Artesunato entregado por nanopartículas mejora la eficacia antitumoral mediante activación de apoptosis mitocondrial

Resumen

Se consideró que la artemisinina y sus derivados ejercen un amplio espectro de actividades anticancerígenas, induciendo efectos significativos en células tumorales. La artemisinina y sus derivados se absorben rápidamente y se distribuyen ampliamente, matando selectivamente células tumorales. Dado que bajas concentraciones de artesunato dependen principalmente de la oncosis para inducir muerte celular en células tumorales, sus efectos antitumorales eran indeseables y limitados. Para obtener mejores efectos antitumorales, en este estudio aprovechamos una nueva nanotecnología para diseñar nanopartículas novedosas de albumina sérica bovina (BSA) cargadas con artesunato para lograr la acumulación mitocondrial de artesunato e inducir apoptosis mediada por mitocondrias. Los resultados mostraron que, en comparación con la dependencia del artesunato libre en la muerte oncótica, las nanopartículas de BSA cargadas con artesunato mostraron mayor citotoxicidad y sus efectos apoptóticos significativos se indujeron a través de la distribución de artesunato en las mitocondrias. Este hallazgo indicó que las nanopartículas de BSA cargadas con artesunato dañaron la integridad mitocondrial y activaron la apoptosis celular mediada por mitocondrias al regular al alza proteínas relacionadas con la apoptosis y facilitar la liberación rápida de citocromo C.

Introducción

La artemisinina y sus derivados se han usado ampliamente en el tratamiento de la malaria debido a su alta actividad antimalárica y baja toxicidad. Investigadores también encontraron que la artemisinina y sus derivados demostraron actividad antitumoral significativa debido a sus pocos efectos secundarios tóxicos y mayor tolerancia por los pacientes. Se informó que el artesunato (Ats) definitivamente inhibió el crecimiento de células tumorales e indujo efectos anticancerígenos significativos. Algunos experimentos indicaron que Ats causó diferentes grados de apoptosis y oncosis en células tumorales después de 48 h, y que los grados de apoptosis y oncosis dependían de la dosis de Ats. A bajas concentraciones, Ats no indujo apoptosis obvia en células tumorales y la muerte celular inducida por Ats estuvo acompañada de muerte tipo oncosis. Para obtener mayores efectos antitumorales, se aplicó una dosis más alta de Ats, pero esto confirmó su toxicidad seria y supresión de médula ósea. Por tanto, es necesario encontrar un tratamiento efectivo para reducir la dosis efectiva de Ats y mejorar su eficiencia antitumoral. Se encontró que las mitocondrias jugaban un papel importante en regular los efectos apoptóticos y oncóticos de Ats. Las mitocondrias también estaban involucradas en regular el proceso de transducción de una amplia variedad de señales apoptóticas. Cuando las mitocondrias eran atacadas por fármacos, su permeabilidad aumentaba y el potencial de membrana disminuía, llevando a hinchazón endotelial de la membrana mitocondrial y la liberación rápida de citocromo C de las mitocondrias al citoplasma. Además, algunas proteínas de la familia caspasa se activaban, induciendo la reacción en cascada de apoptosis celular.

Para mejorar los efectos antitumorales de Ats, se intentaron muchas técnicas nuevas para aumentar la distribución del fármaco en células tumorales o mejorar la entrega dirigida de fármacos a orgánulos celulares para inducir muerte celular. Las nanopartículas (NPs) como herramienta clave en el tratamiento dirigido del cáncer han sido ampliamente investigadas y han mostrado potencial prometedor. Como las NPs presentan un tamaño de partícula menor y alta área superficial, pueden entrar en la circulación sanguínea a través de capilares y pasar a través del espacio entre células endoteliales y migrar al sitio tumoral, logrando una distribución dirigida del fármaco y mejorando la biodisponibilidad. Además, las NPs pueden controlar la liberación del fármaco a través de la degradación del biomaterial en un patrón largo y suave, prolongando la vida media de eliminación, mejorando la concentración sanguínea efectiva y reduciendo la frecuencia de dosificación. Lo más importante, las NPs cargadas con fármacos pueden entregarse a ubicaciones específicas dentro de las células, mejorando la eficacia del tratamiento.

