Nanopartículas biodegradables de óxido de zinc dopado con Fe: Un prometedor sistema de administración de hierro para aplicaciones biológicas

Resumen

El hierro es un elemento crucial para los organismos vivos y su deficiencia se describe como el trastorno nutricional más común en todo el mundo. Hoy en día, estrategias de suplementación de hierro más efectivas y seguras tanto para humanos como para animales se han convertido en uno de los desafíos más importantes en la terapia de deficiencias nutricionales. Nuestros estudios previos in vivo confirmaron la seguridad y biodegradabilidad de nanopartículas de óxido de zinc fabricadas internamente y su rápida distribución a la mayoría de órganos y tejidos del cuerpo. Exámenes in vitro realizados en la línea celular Caco-2, modelo de células epiteliales del tracto gastrointestinal, revelaron una baja toxicidad de los nanomateriales estudiados. En el estudio actual, investigamos nanopartículas biodegradables de óxido de zinc dopadas con Fe(III) como una perspectiva estrategia de suplementación para la deficiencia de hierro. Nanopartículas ZnO:Fe biodegradables se administraron por vía intragástrica a ratones adultos y, tras 24 h, los animales fueron sacrificados con recolección de órganos internos para análisis posteriores. La concentración de hierro medida con espectrometría de absorción atómica y tinción histológica (método de Perl) mostró una rápida distribución de las nanopartículas dopadas con hierro a tejidos específicamente relacionados con la homeostasis del hierro. La acumulación de hierro también fue visible dentro de hepatocitos y alrededor de vasos sanguíneos en el bazo, lo que podría indicar la transferencia de nanopartículas Fe-dopadas desde el torrente sanguíneo al tejido. En resumen, los resultados preliminares obtenidos sugieren que las nanopartículas biodegradables de ZnO dopadas con Fe podrían ser buenos vehículos de hierro exógeno en el organismo vivo. Por tanto, se requieren investigaciones posteriores centradas en determinar los mecanismos exactos relacionados con la deposición de hierro en el tejido y la influencia de los vehículos de nanopartículas sobre el metabolismo del hierro.

Introducción

El hierro es uno de los componentes más importantes que构建 los organismos vivos en la Tierra, incluida la población humana. La importancia de este elemento está relacionada con su papel esencial en muchas estructuras y procesos que ocurren en el cuerpo, por ejemplo, el transporte de oxígeno a todos los tejidos y células (parte de la hemoglobina y mioglobina), la producción de energía (componente de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial) y muchos más [1,2]. Así, el hierro participa en procesos vitales cruciales de las células y del organismo completo, y su deficiencia puede conducir a alteraciones significativas en el funcionamiento del cuerpo vivo.

Como muestran los informes mundiales, la deficiencia de hierro se ha convertido en un grave problema de salud pública en la población humana. Según la OMS, casi el 30 % de la sociedad en todo el mundo se vio afectada por anemia en los años 1993-2005. La prevalencia de anemia sigue siendo mucho mayor en niños pequeños y mujeres embarazadas [3]. La importancia de la suplementación de hierro en el embarazo está relacionada con el hecho de que la deficiencia de hierro es un factor de riesgo para parto prematuro, bajo peso al nacer de los neonatos y su peor condición general de salud [4]. En el caso de lactantes y niños pequeños en edad preescolar, el factor de riesgo de deficiencia de hierro es causado por el rápido crecimiento de todo el cuerpo y el consumo subsiguiente de las reservas de hierro; por tanto, la suplementación de hierro también se recomienda para niños entre 0 y 5 años [5]. Curiosamente, existen informes científicos que indican la correlación del nivel adecuado de hierro en niños y su desarrollo emocional y neuropsicológico [6]. Además, la deficiencia de hierro también es un grave trastorno nutricional entre otras especies de mamíferos, especialmente en lechones lactantes, donde el suministro intrauterino limitado de este elemento se combina con bajo contenido de hierro en la leche de la cerda [7,8]. Asimismo, el rápido crecimiento de los lechones agota rápidamente los restos de reservas de hierro, ya que en pocos días los lechones recién nacidos duplican su peso corporal, aumentando así el número de glóbulos rojos y el volumen sanguíneo general. Por tanto, hoy en día, una estrategia de suplementación de hierro más efectiva y segura para poblaciones humanas y animales se ha convertido en uno de los desafíos más importantes en la prevención y terapia de deficiencias nutricionales.

