Estudio cuantitativo de la internalización de nanopartículas de PLGA en células de cáncer laríngeo e inmunes para mejorar la administración de fármacos

Resumen

La traducción clínica de nanomedicinas basadas en ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) se ve limitada, en parte, por la baja eficiencia de administración resultante de la fagocitosis inespecífica por fagocitos. La interacción entre nanopartículas, células cancerosas e inmunes sigue siendo poco comprendida. En este estudio, se realizó una investigación cuantitativa sobre la internalización celular de partículas fluorescentes de PLGA (100 nm, 500 nm y 1 µm) en células de carcinoma laríngeo, con y sin monocitos/macrófagos, en sistemas de monocultivo y cocultivo.

Las partículas de PLGA a concentraciones de 5–20 µg/mL mostraron una biocompatibilidad superior, excepto las de 500 nm y 1 µm a 20 µg/mL, que redujeron ligeramente la viabilidad celular. La observación microscópica reveló que los tres tamaños de partículas son ingeridos eficazmente tanto por células cancerosas como por macrófagos; sin embargo, el examen cuantitativo de fluorescencia mostró que el índice de captación de las células cancerosas (fluorescencia intracelular media por célula cancerosa normalizada frente a la de macrófagos) disminuye sustancialmente para todas las partículas de PLGA en cocultivos comparados con monocultivos (1,35–1,05; 1,50–0,59; y 1,4–0,47 para partículas de 100 nm, 500 nm y 1 µm, respectivamente). El análisis cuantitativo mediante citometría de flujo confirmó la reducción del índice de captación en células cancerosas en cocultivo, pero un mayor recuento de partículas por macrófago.

También se observó que la formación de células gigantes multinucleadas mediante fusión de macrófagos aumentó tras el tratamiento con PLGA, lo que podría explotarse como una estrategia potencial para la administración de fármacos en tumores. En conjunto, estos hallazgos aportan nuevas perspectivas sobre la interacción nanopartícula-inmune-cáncer, lo que podría facilitar la aplicación de nanotransportadores basados en PLGA para el tratamiento del carcinoma laríngeo.

Introducción

El cáncer es una de las principales causas de mortalidad mundial, con alrededor de 10 millones de muertes reportadas en 2018. El carcinoma laríngeo es la segunda neoplasia más común de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (CCSCC), representando aproximadamente 180 000 nuevos casos y 95 000 muertes en 2018. Actualmente, los fármacos dirigidos se desarrollan como opción terapéutica frente a los desafíos de tratamientos tradicionales como cirugía, radioterapia y quimioterapia.

Los nanotransportadores se han empleado ampliamente para cargar fármacos antineoplásicos como cisplatino, paclitaxel y docetaxel, mejorando su solubilidad, biodisponibilidad y estabilidad. En general, la administración de fármacos basada en nanopartículas (NP) permite entregar una amplia gama de sustancias (proteínas, anticuerpos, vacunas, ácidos nucleicos) a regiones específicas del cuerpo en modelos animales y pacientes. Sin embargo, el llamado efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) ha resultado en una eficiencia de direccionamiento considerablemente variable entre diferentes tipos de cáncer. Evidencias recientes sugieren que la deposición de nanotransportadores de fármacos (aquí NP de oro) en tumores depende preferentemente del proceso de transcitosis, un tipo de transporte transcelular biológico en el que las sustancias/NP se transfieren a través de las células de un lado a otro, incluyendo endocitosis, transferencia vesicular y exocitosis. No obstante, los resultados contradictorios sobre los mecanismos de administración dirigida subrayan la importancia crítica de comprender la base de la interacción celular con nanofármacos o NP utilizando múltiples estrategias experimentales, desde cultivos celulares in vitro hasta cultivos de tejidos ex vivo y estudios in vivo en animales.