Para mejorar los efectos antitumorales de Ats a bajas concentraciones, intentamos diseñar nuevas NPs de BSA cargadas con Ats. Debido al pH bajo en células tumorales, la acumulación de gran número de protones de hidrógeno presentes en la membrana mitocondrial externa o en el espacio intermembrana, opuestamente, la membrana mitocondrial interna es rica en carga negativa debido a su composición química y secreción de matriz mitocondrial, lo que crea un potencial transmembrana electropositivo fuera y negativo dentro que puede favorecer la entrega de BSA. Luego, la acumulación masiva de Ats en mitocondrias podría desencadenar efectivamente apoptosis mediada por mitocondrias. Los resultados mostraron que, en comparación con la típica muerte oncótica inducida por Ats libre, Ats fue transferido específicamente a las mitocondrias con la mediación de NPs de BSA y promovió la activación mediada por mitocondrias de proteínas caspasa relacionadas con la apoptosis. Esto encendió apoptosis celular significativa, destacando la mayor citotoxicidad.

Métodos

Materiales

BSA se compró de Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA), y Ats de Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, China). Células SMMC-7721 y Plc se compraron del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Todos los demás químicos comprados eran de grado analítico, obtenidos de diversos proveedores.

Preparación y caracterización de NPs de BSA cargadas con Ats

Según literatura reportada previamente, las NPs de BSA cargadas con Ats se prepararon mediante un método de desolvatación. Brevemente, se prepararon añadiendo rápidamente 1.0 mL de alcohol anhidro conteniendo cierta cantidad de Ats en 0.5 mL de solución de BSA a 37 °C hasta opalescencia. Con la remoción de etanol por evaporación rotatoria, las NPs de BSA cargadas con Ats se precipitaron del medio, y luego se añadió glutaraldehído al 8 % en agua (0.5 μL/mg de BSA) para inducir reticulación de partículas bajo agitación de la suspensión durante 24 h. Finalmente, las NPs se recogieron y lavaron tres veces con agua desionizada para analizar sus caracterizaciones físicas, incluyendo diámetro hidrodinámico, índice de polidispersidad (PDI), potencial zeta y morfología usando un Zetasizer Brookhaven (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) y un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japón). La determinación de la eficiencia de encapsulación de Ats en NPs de BSA se estimó usando un método reportado previamente.

Ensayo MTT

Dos líneas de células tumorales, SMMC-7721 y Plc, se incubaron por separado con 20 % suero fetal bovino (FBS). La densidad de crecimiento celular se ajustó a 1 × 10⁶ células/mL por conteo celular, y luego las suspensiones celulares se diluyeron a 1 × 10⁵ células/mL. Las suspensiones diluidas se añadieron por separado en una placa de 96 pozos (100 μL por pozo, aproximadamente 1 × 10⁴ células/pozo) para incubación continua por 24 h a 37 °C bajo 5 % CO₂ y 95 % O₂. El medio se reemplazó por medio libre de suero en presencia de Ats libre o NPs de BSA cargadas con Ats con diferentes concentraciones de Ats, e incubado subsecuentemente por 24 h. Un total de 50 μL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) (5 mg/mL) se añadió a cada pozo e incubó por 4 h para terminación del cultivo. Cuando el tinte tetrazolio MTT se redujo a su forma insoluble formazan, las placas de 96 pozos se centrifugaron a 1000 rpm por 5 min, y el sobrenadante se decantó de cada pozo, seguido de la adición de 150 μL de dimetil sulfóxido (DMSO), que disolvió completamente los cristales. La absorbancia de la solución se midió usando un lector de microplacas (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) a 490 nm.

Distribución intracelular del grupo de NPs de BSA en células

Células SMMC-7721 y Plc en fase logarítmica se seleccionaron y trataron con digestión de tripsina; la concentración celular se ajustó a 1 × 10⁶ células/mL. Luego, las células cultivadas se añadieron en una placa de cultivo de 6 pozos para adherencia, y el medio de cultivo se removió seguido de la adición de NPs de BSA marcadas con rodamina B. El núcleo se tiñó con Hoechst (azul) por 15 min a 37 °C, y las mitocondrias se tiñeron con Mitotracker Green FM. La ubicación de NPs de BSA en células se rastreó dentro de las células usando microscopía confocal de barrido láser (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japón).