Existen tres formas principales de administración de hierro extra al organismo: intravenosa, intramuscular y oral. Cada una demuestra ventajas y desventajas. La administración oral parece simple y más natural para el cuerpo, involucrando vías fisiológicas de absorción y transporte de hierro. Además, este método preserva un sistema natural que controla la cantidad de hierro circulante en el cuerpo basado en la hepcidina [9]. Sin embargo, la vía oral de suplementación a menudo se ve plagada de mala absorción y baja eficiencia final. Estudios científicos también reportaron que la estrategia estándar de suplementación oral de hierro soluble afecta fuertemente la composición y actividad metabólica del microbioma intestinal animal [10]. Por otro lado, las vías intravenosa o intramuscular de administración de hierro al organismo se ven obstaculizadas por el riesgo de efectos secundarios tóxicos [11]. Adicionalmente, en la cría industrial de cerdos, el método estándar de suplementación de hierro basado en la administración individual intramuscular de una dosis única de hierro-dextrano es estresante para los animales y problemático para los criadores. Una inyección mal realizada puede causar inflamación y otras complicaciones en los animales, así como contribuir a la propagación de diversas enfermedades en la manada cuando no se observan condiciones de esterilidad.

Los efectos secundarios tóxicos mencionados de la administración exógena de hierro al organismo vivo están asociados con la presencia de hierro libre y no unido en el cuerpo, que como metal de transición (mediante cambio de valencia) puede llevar a la producción de radicales libres dañinos (especies reactivas de oxígeno - ROS) a través de la reacción de Fenton [12]. Informes científicos indicaron un riesgo de aumento de radicales libres en el organismo como factor que contribuye a diversas condiciones, incluyendo: infecciones bacterianas, neoplasias o enfermedades hepáticas [13]. La estrategia fisiológica natural de prevenir la generación de ROS por hierro libre se basa en unir el elemento hierro con proteínas particulares en cada paso de sus vías de absorción y transporte dentro del cuerpo. En caso de sobrecarga oral de hierro y su administración intravenosa/intramuscular, las vías fisiológicas de circulación del hierro generalmente se saturan, resultando en un rápido aumento de ROS [14].

Las nanopartículas basadas en hierro (Fe-NPs) han sido ampliamente estudiadas como una herramienta prometedora para fines biomédicos. El uso más extensivo de estas nanoestructuras está relacionado con sus propiedades magnéticas; por tanto, se han probado principalmente como agentes de contraste para técnicas de diagnóstico clínico dirigidas a imágenes de tumores o acumulación en tejidos particulares [15]. Recientemente, las nanoestructuras también se han estudiado como una forma novedosa y más efectiva de administración de sustancias bioactivas al organismo. Los vehículos NP pueden revelar una biodisponibilidad considerablemente aumentada para el organismo vivo, comparados con sustancias en forma masiva, lo que está mayormente relacionado con su menor tamaño [16,17]. En uno de los estudios, se comparó la efectividad de NPs que contenían hierro con sulfato ferroso (suplemento estándar para tratar anemia) en ratas anémicas. Basándose en análisis de sangre, los resultados mostraron una mayor biodisponibilidad de hierro tras una dosis oral única de NPs con hierro en animales anémicos. En caso de dosis múltiples de nanopartículas y sulfato ferroso, los resultados obtenidos fueron similares [18]. Otro estudio describió resultados obtenidos de nanomateriales basados en Fe como agentes alternativos de administración de hierro en humanos y un modelo de roedor. Los autores enfatizaron particularmente una seguridad superior del nanoFe comparado con formas solubles de hierro, lo que resultó en ausencia de acumulación de hierro en la mucosa intestinal y promoción de microbiota benéfica [19]. Resultados similarmente prometedores se obtuvieron en el estudio en ratas anémicas tratadas con NPs basadas en Fe recubiertas con vitamina C, que permitieron evitar la ruta estándar de absorción de Fe del tracto gastrointestinal. Los resultados indicaron la recuperación de los animales probados de la enfermedad anémica junto con la mejora de sus parámetros sanguíneos en corto tiempo, comparado con el método estándar de terapia de deficiencia de hierro [20].

Materiales y métodos

Síntesis de nanopartículas

Las nanopartículas de óxido de zinc dopadas con hierro (ZnO:Fe NPs) se sintetizaron mediante técnica hidrotérmica de microondas. El método está bien establecido, es relativamente económico, bioamigable y escalable industrialmente, capaz de introducir diferentes iones foráneos como dopantes funcionales [21,22,23,24,25] en una variedad de óxidos [26,27,28]. La concentración de hierro en las nanopartículas presentes se fijó al 5 % molar. La síntesis se realizó partiendo de nitratos(V): Zn(NO₃)₂·6H₂O (99 %, Sigma-Aldrich) y Fe(NO₃)₃·9H₂O (96 %, Carl Roth). Se probaron varios proveedores y se eligieron los que ofrecían el producto más uniforme sin niveles medibles de residuos no solubles. Los compuestos se disolvieron en agua destilada: 17,63 g de nitrato de zinc(V) y 1,25 g de nitrato de hierro(III)(V). La solución clara se alcalinizó usando solución de amoníaco acuoso al 25 % (Carl Roth) hasta pH 8. El residuo rojo resultante se lavó usando embudo Büchner, con ~1 L de agua destilada y se filtró al vacío. El precipitado se colocó en un recipiente de teflón de 100 ml, se llenó con agua al 80 % del volumen y se cerró en la cámara del reactor Ertec Magnum II. El proceso hidrotérmico de microondas se condujo a 4 MPa durante 20 min. Tras la reacción, el producto rojo pálido se recogió y secó overnight a 60 °C.

