Nanotransportadores de tetraedro de ADN potencian la apoptosis mediada por doxorrubicina en células de cáncer de colon HT-29

Resumen

Como nanotransportador de fármacos con la ventaja de modificabilidad y biocompatibilidad adecuada, la entrega mediante tetraedro de ADN (tetraedro de ADN) es prometedora para mejorar la eficiencia inhibitoria de fármacos anticancerígenos no dirigidos. En esta investigación, doxorrubicina (Dox) se ensambló a un tetraedro de ADN modificado con ácido fólico mediante química click para preparar un agente antitumoral dirigido. La eficiencia de captación celular se midió mediante imágenes fluorescentes. La citotoxicidad, eficiencia de inhibición y mecanismo correspondiente en la línea celular de cáncer de colon HT-29 se evaluaron mediante ensayo MTT, curva de proliferación celular, western blot y citometría de flujo. El tetraedro de ADN no indujo citotoxicidad, pero la relación de captación celular aumentó notablemente gracias a la penetración facilitada por el tetraedro de ADN a través de la membrana celular. En consecuencia, el complejo ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox aumentó marcadamente la eficiencia antitumoral con niveles incrementados de apoptosis. En detalle, 100 µM fue la concentración efectiva y se necesitó un período de incubación de 6 h para la inducción de apoptosis. En conclusión, el tetraedro de ADN nanoestructurado fue un sistema de entrega seguro y efectivo para Dox y mejoró correspondientemente la eficiencia anticancerígena.

Antecedentes

La doxorrubicina (Dox) es uno de los agentes antineoplásicos más utilizados, y numerosos estudios clínicos demostraron que Dox puede obstaculizar notablemente el crecimiento de células tumorales en diversos ciclos de crecimiento celular al inhibir la síntesis de ARN y ADN. Estudios previos sugirieron que la proliferación de células tumorales fue efectivamente bloqueada en fase G1, y la metástasis también fue inhibida por Dox a cierta concentración. Además, la inhibición efectiva puede lograrse con una dosis relativamente menor comparada con otros fármacos anticancerígenos. Sin embargo, Dox usualmente induce efectos secundarios resultantes de la falta de direccionamiento específico para células tumorales e inhibición no selectiva de ADN y ARN, lo que limita seriamente sus aplicaciones clínicas. Mientras tanto, la baja capacidad de captación celular reduce la acumulación de Dox en células tumorales. Por tanto, debe desarrollarse un sistema de entrega eficiente para Dox para hacerlo más específico y efectivo en el direccionamiento, más fácil de encapsular, y con excelente capacidad de captación y biocompatibilidad.

Los nanotransportadores de fármacos, como liposomas y nanopartículas inorgánicas, pueden facilitar la penetración de Dox a través de la membrana de células tumorales, mejorando la eficiencia de direccionamiento. No obstante, la entrega basada en liposomas no puede reducir los efectos secundarios en células normales debido al direccionamiento relativamente pobre; mientras que transportadores inorgánicos, como nanopartículas de sílice mesoporosa, no pueden biodegradarse completamente in vivo, obstaculizando la captación posterior de fármacos y aportando potencial bio-toxicidad. Para estos sistemas de entrega funcionales, la complejidad de preparación, inhomogeneidad de estructuras de nanopartículas y baja eficiencia de encapsulación obstaculizan la expansión clínica. Como nanotransportador de fármacos con excelente rendimiento en entrega, las estructuras basadas en ADN, como el tetraedro de ADN (tetraedro de ADN), pueden penetrar la membrana evitando la incompatibilidad entre el ADN electro-negativo y la membrana plasmática. Fármacos y moléculas de direccionamiento pueden unirse covalentemente al tetraedro de ADN. Además, la fácil absorción y biodegradación de secuencias de tetraedro de ADN evitan la retención a largo plazo. Fármacos aptámeros ricos en guanina, como AS1411, han sido entregados exitosamente en células tumorales A549 y funcionaron como agentes de direccionamiento e inhibidores. Factores inmunorreguladores, como CpG y siRNA, también pueden entregarse a células tumorales vía transportador de tetraedro de ADN para regular respuestas inmunes. Con las ventajas de baja toxicidad, biocompatibilidad adecuada y direccionamiento ajustable, el tetraedro de ADN mostró bioseguridad y potenciales para entrega de Dox.

En este estudio, partículas funcionales de tetraedro de ADN ensambladas con Dox como fármaco anticancerígeno y ácido fólico como moléculas de reconocimiento específico, fueron diseñadas, sintetizadas y caracterizadas. La eficiencia anticancerígena se evaluó en células de cáncer de colon considerando la regulación al alza significativa de receptores de folato en la superficie de la membrana celular. Específicamente, se midieron el nivel de captación celular, el grado de apoptosis inducida por Dox y la inhibición de la proliferación celular en líneas celulares HT-29.