Cambio del potencial de membrana mitocondrial

JC-1 puede usarse para determinar cambios en el potencial de membrana mitocondrial. Cuando el potencial de membrana mitocondrial era alto, JC-1 podía pasar libremente a través de la membrana celular y formar agregados dentro de las mitocondrias, exhibiendo fluorescencia roja (longitud de onda de excitación, 525 nm; longitud de onda de emisión, 590 nm); cuando el potencial de membrana mitocondrial disminuía, JC-1 se transfería de la matriz mitocondrial al citoplasma celular para formar un monómero fluorescente verde (longitud de onda de excitación, 490 nm; longitud de onda de emisión, 530 nm). Células SMMC-7721 y Plc se sembraron por separado en platos confocales para alcanzar una densidad de 1 × 10⁶ células/mL para incubación continua por 12 h. Luego, el medio de cultivo se descartó y medio libre de suero conteniendo la dispersión de Ats o NPs de BSA cargadas con Ats se añadió al plato. Después de 9 h, el medio se descartó y las células se lavaron dos veces con PBS, seguido de la adición de 2 mL de JC-1 a concentración de 2 μmol/L; las células se incubaron luego por 30 min a 37 °C en condiciones oscuras. Un microscopio confocal de barrido láser (FluoView FV10i; Olympus Corporation) se usó para observar los cambios de imagen en la membrana mitocondrial.

Medición de producción de ROS y tinción del retículo endoplásmico (RE)

Las células se incubaron con 20 % FBS y la densidad de crecimiento celular se ajustó a 1 × 10⁶ células/mL por conteo celular; luego las suspensiones celulares se diluyeron a 1 × 10⁵ células/mL. Las suspensiones diluidas se añadieron en placas de 96 pozos (100 μL por pozo, aproximadamente 1 × 10⁴ células/pozo) para incubación continua por 24 h a 37 °C bajo 5 % CO₂ y 95 % O₂. En segundo lugar, Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats se incubaron con las células por 6, 12 y 24 h, seguido de incubación continua con 10 μM de 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) por unos 30 min. Tampón PBS en hielo se usó para lavar las células tres veces para remover NPs no internalizadas. La intensidad de fluorescencia DCF intracelular, excitada a 485 nm y emitida a 530 nm, se detectó usando un lector de microplacas (Synergy-2; BioTek Instruments) para investigar el grado de estrés oxidativo. Los grupos de prueba se trataron con células SMMC-7721 y Plc por 24 h, y la sonda ER-Tracker Blue–White DPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) se añadió a las células para incubación por 30 min. Después de descartar la solución de carga y lavar las células con PBS, el cambio de morfología del RE se observó por microscopía confocal de barrido láser.

Evaluación de oncosis y apoptosis celular por citometría de flujo

Según el protocolo de nuestro estudio previo, se usó un ensayo de tinción Annexin V–fluoresceína isotiocianato (FITC)/yoduro de propidio (PI) para evaluar la oncosis y apoptosis inducidas por Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats. Las células se lisaron con tripsina y se sembraron en placas de seis pozos a concentración de 1 × 10⁶ células/mL por 24 h de incubación continua. Luego, el medio de cultivo se removió y medio libre de suero conteniendo Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats se añadió a los pozos. Después del tratamiento, las células se recogieron y suspendieron en buffer Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, China) conteniendo PI y Annexin V marcado con FITC (AV-FITC). El cambio morfológico de las células se observó por microscopía confocal de barrido láser. Para verificar las tasas de apoptosis y oncosis inducidas por NPs cargadas con Ats, los porcentajes de células apoptóticas tempranas (Q4), oncóticas (Q2), necróticas (Q1) y vivas (Q3) se cuantificaron por citometría de flujo.

Análisis Western Blot de proteínas relacionadas con apoptosis y citocromo C en células

Se realizó un ensayo Western blot para determinar los niveles de proteínas relativas cuando Ats libre o NPs cargadas con Ats se incubaron con células SMMC-7721 por 24 h. Las células se lisaron con buffer de inmunoprecipitación por radioinmunoensayo (RIPA) en frío conteniendo cóctel de inhibidores de proteasas e inhibidores de fosfatasas (Roche, Basel, Suiza). Las concentraciones de proteínas se determinaron usando un kit de ensayo BSA modificado (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y normalizaron antes de cargar en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10 % (PAGE). Los niveles de proteínas objetivo se fotografiaron y analizaron usando un sistema de análisis de gel UVP (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, USA).