Caracterización de nanopartículas

La caracterización del producto se realizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopía de fotoluminiscencia (PL) y catodoluminiscencia (CL), y análisis elemental por dispersión de energía (EDX). Las mediciones SEM se realizaron con microscopio Hitachi SU-70 de alta resolución (1 nm), equipado con detector de radiación característica y sistema de catodoluminiscencia GATAN Mono CL3 en modos de electrón secundario (SE) y transmisión (TE). Los espectros de emisión y excitación de fotoluminiscencia se registraron usando espectrofluorímetro Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, equipado con lámpara de xenón como fuente de excitación y fotomultiplicador Hamamatsu R928P. La dispersión dinámica de luz (DLS) y el potencial zeta se midieron con sistema de caracterización de partículas DelsaMax Pro. El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó usando termogravímetro NETZSCH STA 449 F1 Jupiter bajo flujo de argón. Las mediciones SEM se realizaron tras depositar las nanopartículas en malla de cobre 400 recubierta de policarbonato Agar. La muestra se suspendió en agua destilada usando procesador ultrasónico Sonics VCX500, y luego una gota de la suspensión se colocó en la malla y se secó. La muestra se preparó tras 2 h de sedimentación de partículas más pesadas.

Modelo in vitro

Para el estudio actual, se utilizó la línea celular Caco-2 (células de adenocarcinoma de colon caucásico) como modelo de células epiteliales del tracto gastrointestinal. La línea celular se obtuvo de la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados - ECACC (Sigma-Aldrich, Cat. No. 86010202). Las células se sembraron a 0,5 × 10⁶ células/ml en placas de 6 o 96 pocillos y se mantuvieron en Medio de Modificación de Dulbecco de Eagle - DMEM (Gibco), suplementado con 10 % suero fetal bovino - FBS (Gibco), 1 % aminoácidos no esenciales - NEAA (Gibco), 1 % penicilina-estreptomicina-neomicina - PSN (Gibco), y 0,2 % bicarbonato de sodio (Gibco) a 37 °C y 5 % CO₂. Cuando se observó confluencia del 95-100 %, se retiró el medio de cultivo celular y se añadió suspensión de ZnO:Fe NPs en medio de crecimiento fresco. Las células se incubaron con cuatro concentraciones diferentes de ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; y 0,001 mg de ZnO:Fe NPs/ml) durante 24 h a 37 °C y 5 % CO₂.

Análisis de viabilidad celular

La viabilidad celular se evaluó para Caco-2 usando dos métodos: ensayo XTT y tinción con azul de tripano. Todos los reactivos requeridos para el ensayo XTT fueron provistos del kit comercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Tras la incubación de células cultivadas en placa de 96 pocillos con diferentes concentraciones de ZnO:Fe NPs, las células se incubaron con 50 µl de mezcla de marcado XTT durante 4 h a 37 °C y 5 % CO₂. Posteriormente, la concentración de formazán se evaluó con método espectrofotométrico. La absorbancia se midió a 470/650 nm y los resultados se correlacionaron con el número de células viables. En el experimento siguiente, el resultado de absorbancia más alto se asumió como el 100 % de viabilidad celular. Los resultados finales se calcularon basándose en cuatro réplicas de experimento separadas (n = 4).

Para realizar la tinción con azul de tripano, tras incubar las células cultivadas en placas de 6 pocillos con diferentes concentraciones de ZnO:Fe NPs, las células se recolectaron (0,05 % tripsina y 0,2 % EDTA durante 10 min), centrifugaron y el pellet se resuspendió en 1 ml de medio de crecimiento. Cien microlitros de solución estéril de azul de tripano al 0,4 % se mezclaron con 100 µl de suspensión celular. Diez microlitros de muestra se cargaron en el portaobjetos de conteo y se analizaron usando software JuLi Br Couting (NanoEnTek) para evaluar el número de células viables. Los resultados finales se calcularon basándose en tres réplicas de experimento separadas (n = 3).

