Administración optimizada de mitoxantrona usando nanopartículas de pululano modificado con colesterol: eficacia antitumoral dependiente del tamaño contra cáncer de vejiga

Resumen

Mejorar la administración de quimioterápicos con nanopartículas puede reducir dosis sistémicas y toxicidad. En este estudio diseñamos polímeros de pululano sustituidos con colesterol (CHP) para cargar mitoxantrona y variamos sistemáticamente la sustitución hidrofóbica para generar nanopartículas (NP) de tamaños distintos. Tres CHP —CHP‑1 (6,82 % colesterol, 86,4 nm), CHP‑2 (5,78 % colesterol, 162,3 nm) y CHP‑3 (2,74 % colesterol, 222,3 nm)— se caracterizaron por RMN ¹H y dispersión dinámica de luz. La liberación de mitoxantrona en tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) a 48 h alcanzó 38,7 %, 42,4 % y 58,9 % para CHP‑1, CHP‑2 y CHP‑3, respectivamente. Medios ácidos (pH 4,0) aceleraron la liberación, particularmente para las partículas mayores (75,5 % tras 48 h). In vitro, las NP CHP‑3 exhibieron la mayor citotoxicidad (IC₅₀ = 0,25 µM a 24 h) e indujeron la mayor apoptosis e inhibición de migración en células MB49 de cáncer de vejiga. Estos resultados demuestran que CHP mayores, ricos en colesterol, mejoran la carga de fármaco, sostienen la liberación y mejoran la actividad antitumoral.

Antecedentes

La quimioterapia tradicional sufre de distribución no específica y efectos secundarios severos, notablemente la cardiotoxicidad de antraciclinas como la mitoxantrona. Los vectores basados en nanopartículas pueden explotar el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) para acumularse preferentemente en tejido tumoral, mejorando así el índice terapéutico. El pululano, un polisacárido no tóxico y biodegradable, puede volverse anfifílico al injertar colesterol hidrofóbico mediante un espaciador succínico, generando nanoesferas autoensambladas con un núcleo hidrofóbico para encapsulación de fármacos.

El tamaño de nanopartícula influye críticamente en la captación celular, liberación de fármaco y biodistribución. La endocitosis óptima ocurre típicamente para partículas en el rango 25–50 nm, mientras que partículas mayores pueden persistir más en circulación y liberar cargas más gradualmente. El presente trabajo investiga cómo la variación de sustitución de colesterol —y así el tamaño de NP— modula la liberación de mitoxantrona y la eficacia antitumoral.

Materiales y métodos

Reactivos

Mitoxantrona (Aladdin Chemistry), pululano, éster succínico de colesterol (CHS) y otros reactivos se compraron de proveedores estándar. Membranas de diálisis (PMCO 8–12 kDa) se usaron para carga de fármaco.

Síntesis y caracterización de CHP

Pululano (0,5 g) reaccionó con CHS (ratios de alimentación 0,20, 0,15, 0,05 mmol mmol⁻¹) en DMSO bajo activación con DMAP y EDC. Los CHP resultantes se precipitaron en etanol, purificaron y secaron. RMN ¹H (DMSO‑d₆) confirmó el injerto de colesterol y cuantificó el grado de sustitución (DS) usando el pico de metileno a 2,53 ppm. Los valores DS fueron 6,82 % (CHP‑1), 5,78 % (CHP‑2) y 2,74 % (CHP‑3).

Preparación de NP cargadas con fármaco

Mitoxantrona (4 mg) se incorporó en cada CHP (40 mg) por diálisis contra PBS. Las NP finales se liofilizaron, redispersaron en agua y analizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS). El potencial zeta fue −1,12 mV.

Liberación in vitro

Las NP se incubaron en PBS (pH 7,4), tampón acetato (pH 6,8) y tampón citrato (pH 4,0) a 37 °C. La liberación de fármaco se cuantificó por espectrofotometría UV–vis a 490 nm, y los porcentajes de liberación acumulada (Q%) se calcularon a 48 h.

Estudios celulares

Células murinas de cáncer de vejiga MB49 se cultivaron en DMEM + 10 % FBS. La citotoxicidad se midió por MTT a 24, 48 y 72 h; los valores IC₅₀ se derivaron de curvas dosis-respuesta. La apoptosis se evaluó mediante tinción Annexin V/PI y citometría de flujo. La migración celular se evaluó usando un ensayo de herida (scratch-wound), con análisis de imagen por ImageJ.

Resultados y discusión

Confirmación estructural de CHP

Los espectros RMN ¹H mostraron señales características de pululano y nuevos picos (0,40–2,40 ppm) confirmando el injerto de colesterol. Los DS calculados coincidieron con los ratios de alimentación previstos, confirmando sustitución controlada.

Tamaño y morfología de NP

Los CHP en blanco formaron nanopartículas de 79,1, 104,9 y 166,8 nm para CHP‑1, CHP‑2 y CHP‑3, respectivamente. Tras la carga de fármaco, los tamaños aumentaron a 86,4, 162,3 y 222,3 nm, reflejando encapsulación del fármaco en el núcleo hidrofóbico. Las imágenes TEM revelaron partículas uniformes y esféricas.

Carga y liberación de fármaco

Las eficiencias de carga fueron 88,9 % (CHP‑1), 82,3 % (CHP‑2) y 50,7 % (CHP‑3). Los perfiles de liberación mostraron liberación sostenida en pH neutro, con partículas mayores liberando más fármaco a 48 h. Condiciones ácidas aceleraron la liberación: a pH 4,0, la liberación acumulada alcanzó 75,5 % para CHP‑3.

Actividad antitumoral

Los ensayos MTT revelaron valores IC₅₀ de 0,25 µM (CHP‑3) a 24 h, comparado con 0,20 µM (CHP‑2) y 0,06 µM (mitoxantrona libre). Los ensayos de apoptosis confirmaron mayores tasas de apoptosis temprana y tardía para CHP‑3, seguidas por CHP‑2 y CHP‑1. Los ensayos de migración mostraron inhibición comparable por fármaco libre y NP, con CHP‑3 logrando el efecto más pronunciado.

Perspectivas mecanísticas

La eficacia superior de CHP mayores probablemente proviene de liberación extracelular mejorada dentro del microambiente tumoral ácido, acoplada con captación celular mejorada vía pinocitosis. La estabilidad del núcleo hidrofóbico gobierna la cinética de liberación, mientras que la carga superficial neutra favorece la biodistribución.

Conclusión

Las nanopartículas de pululano modificado con colesterol exhiben carga de fármaco, liberación y actividad antitumoral dependientes del tamaño. NP mayores, ricas en colesterol (CHP‑3), proporcionan administración superior de mitoxantrona, logran mayor citotoxicidad y apoptosis, e inhiben más eficazmente la migración de células de cáncer de vejiga. Estos hallazgos apoyan el desarrollo futuro de CHP como nanovectores seguros y biodegradables para quimioterapia dirigida.