Resultados

Características de NPs de BSA cargadas con Ats y estudio de viabilidad celular

Se observó en Fig. 1a, b que las NPs de BSA cargadas con Ats mostraron forma esférica, y estaban dispersas homogéneamente con un PDI bajo de 0.016. El tamaño de partícula promedio de NPs de BSA cargadas con Ats fue de aproximadamente 99.9 ± 2.3 nm y el potencial zeta fue negativo y valorado en alrededor de –25.6 ± 4.3 mV. El perfil de liberación mostró una liberación suave y sostenida como se muestra en Fig. 1c. Comparado con la liberación rápida de Ats libre en medio in vitro, Ats atrapado en el núcleo de NPs de BSA se difundió lentamente desde el interior de NPs al medio y mostró un patrón de liberación suave y sostenido, debido a la degradación continua de BSA. Más del 85 % de Ats libre se liberó completamente dentro de las primeras 6 h, mientras que la cantidad total acumulativa de fármaco liberado de NPs al medio en un período de 48 h fue 78.9 %. Esto indicó que las NPs podían controlar la liberación del fármaco vía degradación de biomateriales en un patrón largo y suave, prolongando la vida media de eliminación, mejorando la concentración sanguínea efectiva y reduciendo la frecuencia de dosificación.

MTT se usó para examinar los efectos inhibidores de Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats en células SMMC-7721 y Plc a diferentes intervalos de tiempo. Los resultados (Fig. 1d, e) mostraron que la citotoxicidad de Ats libre aumentó con el aumento de la concentración del fármaco, y NPs de BSA cargadas con Ats mostraron citotoxicidad gradualmente mejorada. Esto probó que Ats y NPs de BSA cargadas con Ats inhibieron el crecimiento de células tumorales y que la ratio de inhibición dependía de la dosis de Ats. Comparado con Ats libre, NPs de BSA cargadas con Ats demostraron mayor citotoxicidad y mayor sensibilidad en ambas células, resultando en mayor inhibición celular. Como se muestra en Fig. 1d, e, el tratamiento de ambas células con NPs de BSA cargadas con Ats causó una disminución significativa en la viabilidad celular a 24 h comparado con Ats libre. Los valores de concentración inhibitoria máxima 50 % (IC50) para células SMMC-7721 y Plc tratadas con NPs de BSA cargadas con Ats fueron 50.1 y 44.9 μg/mL a 24 h, respectivamente, comparado con valores de 69.2 y 74.9 μg/mL a 24 h en células tratadas con Ats libre. Esto indicó que cuando Ats se cargaba en NPs de BSA, podría cambiar su ubicación intracelular, mediada por NPs, y finalmente matar más células.

Captación celular in vitro de NPs de BSA

La distribución y ubicación intracelular de NPs de BSA en ambos tipos de células tumorales se observaron por microscopía confocal de barrido láser, como se muestra en Fig. 2. Después de que NPs marcadas con rodamina B se co-cultivaron con células por 3 h, fluorescencia roja se vio claramente en el citoplasma; con el paso del tiempo, la mayoría de NPs de BSA se internalizaron intracelularmente y se difundieron en el citoplasma, mostrando fluorescencia roja mejorada dependiente del tiempo. También se observó que NPs de BSA ubicadas en el citoplasma se co-localizaron con las mitocondrias, evidenciado por la aparición de fluorescencia amarilla, que sirvió para indicar que la fluorescencia roja inherente de NPs marcadas con rodamina B y la fluorescencia verde emitida por el indicador mitocondrial MitoTracker® green FM se habían fusionado. Esto probó que NPs de BSA internalizadas podían acumularse específicamente dentro de las mitocondrias, destacando la posibilidad de que Ats pudiera entregarse a las mitocondrias con la mediación de NPs de BSA.

Análisis del potencial de membrana mitocondrial

Para clarificar si NPs de BSA cargadas con Ats interferían con la función mitocondrial tras la entrega de Ats en las mitocondrias, se determinaron cambios en el potencial de membrana mitocondrial. La Fig. 3 demostró que después de tinción con JC-1, la mayoría de mitocondrias en células tumorales tratadas con Ats libre exhibieron fluorescencia roja fuerte y débil intensidad de fluorescencia verde. Esto sugirió que la mayoría de JC-1 existía en estado agregado, reforzando la integridad de la membrana mitocondrial y un potencial más alto. Por el contrario, cuando JC-1 tiñó células tratadas con NPs de BSA cargadas con Ats, las mitocondrias en ambas células tumorales exhibieron fluorescencia verde más fuerte, indicando que la membrana mitocondrial estaba seriamente dañada y su potencial disminuyó significativamente. En conjunto, probó que Ats fue entregado exitosamente a las mitocondrias con la mediación de NPs de BSA, resultando en despolarización de la membrana mitocondrial.