Modelo animal

Para los propósitos de este estudio preliminar, ratones Balb-c adultos, machos (n = 6) se mantuvieron individualmente bajo condiciones de vida estándar y controladas (período luz-oscuridad 12/12 h, 25 °C, humedad 30 %) con comida y agua estándar (proporcionadas ad libitum). Todos los procedimientos fueron aceptados por el Comité Ético Local, acuerdo no. WAW2/59/2017. Tras 7 días de aclimatación, una suspensión de ZnO:Fe NPs en agua (10 mg/ml; 0,3 ml/ratón) se administró por gavaje oral (IG) a los animales del grupo experimental (n = 4). Los ratones del grupo control recibieron 0,3 ml de agua potable por IG (n = 2). Durante el experimento, no se observaron cambios de comportamiento en los animales probados ni anomalías tisulares. Tras 24 h, los ratones de ambos grupos experimental y control fueron sacrificados en cámara CO₂-O₂ (CO2 Box, Bioscape, Merazet) con recolección subsiguiente de tejidos. La mitad de las muestras recién recolectadas se congelaron a -20 °C para espectrometría de absorción atómica (AAS). La segunda mitad de los tejidos se fijó en formalina bufferizada al 4 % y se transfirió a etanol al 70 % (tras 24 h). Posteriormente, las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se incluyeron en parafina (Leica TP1020, Leica EG1150) y se prepararon láminas microscópicas de 6 µm (o 4 µm para exámenes histopatológicos) con microtomo (Leica RM2255).

Acumulación de hierro evaluada por tinción de Perl

Las láminas microscópicas de bazo, hígado y cerebro se tiñeron con el método de Perl (azul de Prusia) para la presencia de hierro. Las muestras se desparafinizaron y rehidrataron hasta agua destilada, luego se colocaron en una solución de trabajo con partes iguales de ferricianuro de potasio al 5 % (Sigma-Aldrich) y ácido clorhídrico al 5 % (Sigma-Aldrich) y se tiñeron durante 30 min. Posteriormente, las secciones se enjuagaron en agua y se contratiñaron con rojo nuclear-rápido (Sigma-Aldrich) durante 5 min, se enjuagaron en agua y se montaron bajo cubreobjetos con Permount (Fisher Scientific). Las imágenes de las muestras teñidas se tomaron usando microscopio Olympus BX60 y software de adquisición de imágenes Cell^P. De cada muestra probada, se seleccionaron 16 imágenes elegidas al azar para exámenes posteriores con MicroImage v.4.0 (Olympus) según protocolo de análisis de imágenes interno [29]. Para exámenes de bazo, solo se tuvo en cuenta la pulpa roja del tejido durante los análisis. El contenido de hierro se calculó como una relación del área e intensidad de manchas positivas para hierro (color azul) al área de núcleos celulares dentro de una imagen.

Concentración de hierro en tejidos probados medida con espectrometría de absorción atómica

Las muestras de tejido previamente recolectadas, almacenadas a -20 °C y posteriormente descongeladas, se prepararon para la evaluación cuantitativa adicional de la concentración de hierro con el método de espectrometría de absorción atómica (AAS), según el protocolo descrito en detalle antes [24]. Brevemente, los tejidos se pesaron y mantuvieron por > 16 h en solución que contenía 5 ml de ácido nítrico al 65 % y 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 % (Merck). Posteriormente, las muestras se mineralizaron en el sistema de microondas Ethos 900 (Milestone, EE. UU.) en solución líquida y se evaluaron con AAS (Perkin-Elmer) para contenido de hierro.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos en el estudio se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). Para la evaluación estadística de la acumulación de hierro obtenida con tinción de Perl, se realizó ANOVA unidireccional con prueba post hoc de comparaciones múltiples Tukey-Kramer para todos los grupos. Para evaluar una diferencia significativa entre grupos control y experimental de análisis AAS, se usó una prueba t no pareada. Las diferencias significativas entre grupos control y experimental en experimentos in vitro se evaluaron usando ANOVA unidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los análisis estadísticos se calcularon con GraphPad InStat 3.10. Para todas las pruebas, los resultados obtenidos se consideraron estadísticamente significativos con P ≤ 0,05 y P ≤ 0,01 y P ≤ 0,001 como altamente y extremadamente significativos.