Numerosos nanotransportadores como liposomas, NP de albúmina, NP de sílice y poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) se han empleado clínicamente para tratar distintos tipos de cáncer, incluido el carcinoma laríngeo. Los NP basados en polímeros, como micelas y PLGA, tienen gran potencial en aplicaciones biomédicas debido a sus formulaciones versátiles, excelente capacidad de autoensamblaje, alta carga de fármaco y biocompatibilidad. Por ejemplo, nanotransportadores de PLGA recubiertos con polietilenglicol (PEG) y cargados con doxorrubicina y verde de indocianina permiten una quimio-fototermoterapia sinérgica para el cáncer de mama. Asimismo, estudios in vitro e in vivo han demostrado que micelas cargadas con cisplatino exhiben una excelente actividad anticancerígena contra tumores ortotópicos de CCSCC (p. ej., SAS-L1 y HSC-2). Aunque varios nanotransportadores poliméricos como PLGA y micelas han sido aprobados para uso clínico o se evalúan en ensayos, muchos más nanofármacos poliméricos están en investigación preclínica con diferentes líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello y modelos de xenoinjertos tumorales en animales.

La evidencia científica destaca la importancia de las respuestas inmunológicas del huésped frente a los nanotransportadores, ya que una vez que estas NP ingresan al organismo, son inevitablemente reconocidas por el sistema inmune. Los macrófagos se consideran la primera línea de defensa celular, especializados en la neutralización y eliminación de alérgenos, microorganismos y partículas extrañas (p. ej., nanotransportadores) mediante fagocitosis y posterior activación de respuestas inmunes. La mayoría de los nanotransportadores de nuevo diseño han fallado en la administración dirigida a regiones enfermas o tumores in vivo debido a la eficiente acumulación de NP en el sistema fagocitario mononuclear (SFM), como las células de Kupffer en el hígado y macrófagos de la pulpa roja en el bazo. Por tanto, comprender los mecanismos de captación celular de NP por células inmunes como monocitos y macrófagos es crucial, ya que determina la vida media de los nanotransportadores en tejidos y fluidos biológicos relevantes. Los sistemas de cocultivo celular in vitro han atraído creciente atención en nanomedicina y toxicología por la demanda de resultados más representativos de las condiciones in vivo. De hecho, los sistemas de cocultivo han demostrado imitar de forma realista estados tisulares sanos y enfermos, y se han utilizado confiablemente en estudios de captación celular de NP y absorción de fármacos. El uso de modelos de cocultivo de células cancerosas e inmunes ofrece una plataforma adecuada para sondear las rutas y mecanismos de captación de estos nanomateriales, lo que podría facilitar el diseño de nanotransportadores mejor dirigidos a células cancerosas mientras se reduce la fagocitosis de NP. Por ello, es esencial determinar la eficiencia y el destino de las NP en células cancerosas en presencia de células inmunes. La mayoría de los nanotransportadores se han diseñado con diámetros de 50–200 nm para aprovechar el efecto EPR y prolongar la circulación sanguínea, mientras que NP mayores (> 500 nm) son eliminados eficientemente por el SFM. El PLGA, un nanotransportador aprobado por la FDA, en diferentes tamaños (100, 500 y 1000 nm) fue seleccionado para investigar las capacidades de captación de UM-SCC-17A (línea celular clásica de carcinoma escamoso laríngeo) y THP-1 (línea celular humana monocítica aguda). Varios estudios in vitro han aplicado nanotransportadores de PLGA para administrar fármacos y eliminar células de CCSCC en monocultivos; este es el primer estudio que sondea simultáneamente la eficiencia y el mecanismo de captación de NP por células inmunes y cancerosas laríngeas en un modelo de cocultivo empleando diferentes tamaños de PLGA, lo que podría proporcionar una base fundamental para el desarrollo de nanomedicinas seguras por diseño para la terapia de CCSCC.

Materiales y métodos

Materiales

Se utilizaron tres partículas de PLGA comercializadas (Sigma-Aldrich) con diferentes tamaños: 100 nm, 500 nm y 1000 nm. Todas las partículas estaban cargadas con fluoróforos verdes con longitudes de onda de excitación/emisión ópticas de 460 nm y 500 nm. Las partículas se recibieron en forma de polvo y se suspendieron en agua destilada a una concentración final de 10 mg/mL para su uso posterior. Los diámetros hidrodinámicos y potenciales zeta de las tres partículas se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) con un instrumento Malvern Zeta Sizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Reino Unido). Las suspensiones madre de cada partícula se diluyeron 1:100 en 80 µL de agua destilada para la medición DLS. Siguiendo las indicaciones del fabricante, se obtuvieron 3 mediciones repetidas para cada partícula.