Medición de producción de ROS y tinción del RE

Se confirmó ampliamente que la generación de gran número de ROS puede causar peroxidación de fosfolípidos en la membrana mitocondrial interna y también inducir disminución del potencial de membrana mitocondrial, resultando en liberación rápida de citocromo C. Usamos DCFH-DA como sonda fluorescente para detectar el cambio de ROS. DCFH-DA pasó libremente a través de la membrana celular y se transformó en DCFH por hidrólisis de esterasa. El DCFH generado no puede pasar a través de la membrana celular, y puede cargarse fácilmente en las células. ROS intracelulares oxidaron DCFH no fluorescente a DCF con color fluorescente verde. Por tanto, la detección de fluorescencia DCF puede indicar el nivel de ROS intracelular.

Cuando ambas células se trataron con Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats por cierto período, la cantidad de ROS intracelular también aumentó, mostrando una relación dependiente del tiempo. Comparado con Ats libre, la generación de ROS en células SMMC-7721 y Plc tratadas con NPs de BSA cargadas con Ats fue significativamente mejorada. La Fig. 4a demostró que los niveles de ROS en células SMMC-7721 y Plc expuestas a NPs de BSA cargadas con Ats por 48 h aumentaron 1.53 y 1.28 veces, respectivamente, comparado con células tratadas con Ats libre. Esto apoyó la idea de que NPs aceleraron la producción de ROS intracelulares. Comparado con grupo control y Ats libre, y después de tratamiento con NPs de BSA cargadas con Ats, la intensidad de fluorescencia de tinción desde ER-Tracker Blue–White DPX como tinte específico de RE aumentó significativamente, sugiriendo que estrés de RE también se desencadenó en células tratadas con NPs cargadas con Ats con un aumento correspondiente en nivel de ROS. Este hallazgo destacó que Ats se ubicó específicamente en mitocondrias, mediado por NPs de BSA; esto llevó a aumento significativo en nivel de radicales libres de oxígeno dentro de células, desencadenando inducción de estrés de RE y activando la vía mitocondrial para inducir apoptosis celular dependiente de caspasa.

Evaluación de apoptosis y necrosis celular

Las células se trataron mediante ensayo de tinción Annexin V-FITC/PI. Células vivas no se unieron a Annexin V-FITC/PI, así que no apareció fluorescencia. Células apoptóticas no se unieron a PI, pero se tiñeron con Annexin V-FITC, produciendo fluorescencia verde. Por el contrario, para células oncóticas, sus membranas celulares estaban dañadas en cierta medida, y los núcleos celulares se dilataron para romperse en pedazos, mostrando fluorescencia verde y roja. Como se muestra en Fig. 5a, comparado con grupo control, cuando Ats libre y NPs cargadas con Ats se incubaron con células por 24 h, fluorescencia verde y roja fuerte se observó en células, indicando que Ats libre y NPs de BSA cargadas con Ats indujeron oncosis y apoptosis de células tumorales. Especialmente después de tratamiento con NPs de BSA cargadas con Ats, las intensidades de fluorescencia obtenidas de Annexin V-FITC y PI aumentaron significativamente, sugiriendo que los grados de oncosis y apoptosis se mejoraron significativamente en células tratadas con NPs cargadas con Ats.

Los porcentajes de apoptosis temprana (Q4), oncosis (Q2), necrosis (Q1) y células vivas (Q3) se muestran en Fig. 5b. Este hallazgo demostró que cuando células se trataron con Ats libre, las tasas oncóticas aumentaron gradualmente a 24.4 y 4.6 %, y la tasa apoptótica permaneció en 4.9 y 7.1 % en células SMMC-7721 y Plc, respectivamente, sugiriendo que Ats libre desencadenó oncosis y apoptosis para llevar a muerte celular. Por el contrario, NPs de BSA cargadas con Ats mejoraron significativamente la tasa de apoptosis y oncosis celular. Las ratios apoptóticas aumentaron significativamente a 10.9 % en células SMMC-7721 y a 11.5 % en células Plc. Las ratios oncóticas aumentaron a 29.0 % en células SMMC-7721 y a 21.6 % en células Plc. Esto indicó que la entrega mitocondrial de Ats con mediación de NPs de BSA aceleró la muerte de células tumorales mejorando efectos oncóticos y apoptóticos. NPs de BSA cargadas con Ats desencadenaron el proceso de transducción de señal apoptótica y promovieron la reacción en cascada de apoptosis celular mediada por mitocondrias.