Resultados

Caracterización de nanopartículas

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de nanocristales ZnO:Fe cristalizados en proceso hidrotérmico de microondas se muestran en la Fig. 1. El polvo seco almacenado tras la síntesis se dispersó en agua usando baño ultrasónico, y luego se depositó en malla de cobre 400. La suspensión resultante del tratamiento ultrasónico se dejó por 2 h para aglomeración y sedimentación de granos grandes. En la muestra se ven comúnmente cristales de ZnO con forma de prismas hexagonales alargados. Los cristales se alargan en la dirección de crecimiento de planos c - [001]. La intersección de prismas se ve claramente en la imagen: los hexágonos tienen 50-100 nm de tamaño. Básicamente, las nanopartículas están aglomeradas y forman estructuras mayores. En la Fig. 1b se muestra una estructura de cristales ZnO:Fe fuertemente aglomerados y agrupados. La muestra también está compuesta por granos no uniformes cuya distribución de tamaño contiene entre cientos de nanómetros y micrómetros. No hay indicación clara de existencia de fase separada distinta a ZnO, sugiriendo ausencia de cristalización de fase basada en hierro (p. ej. óxido de hierro) [30].

El análisis termogravimétrico (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) se realizaron bajo flujo de argón desde temperatura ambiente a 800 °C y los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 2. La primera pérdida de masa ocurrió hasta 200 °C y causó una disminución de la masa de la muestra en 4,78 % respecto a su masa inicial. La segunda pérdida se registró entre 200 y 400 °C y su valor es约 7,36 %. No hubo otras disminuciones de masa hasta 800 °C. La primera estuvo relacionada con la evaporación de moléculas de agua adsorbidas en superficie y la segunda probablemente causada por una reducción de grupos hidroxilo. La curva DSC muestra pico endotérmico a 118,3 °C (-0,6175 mW/mg, evaporación de agua) y pico exotérmico a 283,1 °C (0,4356 mW/mg, descomposición de grupos hidroxilo). El pequeño efecto relacionado con la descomposición indicó que ocurrió una cristalización casi completa de las nanopartículas ZnO:Fe en el proceso hidrotérmico de microondas.

La Fig. 3 muestra los espectros de fotoluminiscencia a temperatura ambiente de ZnO:Fe NPs. El espectro de emisión (Fig. 3a) consta de dos características: luminiscencia de borde de banda estrecha de baja intensidad (NBE) y luminiscencia de nivel profundo (DLE) muy intensa y ancha. La primera pica en ~380 nm mientras que la segunda en 600 nm. El dominio de la intensidad DLE en el espectro sugiere que los nanocristales obtenidos estaban fuertemente defectuosos a nivel cristalográfico [31,32,33]. El espectro de excitación (Fig. 3b) indica el mecanismo de emisión desde niveles profundos en la banda prohibida de ZnO:Fe.

El espectro de catodoluminiscencia de ZnO:Fe NPs se muestra en la Fig. 4; la relación de intensidad DLE/NBE es ≈ 25. La banda NBE pica en ca. 380 nm, la banda DLE contiene cuatro componentes que pican en ~570, 625, 653 nm y muy débil en 770 nm. Según McCluskey y Jokela [34], la banda de 570 nm está relacionada con vacancias de oxígeno, mientras que las otras se asignaron a vacancias de zinc en la red tipo wurtzita [35].

La cantidad de hierro en la muestra se determinó usando dos técnicas: espectroscopía de absorción atómica (AAS) y espectroscopía de rayos X por dispersión de energía (EDX). En el caso de AAS, la suspensión preparada similarmente a la usada en el experimento con roedores se analizó para indicar 3,98 % atómico de Fe en ZnO:Fe. Por el método EDX, el polvo seco se analizó en la malla de cobre para encontrar una concentración de hierro del 4,5 % at. en relación a los iones de zinc.

Las propiedades de la suspensión se midieron usando métodos DLS y TEM, con la distribución de diámetros de nanopartículas mostrada en la Fig. 5. La distribución es bimodal: para una población, el diámetro más frecuente pico entre 20 y 100 nm (TEM) y entre 50 y 200 nm (DLS). La segunda población contiene menor cantidad de objetos mayores 100-500 nm (TEM) y ca. 150-500 nm (DLS). El carácter bimodal de las nanopartículas se observa claramente por ambos métodos mostrados. La alta dispersión de tamaños en la población mayor indica que corresponde a nanopartículas aglomeradas. Las estadísticas mostradas para diámetros arriba de 100 nm indican muchas formas diferentes en que las nanopartículas ZnO:Fe se aglomeran. Las nanopartículas en suspensión acuosa estaban cargadas negativamente como reveló el potencial zeta por debajo de 0 V. El valor de aproximadamente -40 mV también indicó que la suspensión acuosa final era estable y las nanopartículas no tenían afinidad por la aglomeración.