Cultivos celulares de UM-SCC-17A y THP-1 y exposición a partículas

La línea celular humana de carcinoma laríngeo UM-SCC-17A y la línea celular monócitica/macrofágica humana THP-1, adquiridas de Sigma-Aldrich (EE. UU.) y Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, China), respectivamente, se utilizaron para construir el modelo in vitro. Las células UM-SCC-17A y THP-1 se cultivaron en medio DMEM o RPMI-1640 suplementado con 10 % SFB (Gibco, Alemania) y 1 % solución de penicilina-estreptomicina (Gibco, Alemania) a 37 °C con 5 % CO₂. Las células THP-1 se expusieron a soluciones de 100 nM de acetato de 12-miristato-13-forbol (PMA) (Sigma, EE. UU.) durante 72 h antes de la siembra para diferenciarse en macrófagos. Ambas líneas celulares se sub cultivaron usando 0,5 % tripsina-EDTA cada 3 días, y la morfología celular se verificó diariamente para asegurar la salud celular.

Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 0,1 × 10⁶ células/pocillo para monocultivos (ensayos WST-1 y LDH) o en cubreobjetos de vidrio estériles en placas de 24 pocillos para microscopía de fluorescencia. Para el modelo de cocultivo, las células UM-SCC-17A se sembraron primero a 50 000/pocillo durante la noche y luego se añadieron 50 000/pocillo de células THP-1. Las partículas se suspendieron en 500 µL del respectivo medio de cultivo para monocultivos o medio mixto 1:1 para cocultivos, y se expusieron a las muestras celulares durante 24 h a concentraciones finales de 5, 10 y 20 µg/mL para ensayos WST-1 y LDH, o 10 µg/mL para microscopía de fluorescencia.

Para mediciones FACS, las células se sembraron en placas de 12 pocillos de la misma manera a una densidad de 250 000 células/pocillo, o 125 000 células/pocillo cada una para el modelo de cocultivo. Las células crecieron en 1 mL de medio de cultivo durante la noche y se expusieron a partículas de PLGA a una concentración final de 10 µg/mL durante 24 h.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó mediante el kit de reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, la solución WST-1 se diluyó 1:10 en el respectivo medio de cultivo para monocultivos de UM-SCC-17A o THP-1, o medio mixto 1:1 para cocultivos. El sobrenadante se retiró tras la exposición, y las células se incubaron con 500 µL de solución de trabajo WST-1 a 37 °C durante 30 min. Las muestras se recogieron y centrifugaron a 14 000 rpm durante 10 min para eliminar las partículas. La absorbancia (valor OD) de las soluciones se midió a 450 nm usando un Infinite®F200 (Tecan, EE. UU.). Los valores de absorbancia se corrigieron restando el valor de una muestra en blanco que contenía solo la solución de trabajo WST-1, y las viabilidades relativas se compararon con la muestra control sin tratar.

Ensayo de fuga de membrana celular (LDH)

La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) se midió usando un kit comercial de detección de citotoxicidad (LDH) (Roche, Alemania) para determinar la citotoxicidad por partículas de PLGA. El sobrenadante celular se recogió 24 h tras la exposición, se centrifugó a 14 000 rpm durante 10 min y se diluyó 1:10 en 200 µL de medio de cultivo completo. El control positivo se definió como la liberación total de LDH incubando las células con 0,2 % Triton X-100 a 37 °C durante 15 min, diluido 1:50 en 200 µL de medio completo. Las muestras se incubaron con 100 µL de solución de trabajo del ensayo LDH durante 30 min a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con 50 µL de HCl al 1 %. La absorbancia a 492 nm se midió con Infinite®F200 (Tecan, EE. UU.), y las concentraciones relativas de LDH se calcularon según la ecuación:

Concentración relativa de LDH = (OD muestra – OD blanco) / (OD control positivo – OD blanco) × 5 × 100 %