Métodos

Reactivos y Equipos

Cadenas de oligonucleótidos de ADN se compraron de TAKARA en Dalian, China. Medio DMEM modificado de Dulbecco y suero fetal bovino se compraron de Gibco en NY, EE. UU. Penicilina y estreptomicina se compraron de Beyotime Biotechnology en Shanghai, China. Ácido fólico, doxorrubicina, MTT y agarosa se compraron de Sigma-Aldrich en MO, EE. UU. Todos los anticuerpos se compraron de Abcam Company en Shanghai, China. Otros reactivos se compraron de Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., en Shanghai, China.

Espectrofotómetro UV-Vis (Thermo Evolution 201) e incubadora de temperatura constante se compraron de Thermo Fisher en EE. UU.; centrífuga (GT10-1) de Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; espectrofotómetro de fluorescencia (UV-1800) de Shimadzu Corporation. Microscopía confocal de barrido láser (Visitech) de Leica; instrumento de reacción en cadena de polimerasa (PCR, T100), electroforesis de proteínas y ácidos nucleicos de Bio-Rad; analizador de tamaño de partícula por dispersión dinámica de luz de Beckman Company; placas de cultivo celular de 96 o 24 pocillos de Dow Corning Corporation. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Agilent 1200) con columna C18 de Agilent Technologies.

La línea celular humana de cáncer de colon HT-29 se mantuvo en DMEM suplementado con 10 % suero fetal bovino, 100 U/mL penicilina y 100 µg/mL estreptomicina en atmósfera humidificada con 95 % aire y 5 % dióxido de carbono a 37 °C.

Síntesis y Purificación del Tetraedro de ADN

En esta investigación, la síntesis siguió los procedimientos esquemáticos en Fig. 1, y las secuencias de ADN de cadena simple (ssDNA) del tetraedro de ADN se proporcionan en Fig. 1 también. En detalle, cada ssDNA se disolvió en tampón TE 0,5×, y el valor de densidad óptica (OD) correspondiente de ADN se determinó por espectrofotómetro UV a 260 nm. Se suplementó tampón TE adicional para hacer las cuatro cadenas a la misma concentración. La proporción de mezcla de cuatro ssDNAs fue 1:1:1:1 a 1 µM en 100 µL. La reacción se realizó en una máquina PCR con condiciones de ciclado: 95 °C, 10 min, enfriado natural a 4 °C. Todas las cadenas simples de ADN se purificaron por HPLC con 260 nm como pico de absorción característico. En el espectro HPLC, el tiempo de pico del tetraedro de ADN fue más rápido que el de cadena simple, y el producto se recolectó en el punto de tiempo correspondiente.

Síntesis y Caracterización de Ácido Fólico-Tetraedro de ADN-Dox

Grupos hidrógeno libres de Dox y ácido fólico se modificaron con grupo azida y luego se acoplaron con 3'-OH de ssDNA mediante reacción de química click. Al añadir diferente cantidad de ssDNA etiquetado con grupo funcional, la proporción de grupos funcionales pudo controlarse estequiométricamente mediante hibridación específica de cadenas laterales. Para síntesis de ácido fólico-tetraedro de ADN, la relación molar de ácido fólico y tetraedro de ADN se estableció en 1:1. Para síntesis de tetraedro de ADN-Dox, la relación molar de Dox y tetraedro de ADN se estableció en 4:1. Para síntesis de ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox, la relación molar de ácido fólico, tetraedro de ADN y Dox se estableció respectivamente en 1:1:3. Todas las síntesis se realizaron a nivel micromolar a 37 °C y luego almacenadas a 4 °C.

En este estudio, la serie de complejos de tetraedro de ADN se caracterizó por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con gel de separación 8 % (39 % Acr-Bis) para verificar pureza y tamaños moleculares relativos. Las muestras consistieron en las diferentes estructuras de tetraedro de ADN y tampón de carga 6× con proporción de mezcla 2:1. Las muestras se tiñeron y analizaron tras electroforesis en gel durante 90 min a 110 V. Para determinar diferencias en tamaños de partícula, las muestras de tetraedro de ADN también se escanearon con instrumentos de dispersión dinámica de luz (DLS) con luz dinámica.

Captación Celular Facilitada por Tetraedro de ADN

Para las diferentes estructuras de acoplamiento diseñadas en esta investigación, se compararon las tasas de captación por células HT-29 para determinar la eficiencia de entrega de fármaco. La eficiencia de captación celular se evaluó y cuantificó utilizando el espectro de fluorescencia característico de Dox, es decir, luz de excitación a 470 nm y luz de emisión a 590 nm. Las células HT-29 a 2 × 10⁵/mL se sembraron en placas de 24 pocillos y cultivaron 24 h. Las células se incubaron con varias estructuras de tetraedro de ADN a 10 µM durante otras 24 h. El medio se descartó y las células se enjuagaron con PBS tres veces. Para fijación celular, se añadió inmediatamente 4 % paraformaldehído a temperatura ambiente por 30 min de co-incubación, y las células se enjuagaron con PBS tres veces nuevamente. Finalmente, las placas de 24 pocillos se observaron por microscopio confocal láser para comparar la eficiencia de captación celular basada en la intensidad de luz de emisión.