Evaluación toxicológica in vitro de nanopartículas ZnO:Fe

Ambos análisis de viabilidad celular (XTT y Azul de Tripano) revelaron una disminución de la absorbancia de células Caco-2 incubadas con ZnO:Fe NPs, que se correlacionó directamente con el número de células viables. Cambios estadísticamente significativos se observaron solo tras 24 h de exposición de células incubadas a las concentraciones más altas de NPs (1,0 y 0,1 mg/ml), mientras que niveles fisiológicos de concentración de NPs (0,01 y 0,001 mg/ml) no tuvieron efecto significativo en los cultivos celulares (Figs. 6 y 7).

Distribución de hierro en modelo animal

Para evaluar la accesibilidad in vivo de hierro desde ZnO:Fe NPs, ratones (n = 4) recibieron oralmente suspensión de ZnO:Fe NPs y, tras 24 h, los animales fueron sacrificados con recolección subsiguiente de tejidos cruciales. La evaluación cuantitativa del contenido de hierro dentro de los tejidos examinados se analizó con método AAS para todos los órganos recolectados y se calculó con software Micro Image (basado en tinción de Perl) para tejidos de hígado, bazo y cerebro. Presentados en la Fig. 8, los datos muestran un nivel aumentado de contenido de hierro (vs. control) en corazón, músculo esquelético, bazo e intestino delgado 24 h tras la administración oral de ZnO:Fe NPs (sin aumento estadísticamente significativo). En el caso de hueso, el nivel medio de hierro dentro del grupo experimental fue solo ligeramente superior al resultado del control. El contenido de hierro en tejidos de hígado y cerebro aumentó significativamente (P ≤ 0,01) 24 h tras la IG de ZnO:Fe NPs, vs. grupo control (Fig. 8). En los riñones, tejidos adiposos viscerales y subcutáneos, y pulmones, los niveles de Fe disminuyeron 24 h tras la administración de ZnO:Fe NPs.

La evaluación del contenido de hierro teñido con el método de Perl dentro del hígado reveló un nivel extremadamente significativo (P ≤ 0,001) aumentado de Fe en todos los animales experimentales vs. control (Fig. 9b). Similarmente, los resultados obtenidos para la pulpa roja del tejido del bazo mostraron un aumento extremadamente significativo (P ≤ 0,001) del contenido de hierro en todos los animales experimentales vs. control (Fig. 10b). Los datos obtenidos del análisis de tejido cerebral indicaron ausencia de aumento de Fe en el grupo experimental 24 h tras la IG de ZnO:Fe NPs (Fig. 11b).

En el caso del contenido de hierro de cada animal de los grupos experimental y control, los resultados se recopilaron en las Figs. 9a, 10a y 11a. El nivel más alto y significativamente diferente (P ≤ 0,05 y P ≤ 0,01) de hierro dentro del tejido hepático se detectó para el ratón - 2 (24 h 2), comparado con resultados del grupo control (Fig. 9a). Los niveles de manchas de hierro en pulpas rojas del bazo dentro del grupo experimental fueron similares; sin embargo, la mayoría fueron estadísticamente más altos (P ≤ 0,05 o P ≤ 0,01) que el ratón - 1 (CTRL 1) del grupo control (Fig. 10a). Los resultados obtenidos para tejido cerebral fueron similares entre cada animal de los grupos experimental y control (Fig. 11a).

Las secciones de tejidos de hígado y bazo teñidas con el método de Perl también se evaluaron cualitativamente. Se observó un número aumentado de depósitos de hierro (manchas azul claro) dentro de hepatocitos de secciones hepáticas del grupo experimental (Fig. 12).

Una acumulación general mayor de hierro (manchas azules) dentro de la pulpa roja que en la pulpa blanca del bazo se observó en ambos grupos control y experimental (Fig. 13). Tras la aplicación de ZnO:Fe NPs, el nivel más alto de hierro fue particularmente visible dentro de la pulpa roja, comparado con imágenes del grupo control (Fig. 13c, d). En el grupo experimental, una concentración aumentada de hierro también fue notable alrededor de vasos sanguíneos (Fig. 13b, d).

