es la principal forma en que los fármacos matan las células de mieloma (Fig. 5). Además, no se encontraron diferencias significativas entre el grupo de PEG-CdTe y el grupo de control, lo que confirmó que PEG-CdTe no tenía actividad terapéutica in vitro. Lo que debe tenerse en cuenta es que nuestros resultados indican la alta seguridad y la baja citotoxicidad de PEG-CdTe a baja concentración, lo que concuerda con otros estudios [12, 27]. Sin embargo, la tasa de apoptosis de las células PMIR 8226 evaluadas por FCM en el grupo PEG-CdTe-DOX es obviamente más alta que en el grupo DOX ( P <0,01). Por lo tanto, PEG-CdTe podría atenuar significativamente los efectos secundarios de DOX al administrar los medicamentos a las células tumorales.

Se consideraron las tres vías principales de la apoptosis:la vía mitocondrial, la vía del retículo endoplásmico y la vía del receptor de muerte. En la vía mitocondrial, los factores apoptogénicos (por ejemplo, el citocromo C) se liberan primero de las mitocondrias al citosol y luego inician la apoptosis de esta vía inducida por la vía de la caspasa [28]. La familia Bcl2 consta de proteínas proapoptóticas (Bax, Bad y Bak) y proteínas antiaptópticas (Bcl-xl y Bcl2) [29]. Bax puede migrar desde el citosol a la membrana mitocondrial cuando es estimulado por señales de apoptosis, que es el vértice de los mecanismos celulares de "vida o muerte". Bcl2 y Bax son un par de regulaciones génicas positivas y negativas, ya que Bax induce la apoptosis mientras que Bcl2 la inhibe [30]. La caspasa-3 no solo puede promover la apoptosis, mientras que sobrevivir es el inhibidor más fuerte de la apoptosis, sino que también promueve la proliferación celular, que puede activar directamente la caspasa-3 y la caspasa-7, bloqueando así la apoptosis [31, 32]. La caspasa-3, un verdugo de la familia de las caspasas, también puede escindir e inactivar la polimerasa poli-adp-ribosa cuando se inicia [12]. En el presente estudio, se detectaron las expresiones de proteínas apoptóticas relacionadas para explorar el mecanismo molecular de cómo PEG-CdTe-DOX mejora la actividad antitumoral. Se descubrió que PEG-CdTe-DOX puede aumentar los efectos citotóxicos en las células tumorales al inducir la apoptosis a través de la vía apoptótica mediada por caspasa.

Conclusiones

Fabricamos el PEG-CdTe-DOX para tratamiento EMM con alto EE y DL. Este sistema puede administrar DOX a las células RPMI 8226 de forma dirigida, aumentando así los efectos terapéuticos y disminuyendo los efectos secundarios de DOX. La selección de CdTe modificado con PEG podría aumentar la eficacia quimioterapéutica y reducir el efecto secundario, lo que podría allanar el camino para un mejor tratamiento del cáncer.

Abreviaturas

DAPI:

4 ', 6-diamidino-2-fenilindol

DL:

Carga de fármaco

DOX:

Doxorrubicina

EE:

Eficiencia de encapsulación

EMM:

Mieloma múltiple extramedular

FCM:

Citometría de flujo

HPLC:

Cromatografía líquida de alto rendimiento

MM:

Mieloma múltiple

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

PEG-CdTe-DOX:

Puntos cuánticos de telururo de cadmio modificado con polietilenglicol

SDS / PAGE:

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

Superrejilla energética de Al / Ni como un generador de micro-plasma con excelentes prestaciones Alto rendimiento de detección de gas de metanol de microesferas Sm2O3 / ZnO / SmFeO3 sintetizadas mediante un método hidrotermal