Microscopía de fluorescencia

Las células se visualizaron mediante tinción con Hoechst para localizar las partículas bajo microscopio de fluorescencia. Tras 24 h de exposición, las células se lavaron con PBS tres veces y se fijaron con formaldehído al 4 % durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se incubaron con 200 µL de solución de tinción que contenía Hoechst diluido 1:1000 y 1 % BSA en PBS durante 30 min. Los cubreobjetos se colocaron sobre un portaobjetos de vidrio boca abajo y se mantuvieron con una gota de agente anti-desvanecimiento de fluorescencia DAKO para visualización. Se configuraron cuatro canales ópticos: campo claro para morfología celular, DAPI para núcleos celulares y GFP para partículas. Los tiempos de exposición del canal de partículas para cada imagen fluorescente se registraron y usaron para homogeneizar la intensidad de fluorescencia entre diferentes partículas, y las partículas intracelulares se calcularon por intensidad de fluorescencia en áreas seleccionadas al azar mediante ImageJ. El índice de captación en diferentes partículas se comparó entre células UM-SCC-17A monocultivadas o en cocultivo. Brevemente, la intensidad fluorescente media (MFI) de partículas internalizadas se calculó en, p. ej., 50 células para cada tipo celular, determinada como la resta entre la intensidad de fluorescencia total (I_total) de un área específica y la autofluorescencia (I_auto) de un área del mismo tamaño en región libre de partículas. El índice de captación de células cancerosas se determinó por la MFI de UM-SCC-17A normalizada a la de THP-1 en monocultivo o cocultivo, siguiendo la ecuación:

Índice de captación = (I_total1 – I_auto1) (MFI_UM-SCC-17A) / (I_total2 – I_auto2) (MFI_THP-1)

Citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)

El FACS se realizó para medir la capacidad de captación de las tres partículas de forma cuantitativa. Las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar el medio y partículas disociadas 24 h tras la exposición, e incubaron con 200 µL de 0,5 % tripsina-EDTA (Gibco, Alemania) a 37 °C durante 4 min para desprenderlas. La reacción se detuvo añadiendo 2 mL de medio de cultivo completo, y la suspensión celular se trasladó a un tubo de vidrio para medición FACS y centrifugó 5 min a 300 × G, 4 °C. El sobrenadante se retiró suavemente y las células se resuspendieron en 200 µL PBS y conservaron en hielo. Las células vivas se seleccionaron primero separándolas de desechos y células muertas usando dispersión frontal (FSC-A) y lateral (SSC-A). Luego, las células en cocultivo se analizaron usando canal APC versus FSC-A para separar células UM-SCC-17A de macrófagos según el tamaño celular. Se analizaron 30 000 células por muestra, y la intensidad de fluorescencia media por célula se calculó y normalizó entre diferentes partículas. Paralelamente, tras 24 h de incubación de partículas con células, el sobrenadante del cultivo, tampón de lavado (tres lavados para eliminar partículas residuales adheridas a la superficie celular) y células (digestión tripsínica) se recogieron para medir la intensidad fluorescente usando un lector de microplacas (Infinite®F200, Tecan). Con este enfoque, se determinó el porcentaje de partículas ingeridas por células para cada grupo; p. ej., aproximadamente 30 000 partículas expuestas a una sola célula en placa de 12 pocillos (250 000 células totales) a una dosis de 5 µg de partículas de PLGA de 100 nm, resultando en un promedio de 13 000 partículas internalizadas por célula, ~43 % de la dosis aplicada entregada a las células. Este porcentaje de entrega puede usarse para calcular los recuentos de partículas en el sistema de cocultivo para cada tipo celular en FACS.

Cuantificación de fusión celular

La fusión de macrófagos a células gigantes multinucleadas (CGM) se definió como una célula gigante que contiene morfológicamente dos o más núcleos dentro de un citoplasma normal, identificable clara y simultáneamente en imágenes de campo claro y fluorescentes tras tinción. El porcentaje de fusión celular se calculó mediante el número de núcleos de CGM (conteo manual) normalizado al recuento total de células, determinado de forma automatizada en ImageJ.

Análisis estadístico

Se utilizó el software GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para análisis estadístico y visualización de resultados. Tras ANOVA de una vía, se aplicó el método Holm-Sidak o prueba t para comparar resultados de múltiples grupos o dos grupos, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron con triplicados independientes, y los datos se presentaron como media ± desviación estándar (DE). Resultados con valor p < 0,05 (*) y p < 0,01 (**) se consideraron significativos.