Discusión

Como se mencionó en la sección "Introducción", la deficiencia de hierro es un trastorno nutricional considerable en la población humana, así como en otras especies de mamíferos [3,7,8]. Consecuentemente, la implementación de una nueva estrategia de suplementación de hierro más eficiente y segura parece altamente deseable. Los resultados presentados actualmente provienen de estudios preliminares dirigidos a investigaciones futuras detalladas relacionadas con el uso potencial de NPs biodegradables de ZnO dopadas con Fe como una nueva estrategia para la suplementación de hierro. Como se confirmó previamente, las NPs basadas en zinc fabricadas internamente sufren una absorción muy eficiente tras su administración oral con distribución rápida adicional a órganos y tejidos principales en el organismo vivo [22,23,24]. Además, reportamos que estas nanoestructuras demostraron bioseguridad y biodegradabilidad dentro del cuerpo junto con una rápida eliminación del organismo [36]. Empleada en el estudio actual, la vía oral de administración de NPs proporciona una forma altamente eficiente de entrega rápida de nanoestructuras exógenas al cuerpo, basada en el proceso de persorción [37,38]. Además, esta estrategia disminuye la posibilidad de eventuales efectos tóxicos relacionados con la administración de sustancias dopadas con hierro, debido a la existencia de "mecanismos de seguridad" fisiológicos relacionados con la absorción de Zn y Fe desde el tracto gastrointestinal. Estas cruciales vías fisiológicas de distribución de hierro pueden evitarse en caso de aplicación intravenosa/intramuscular de sustancias dopadas con hierro [14], lo que puede resultar en mayor posibilidad de ocurrencia de efectos secundarios tóxicos relacionados con hierro. El examen de las vías de internalización de las nanopartículas, su dinámica y sistemas celulares involucrados en el proceso se está estudiando actualmente en el marco de otra publicación. En el artículo actual, decidimos mostrar el efecto general de nuestras nanopartículas en el organismo vivo, enfocándonos en el efecto del hierro.

La toxicidad de las nanoestructuras puede estar relacionada con diversas características del material, no solo con la composición química, sino también con p. ej. tamaño, forma o su capacidad de agregación [39]. Sin embargo, se confirmó que NPs más pequeñas se absorben mejor que las mayores y la alta relación superficie-volumen hace que partículas de algunos metales sean excepcionalmente reactivas y citotóxicas [40,41]. Las nanoestructuras podían entrar en células y afectar sus componentes, lo que alteraba la viabilidad celular [42,43]. En una de las investigaciones previas sobre citotoxicidad de NPs de ZnO o FeO, los autores no observaron efectos tóxicos (basados en la capacidad de las células examinadas para crecer y dividirse), incluso en altas dosis de NPs [44]. Presentado aquí es un estudio realizado en línea celular Caco-2, como modelo de células epiteliales del tracto gastrointestinal, revelando una baja toxicidad de los nanomateriales usados. ZnO:Fe NPs en dosis pequeñas/fisiológicas (0,001 mg/ml y 0,001 mg/ml) no alteraron la viabilidad celular (Figs. 6 y 7). Tras la incubación de células Caco-2 con altas dosis de ZnO:Fe NPs, se observó una disminución estadísticamente significativa de la viabilidad. Sin embargo, la IC50 (concentración inhibitoria media máxima), como medida de la efectividad de una sustancia en inhibir una función biológica o bioquímica específica, permaneció sorprendentemente alta - alrededor de 1 mg/ml (Figs. 6 y 7). La caída observada de la viabilidad celular probablemente se asoció con la deposición física de nanopartículas en la superficie y sobreestrés de las células más que con efecto citotóxico relacionado con las nanopartículas en sí. En otro estudio, los autores concluyeron una disminución de IC50 de células de línea cancerígena tras incubación con NPs de ZnO y ZnO:Fe₃O₄ y efecto citotóxico relativamente bajo (y no dependiente de la dosis) de NPs examinadas en células no cancerígenas [45]. Observaciones similares también se reportaron para NPs de ZnO y platino [46,47]. No obstante, exámenes adicionales sobre el perfil de toxicidad crónica de tales compuestos incluyendo perfil de actividad antioxidante, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), y usando otras células y líneas celulares deben realizarse.

Los resultados obtenidos en el experimento in vivo indicaron una rápida distribución de ZnO:Fe NPs a tejidos mayormente relacionados con la homeostasis del hierro (Figs. 8, 9 y 10). Estudios similares, concernientes a la biodisponibilidad de hierro desde forma "nano", se realizaron mayormente en animales anémicos o examinados tras período de depleción de hierro [18,19,48], donde nuestros estudios preliminares se realizaron en ratones sanos, mantenidos normalmente. La comparación de datos presentados en el trabajo actual con estudios similares puede ser engañosa debido a diferencias en NPs empleadas p. ej. su tamaño, forma y compuesto o ruta, dosis y frecuencia de su administración a animales. Los resultados de nivel de hierro en el hígado mostraron un nivel significativamente aumentado a 24 h tras la aplicación de ZnO:Fe NPs, comparado con control (Figs. 8 y 9). La acumulación de hierro fue visible en hepatocitos de tejido hepático (Fig. 12), donde ocurre el principal sitio de almacenamiento del elemento [49]. Similarmente, estudios previos con NPs magnéticas de óxido de hierro inyectadas intraperitonealmente a ratas también resultaron en 55 % de acumulación de estos nanomateriales en el hígado a 6 h tras la inyección [50]. Asimismo, el nivel de hierro en el bazo en el estudio actual fue claramente mayor en el grupo experimental que en el control (Figs. 8 y 10). Curiosamente, se detectó tendencia de acumulación de hierro alrededor de vasos sanguíneos dentro del bazo, lo que podría indicar la transferencia de ZnO:Fe NPs desde el torrente sanguíneo general al tejido (Fig. 13b, d). La acumulación primaria de nanoestructuras dentro del hígado y bazo tras su aplicación también podría atribuirse a la depuración vía fagocitos mononucleares en estos tejidos, como también se postuló previamente [50,51,52].