Análisis Western Blot

Para explorar la dependencia de la muerte celular en la apoptosis inducida por Ats libre y NPs cargadas con Ats, se realizó un ensayo Western blot para detectar la expresión de proteínas de apoptosis. Se encontró que en células SMMC-7721 tratadas con NPs cargadas con Ats, el nivel de expresión intracelular de proteína Bax aumentó significativamente (Fig. 6). Este hallazgo sugirió que con la ayuda de NPs de BSA, Ats se acumuló en mitocondrias y causó disfunción mitocondrial. La proteína monomérica Bax citoplasmática se transfirió a la membrana externa mitocondrial y sufrió oligomerización, formando un canal proteico en la membrana externa mitocondrial, llevando a aumento de permeabilidad de membrana. El nivel de expresión de citocromo C en citoplasma también fue particularmente y significativamente mejorado, y las expresiones de caspasa-3 y caspasa-9 mostraron tendencia ascendente. Por tanto, debido a la mayor permeabilidad de membrana mitocondrial, citocromo C se liberó rápidamente al citoplasma, activando proteínas de señalización de muerte celular (caspasas) y promoviendo la reacción en cascada de apoptosis celular. En contraste, Ats libre no tuvo diferencia significativa en la expresión de proteínas relacionadas con apoptosis y citocromo C, sugiriendo que Ats libre no desencadenó apoptosis mediada por mitocondrias y dependió principalmente de oncosis para llevar a muerte celular. NPs de BSA mejoraron la acumulación del fármaco en mitocondrias y activaron efectos apoptóticos mediados por mitocondrias, llevando a apoptosis significativa y aumentando expresiones de proteínas primarias relevantes a apoptosis, como se muestra en nuestros análisis Western blot.

Discusión

Oncosis y apoptosis representan dos formas diferentes en que las células mueren. La apoptosis es un proceso activo de muerte celular programada que ocurre en organismos multicelulares. La oncosis, por otro lado, describe una muerte celular independiente de caspasa caracterizada por hinchazón, permeabilidad aumentada y ruptura de membrana, a menudo llamada necrosis. Esta forma de muerte celular se cree que es accidental e incontrolada. Basado en nuestra investigación, encontramos que Ats inhibió el crecimiento de células tumorales y que la ratio de inhibición dependía de la dosis de Ats. Ats dependió principalmente del grado de oncosis y llevó a muerte celular; también activó muerte celular independiente de caspasa en forma de oncosis. Por el contrario, y separadamente de la ocurrencia de muerte tipo oncosis obvia, cuando células tumorales se trataron con NPs de BSA cargadas con Ats, NPs de BSA cargadas con Ats se internalizaron en citoplasma y se ubicaron rápidamente dentro de mitocondrias para liberar Ats, mediado por NPs. Ats en mitocondrias generó ROS y desencadenó estrés de RE; activó además la vía apoptótica dependiente de caspasa mediada por mitocondrias al reducir el potencial de membrana mitocondrial, liberar citocromo C y promover las expresiones proteicas de Bax, caspasa-3 clivada y caspasa-9. En conjunto, NPs de BSA cargadas con Ats aumentaron la entrega mitocondrial de Ats y mejoraron el grado de oncosis y apoptosis para inducir muerte celular, aumentando así la citotoxicidad del fármaco e induciendo muerte celular significativa.

Conclusiones

Brevemente, clarificamos que Ats libre en células tumorales dependía fuertemente del grado de oncosis para inhibir la proliferación de células tumorales en forma de muerte tipo oncosis; así, la citotoxicidad del fármaco era limitada e indeseable. En contraste, NPs de BSA cargadas con Ats activaron la vía apoptótica mitocondrial y simultáneamente desencadenaron efectos oncóticos; juntos, mejoraron la eficacia antitumoral sinérgica de Ats. Los resultados de este estudio destacaron la significancia de NPs de BSA cargadas con Ats en la mejora de efectos citotóxicos y apoptóticos de Ats, y además significan el papel de NPs de BSA en diversificar las vías de muerte celular inducidas por Ats. Comparado con Ats libre, NPs de BSA cargadas con Ats indujeron mayor citotoxicidad y efectos apoptóticos significativos en células tumorales.