Resultados y discusión

Caracterización de partículas de poli(ácido láctico-co-glicólico)

Las micrografías de fluorescencia de partículas de PLGA mostraron intensidad fluorescente robusta y no disminuciones significativas en señales de fluorescencia a lo largo de 14 días tras la preparación, sugiriendo distribución de tamaño relativamente homogénea y alta estabilidad de fluorescencia. Según el proveedor, las partículas de PLGA de 100, 500 y 1000 nm mostraron tamaños de ~80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm y 951,9 ± 237,5 nm, respectivamente. Las mediciones de potencial zeta revelaron cargas superficiales promedio de −20,6 ± 5,3; −17 ± 4,6; y −16,5 ± 3,5 con índices de polidispersidad de 0,057, 0,056 y 0,062 para partículas de 100, 500 y 1000 nm, indicando estándares altamente monodispersos. Todas las partículas se vortexaron y sonicaron en baño de agua 5 min para eliminar agregación. Sin embargo, se observaron picos pequeños correspondientes a 100 y 1000 nm con diámetros ~4–6 µm debido a agregación inevitable en cantidades muy pequeñas (~3–4 %).

Evaluación de viabilidad y citotoxicidad celular

Debido a su excelente biocompatibilidad y biodegradabilidad, las partículas de PLGA han sido aprobadas por la FDA y la Agencia Europea de Medicamentos para aplicaciones biomédicas. Sin embargo, la eficiencia de direccionamiento y eficacia terapéutica de las partículas de PLGA se ven obstaculizadas, al menos parcialmente, por el sistema inmune. Por ejemplo, la alta fagocitosis de partículas por células de Kupffer en el hígado restringe enormemente que los nanotransportadores alcancen el sitio tumoral. Por tanto, es vital establecer modelos in vitro avanzados para estudiar la interacción entre células cancerosas, inmunes y partículas, imitando mejor la situación in vivo de administración de fármacos. UM-SCC-17A es una línea celular única de carcinoma escamoso laríngeo aislada de muestra primaria de cáncer de laringe. Sin embargo, la información sobre su eficiencia de captación celular in vitro en sistemas de cocultivo (p. ej., co-incubación de macrófagos y células cancerosas) es aún insuficiente, cuestión que debe abordarse para mejorar la capacidad predictiva de respuestas in vivo. Además, se ha demostrado que el tamaño de partícula y el recubrimiento superficial juegan un papel importante en la capacidad de administración a tumores sólidos, sitios enfermos y células cancerosas en modelos animales y cultivos celulares. Aquí se aplicaron tres tamaños de PLGA a células de carcinoma UM-SCC-17A para investigar los efectos del tamaño de partícula en la captación celular y distribución intracelular en monocultivo y cocultivo.

La viabilidad celular se determinó mediante WST-1 para monocultivos de THP-1 y UM-SCC-17A, y cocultivo de ambos. No se observó muerte celular evidente en grupos tratados con PLGA de 100 y 500 nm a todas las concentraciones probadas; sin embargo, PLGA de 500 nm y 1 µm a la concentración más alta (20 µg/mL) redujeron significativamente la viabilidad en monocultivo de UM-SCC-17A. Como era de esperar, la viabilidad de THP-1 no se afectó significativamente tras 24 h de incubación con los tres tipos de PLGA a 5–20 µg/mL (≥ 95 % viabilidad frente a células sin tratar, consideradas 100 %). Idéntico a monocultivo UM-SCC-17A, la viabilidad en cocultivo no se alteró con PLGA de 100 y 500 nm en tres dosis, mientras que disminuyó significativamente en el grupo tratado con 20 µg/mL de PLGA de 1 µm.

La evaluación de citotoxicidad mediante ensayo LDH determinó fuga de membrana midiendo LDH extracelular. La liberación de esta enzima citoplasmática al sobrenadante es característica de lesión de membrana, conduciendo a muerte celular irreversible. A pesar de un ligero aumento de LDH con dosis mayores en monocultivo UM-SCC-17A tratado con varias dosis de PLGA de 1 µm, no se observó citotoxicidad distinta incluso a 20 µg/mL. Como era de esperar, los tres tamaños de PLGA a varias dosis no indujeron liberación sustancial de LDH, indicando efectos tóxicos insignificantes en monocultivo THP-1, consistente con los resultados de viabilidad. En experimentos de cocultivo, todas las partículas con diferentes concentraciones mostraron excelente biocompatibilidad hacia ambas células en términos de niveles de LDH liberados. En general, el amplio rango de tamaño de partícula (100 nm a 1 µm) cubre tamaños típicos de nanotransportadores (50–200 nm) como liposomas, micelas, dendrímeros, polímeros y minicélulas, así como partículas submicrónicas (500 nm aún consideradas NP, p. ej., partículas ~500 nm tienen vías de aclaramiento pulmonar similares a NP de 10–100 nm) y partículas de 1 µm. Ninguna partícula de PLGA mostró citotoxicidad obvia en THP-1 y/o UM-SCC-17A en monocultivo y cocultivo, excepto PLGA de 500 nm y 1 µm a la concentración más alta contra UM-SCC-17A y cocultivo (pero > 85 % células sobreviven), indicando que son favorables para aplicaciones en sistemas de administración de fármacos.