En el caso de tejido cerebral, la medición del nivel total de hierro (método AAS) mostró un nivel significativamente mayor del elemento en animales con ZnO:Fe NPs administrados previamente (Fig. 8), lo que no fue confirmado por análisis basado en tinción de Perl (Fig. 11). La inconsistencia entre ambos métodos empleados en el estudio puede estar relacionada con la sensibilidad de la tinción de Perl. Este método histológico de visualización de hierro está dedicado a detectar agregados de hierro. El hierro contenido en forma "nano", adicionalmente distribuido dentro del tejido sin depósitos fisiológicos de estos elementos, podría no ser lo suficientemente sensible para teñir estos depósitos extremadamente pequeños de hierro. La posibilidad de superar la barrera hematoencefálica con nanoestructuras fabricadas por nosotros ya fue descrita [23,24,53]. En otro estudio, con NPs superparamagnéticas de óxido de hierro maghemita administradas intraperitonealmente a ratones, no se detectó acumulación de hierro en el grupo experimental, ni en cerebro ni en tejidos cardíacos, lo que es inconsistente con nuestros resultados [52]. Otro estudio, enfocado en un patrón de distribución de NPs magnéticas de óxido de hierro dentro del organismo vivo, indicó un mecanismo de circulación similar de nanoestructuras como en nuestro estudio - nivel aumentado de Fe dentro del cerebro y corazón tras administración de NPs [51]. El nivel aumentado de hierro en tejido cardíaco puede ser causado por la presencia de ZnO:Fe NPs en el torrente sanguíneo general y consecuentemente su mayor nivel dentro del tejido. Del mismo modo, el nivel mayor de hierro dentro de un músculo esquelético detectado en análisis AAS probablemente está relacionado con la intensa circulación sanguínea dentro de este músculo y en el caso de intestino delgado, el contenido mejorado de hierro es causado por residuos de NPs administrados oralmente.

Conclusiones

En conclusión, realizamos el estudio preliminar sobre la distribución de NPs biodegradables ZnO:Fe como una perspectiva, nueva estrategia de suplementación en deficiencia de hierro. La deposición de hierro en el cuerpo de ratones tras la administración oral de las nanoestructuras fue detectada dentro de los tejidos cruciales, donde ocurre el principal sitio de almacenamiento del elemento. Asumimos que los resultados obtenidos en el estudio podrían indicar las NPs biodegradables ZnO:Fe como buenos vehículos de hierro exógeno en el organismo vivo. Sin embargo, se necesita más investigación para comprender completamente los mecanismos exactos de la deposición, eliminación e influencia de ZnO:Fe NPs en el cuerpo.

Disponibilidad de datos y materiales

Las conclusiones del siguiente estudio se basan en los datos presentados en este manuscrito.

Abreviaturas

NPs:

Nanopartículas (Nanoparticles)

ZnO:Fe NPs:

Nanopartículas de óxido de zinc dopadas con hierro (Zinc oxide nanoparticles doped with iron)

IG:

Intragástrica (Intra-gastric)

ROS:

Especies reactivas de oxígeno (Reactive oxygen species)

SEM:

Microscopía electrónica de barrido (Scanning electron microscopy)

PL:

Espectroscopía de fotoluminiscencia (Photoluminescence spectroscopy)

CL:

Espectroscopía de catodoluminiscencia (Cathodoluminescence spectroscopy)

DLS:

Dispersión dinámica de luz (Dynamic light scattering)

Caco-2 cells:

Células de adenocarcinoma de colon caucásico (Caucasian colon adenocarcinoma cells)

DMEM:

Modificación de Dulbecco del medio de Eagle (Dulbecco's modification of Eagle's medium)

FBS:

Suero fetal bovino (Fetal bovine serum)

NEAA:

Aminoácidos no esenciales (Non-essential amino acids)

PSN:

Penicilina-estreptomicina-neomicina (Penicillin-streptomycin-neomycin)

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic acid)

AAS:

Espectrometría de absorción atómica (Atomic absorption spectrometry)

SEM (en análisis estadístico):

Error estándar de la media (Standard error of the mean)