Capacidad de captación celular de PLGA en monocultivo y cocultivo

La figura 4 muestra morfología celular, núcleos y NP de 100 nm, e imágenes fusionadas ampliadas en monocultivo y cocultivo. No se observaron partículas en células control sin tratar. Grandes aglomerados de NP de PLGA de 100 nm se observaron en citoplasma de macrófagos en monocultivo. Por otro lado, monocultivo UM-SCC-17A mostró excelente capacidad de captación de PLGA de 100 nm, evidenciada por brillantes señales de fluorescencia verde dentro de la membrana celular. Para ilustrar mejor la acumulación intracelular de PLGA en THP-1 o UM-SCC-17A y partículas extracelulares en cocultivos, se aplicaron superposiciones de imágenes de campo claro con fluorescencia. En cocultivo, ambos tipos celulares son diferenciables por morfología y tamaño en imágenes de campo claro: macrófagos muestran forma redonda y tamaño pequeño, mientras que células cancerosas exhiben tamaño grande y forma alargada. Sin embargo, las células cancerosas mostraron ingestión celular insuficiente debido a la alta captación de PLGA de 100 nm por macrófagos en cocultivo. Esto es esperado porque los macrófagos son células inmunes eficientes y específicas para fagocitosis de microorganismos, alérgenos y partículas extrañas.

De manera similar, las figuras 5 y 6 muestran análisis cualitativo de capacidad de captación de PLGA de 500 nm y 1 µm en cultivos monocelulares o mixtos. Cabe destacar que ambas morfologías celulares no se alteraron tras tratamiento con diferentes tamaños de PLGA a 10 mg/mL. PLGA de 500 nm y 1 µm mostraron mayor intensidad de fluorescencia en células UM-SCC-17A solas que en THP-1 solas. En incubaciones de cocultivo, hay disminuciones aparentes de señal en células cancerosas, donde la intensidad fluorescente de partículas fue menor que en macrófagos. Los macrófagos fagocitaron todos los tipos de partículas rápida y eficazmente, impidiendo que las células cancerosas ingirieran suficientes partículas en cocultivo. Para cuantificar el efecto de la fagocitosis en la capacidad de captación por células cancerosas para diferentes tamaños de PLGA, se realizó un análisis óptico semi-cuantitativo. Brevemente, las intensidades de fluorescencia de partículas se calcularon basándose en, p. ej., 50 células cargadas de partículas individuales para obtener un valor medio para ambos tipos celulares, y el índice de captación de células cancerosas se determinó promediando la intensidad fluorescente intracelular por célula cancerosa normalizada a la de macrófagos. En monocultivo, el índice de captación de células cancerosas para PLGA de 100 nm fue ~1,34 ± 0,19, sugiriendo que las células cancerosas ingirieron más partículas que los macrófagos en monocultivo. Esto no es sorprendente debido a la alta viscosidad de partículas de PLGA y el mayor tamaño de células cancerosas laríngeas. De igual modo, PLGA de 500 nm y 1 µm también fueron ampliamente internalizadas por células cancerosas con índices de ~1,5 ± 0,25 y ~1,4 ± 0,31 en monocultivo. Los índices para partículas grandes disminuyeron sustancialmente (0,59 ± 0,12 y 0,47 ± 0,1) en presencia de macrófagos en cocultivo. Mientras tanto, se observaron capacidades de internalización idénticas para ambos tipos celulares tras 24 h de incubación con PLGA de 100 nm en cultivo mixto. En conjunto, los resultados sugieren que la ingestión de partículas por células cancerosas y macrófagos podría depender de diferentes rutas de captación en monocultivo y ambiente de cocultivo. Además, la presencia de macrófagos reduce la internalización de PLGA por células cancerosas, particularmente para partículas grandes, evento biológico observado en estudios in vivo de administración de nanomedicamentos.

Cuantificación de captación celular por citometría de flujo

La citometría de flujo se usa ampliamente para determinar la interacción partícula-célula cuantitativamente, p. ej., captación dependiente del tamaño de partículas de poliestireno (20–1000 nm) por células dendríticas in vivo. El FACS se utilizó para analizar el porcentaje de células positivas a NP y número de partículas en esas células en monocultivo y cocultivo. Luego, los recuentos promedio de NP en una sola célula se calcularon determinando la intensidad de fluorescencia total en células cargadas de partículas normalizada a la fluorescencia de la dosis total aplicada. P. ej., ~70 % de PLGA de 500 nm se depositó en células cancerosas, mientras que el residual permaneció en el sobrenadante. Esta intensidad medida por lector Tecan se comparó con señales promedio/totales FACS (valores FITC de P5 y P6) para estimar el número de partículas en cocultivo. Al sembrar células en cocultivo, aproximadamente la mitad fueron reconocidas como macrófagos y el resto como células cancerosas. Se observó que ~13 000 partículas individuales de PLGA de 100 nm se acumularon en células cancerosas y 9700 en macrófagos en monocultivo, consistente con exámenes microscópicos. Un número mucho menor (164 ± 30 y 45 ± 15) fue ingerido por células cancerosas monocultivadas para PLGA de 500 nm y 1 µm, con conteos ligeramente menores en macrófagos respectivos. El número de partículas ingeridas por célula individual concuerda con la literatura; p. ej., promedio 2500 NP de oro recubiertas con bromuro de cetiltrimetilamonio depositadas en células epiteliales, mientras que NP de oro modificadas con PEG solo tenían unas decenas por célula. En cocultivo, inesperadamente, hubo un ligero aumento del número de partículas de 100 nm en células cancerosas, a pesar de mayor internalización por macrófagos. Comparando el índice de captación en monocultivo vs cocultivo, también se reduce ~25 % para PLGA de 100 nm. Los índices disminuyeron significativamente ~2,5 y 3 veces en cocultivo para PLGA de 500 nm y 1 µm, respectivamente. En general, la existencia de macrófagos afecta largamente la capacidad de captación de células cancerosas, especialmente para partículas grandes, en excelente acuerdo con observaciones previas.

Actualmente, diferentes vías de captación por células cancerosas para partículas de distintos tamaños y modificaciones superficiales (endocitosis mediada por clatrina, caveolae, independiente de clatrina/caveolae, micropinocitosis, macropinocitosis) se han reportado. Por ejemplo, agregados de óxido de hierro < 200 nm son captados por células MCF-7 vía endocitosis mediada por clatrina, mientras que agregados mayores tienden a ingerirse vía macropinocitosis. Otro estudio mostró que partículas de poliestireno lisas de 100 nm tienden a captarse principalmente vía macropinocitosis, mientras que la internalización de partículas carboxiladas prefiere la ruta de endocitosis mediada por clatrina. La fagocitosis es vía clásica para células inmunes como neutrófilos, células dendríticas y, sobre todo, monocitos/macrófagos. Las vías de captación dependen de varios parámetros de vesículas de administración: tamaño, composición química, modificación superficial, proteínas en el ambiente de cultivo y tipo celular. Usualmente, múltiples vías pueden participar, como endocitosis mediada por caveolae, clatrina y macropinocitosis, halladas en internalización de NP de quitosano de 300–400 nm en células HeLa humanas. También se observó que NP de pululano modificadas con colesterol de 63 nm entran en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) vía macropinocitosis y endocitosis mediada por clatrina. Estudios previos mostraron que la captación de PLGA involucra diferentes vías endocíticas, donde la endocitosis independiente de clatrina es la ruta principal para internalización de PLGA in vitro. Sin embargo, una vez dentro, las partículas de PLGA usadas aquí quedaban potencialmente atrapadas en el sistema endo-lisosomal (endosomas tempranos, de reciclaje, tardíos y lisosomas). Cabe notar la falta de estudios sobre mecanismos de captación en sistemas de co- o tri-cultivo in vitro, aspecto a investigar en el futuro.

Inducción de fusión celular por NP de PLGA

Evidencia científica extensa muestra que la fusión de monocitos/macrófagos en células gigantes multinucleadas (CGM) ocurre en amplia gama de procesos biológicos. Generalmente, la implantación de biomateriales causa respuesta a cuerpo extraño caracterizada por fusión de macrófagos en CGM y encapsulación fibrótica. Diversos tipos de células primarias humanas y murinas (macrófagos alveolares, esplénicos, microglía, macrófagos derivados de médula ósea, monocitos sanguíneos) y líneas celulares (RAW264.7, UG3) forman CGM in vitro. Se sabe que los macrófagos forman fenotipo fusogénico cuando no pueden ingerir materiales extraños por fagocitosis debido al gran tamaño de partículas o implantes. Hasta ahora, no está claro si la fusión in vitro de macrófagos se relaciona con tamaño de partícula en rango 100–1000 nm, fácilmente fagocitables. Aquí, la fusión celular se observó en todos los grupos por examen microscópico. La fusión se confirmó solo cuando múltiples núcleos compartían el mismo citoplasma en imágenes de fluorescencia y campo claro. La formación espontánea de células gigantes por THP-1 ocurrió en grupo control sin tratamiento, con porcentaje de fusión ~10 % del total, como se reporta. Se halló fusión celular dependiente del tamaño para PLGA de 100 y 500 nm, mientras que PLGA de 1 µm indujo incremento insignificante en monocultivo. Esto puede deberse al bajo número de partículas de 1 µm expuestas a células (~60 partículas por célula a 10 µg/mL). Cuando macrófagos se cocultivaron con células cancerosas, los porcentajes de formación de CGM aumentaron en todos los grupos frente a monocultivos correspondientes. En particular, hubo incremento significativo de fusión para PLGA de 1 µm (19 %) en cultivo mixto. El aumento más prominente ocurrió con PLGA de 500 nm en cocultivo, atribuible al gran tamaño de partícula y número suficiente ingerido por célula.

La maquinaria molecular involucrada en fusión de macrófagos se ha investigado ampliamente, logrando avances sustanciales. Por ejemplo, la formación de receptores de fusión CD47 y CD44 permite mediar el proceso de fusión y posterior diferenciación de células gigantes, y la entrega de miR-223 por vesícula NP permite atenuarla. Por tanto, estudios futuros deben enfocarse en determinar moléculas clave en la regulación de fusión inducida por partículas y receptores dominantes en membrana de célula gigante. Otra preocupación importante es el destino de las CGM. Se cree que las CGM fusionadas con partículas o estímulos podrían experimentar apoptosis o necrosis, llevando a liberación de partículas no digeridas u otros materiales gigantes a otras células in vitro o tejidos in vivo, induciendo respuesta inflamatoria crónica o granulomas. Por otro lado, la fusión de macrófagos podría beneficiar la administración de nanofármacos; p. ej., en tejidos tumorales, la re-liberación de fármacos de macrófagos a células cancerosas podría representar mayor capacidad de eliminación tumoral. Más importante, futuros estudios de nanomedicina deben abordar cómo explotar la fusión de macrófagos para administración de nanotransportadores en diagnóstico y terapia mejorados. Esto es porque los macrófagos no solo son abundantes en el organismo con excelente capacidad de captación de nanofármacos, sino que también pueden usarse en administración génica dirigida para reparación de tejidos lesionados.

Conclusiones

Según nuestro conocimiento, este estudio reporta por primera vez la captación celular competitiva de partículas de PLGA (100 nm–1 µm) en células de cáncer laríngeo UM-SCC-17A y monocitos/macrófagos THP-1 en cocultivo. Los datos demuestran que las células inmunes pueden alterar/reducir la internalización de partículas por células cancerosas in vitro, similar a hallazgos previos en estudios in vivo de administración de nanotransportadores. También se demostró fusión celular de macrófagos dependiente del tamaño y relacionada con el cultivo causada por PLGA. Estudios futuros deben sondear el mecanismo de captación en sistemas de cocultivo y diseñar enfoques novedosos para lograr mayor índice de captación en células de cáncer laríngeo en presencia de fagocitos. Además, se necesita evaluación detallada del tráfico intracelular y destino de nanotransportadores en sistemas de co- o tri-cultivo 3D, que imiten mejor condiciones in vivo, antes de utilizar estudios in vivo en animales e incluso ensayos clínicos.