Citotoxicidad y Eficiencia Anticancerígena

La citotoxicidad y eficiencia anticancerígena se evaluaron usando ensayo MTT, donde ocurre una reacción redox entre MTT en DMSO y succinato deshidrogenasa intracelular. Las células HT-29 se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos y cultivaron 24 h.

Para la citotoxicidad del tetraedro de ADN como transportador de fármaco, medio conteniendo estructuras de tetraedro de ADN a concentración 0-100 µM se añadió para otra incubación de 24 u 48 h. Luego, 100 µL de solución MTT (5 mg/mL) se añadió a cada pocillo, y la mezcla se incubó a 37 °C durante 4 h. El líquido se removió luego, y las células se lizaron y disolvieron con 200 µL DMSO. La absorbancia del sobrenadante se midió a 570 nm por Microreader. La muestra HT-29 no tratada se consideró grupo control.

Para el tetraedro de ADN acoplado con ácido fólico o Dox, por un lado, la investigación se centró en la estabilidad, bioseguridad y eficiencia de inhibición; por otro lado, si el Dox de tetraedro de ADN-Dox tiene propiedades antitumorales comparables a antes también se exploró. Por tanto, la citotoxicidad y eficiencia antitumoral de complejos de tetraedro de ADN se evaluaron. Complejos respectivamente a 100 µM se incubaron con células HT-29. Muestras celulares se recolectaron cada 6 h y luego detectaron por ensayo MTT para evaluar el efecto del período de incubación. Se prestó particular atención a la diferencia en eficiencia anticancerígena resultante de variaciones de estructuras. Además, los efectos de concentración en la inhibición de HT-29 tras tratamiento con ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox se evaluaron a 0-200 µM mediante ensayos MTT.

Western Blot y Citometría de Flujo

Para caracterizar la apoptosis celular inducida por Dox facilitada por entrega de tetraedro de ADN, muestras de proteínas de células tratadas se calentaron y craquearon usando líquido de pirólisis, analizaron por SDS-PAGE 12 % bajo condición de 100 V a corriente constante para separar muestras, y luego transfirieron a membranas PVDF de 0,22 µm de diámetro por 1 h. Las muestras se bloquearon con leche desnatada por 1 h. Tras lavar tres veces con PBST, las muestras se incubaron overnight con anticuerpo anti-caspasa-3 de conejo. Luego, las muestras se sondaron con anticuerpo secundario anti-conejo IgG de cabra por 1 h y luego lavaron con PBST e imagen por sistema de imagen de proteínas Bio-Rad. Además, GAPDH se eligió como proteína de referencia interna por su expresión estable en células.

La citometría de flujo se utilizó además para cuantificar los niveles de apoptosis en la concentración y punto temporal seleccionados mediante ensayos MTT. Las células HT-29 se incubaron con inhibidores por un período y luego midieron mediante citometría de flujo cuantitativa usando método de doble tinción Annexin V-PI.

Cuantificación de Proliferación Celular

El método de conteo celular se usó para cuantificar la proliferación celular con el tiempo. En detalle, tras ser tratadas con ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox por un período a 100 µM, las células se digirieron con tripsina 0,25 % por 30 s, y luego se añadió igual volumen de medio completo para terminar la reacción. El sobrenadante se descartó tras centrifugación a 1000 rpm por 3 min, y las células se resuspendieron con medio completo. El número de células en cada punto de detección se registró bajo microscopio óptico usando placas de conteo celular, para dibujar la curva de proliferación celular.

Análisis Estadístico

En esta investigación, las significancias de diferencias se determinaron usando prueba t de Student (dos colas; varianza igual de dos muestras). P < 0,05 significa diferencias significativas entre diferentes grupos.

Resultados

Preparación de Ácido Fólico-Tetraedro de ADN-Dox

En el proceso de síntesis específico, Dox se mezcló con tetraedro de ADN en diferentes proporciones para completar la carga y ensamblaje de Dox (peso molecular = 543,52) y ácido fólico (peso molecular = 441,4). Como se muestra en Fig. 2a, debido a que Dox y ácido fólico son monómeros con peso molecular relativamente bajo y similar, el ADN en un tetraedro y los conjugados con una molécula funcional tenían pesos moleculares aproximadamente equivalentes. Sin embargo, el ensamblaje de Dox o ácido fólico con los cuatro vértices del tetraedro de ADN hizo que el tamaño molecular del tetraedro de ADN aumentara notablemente. Como se muestra en Fig. 2b, la mayoría del tamaño del monómero de tetraedro de ADN fue menor a 15 nm. Con el aumento de grupos de acoplamiento, la estructura simétrica del tetraedro de ADN se destruyó y la mediana de tamaños de partícula de los compuestos aumentó significativamente. En particular, la expansión de tamaño de ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox extendió la mediana de diámetro a 20 nm.

Eficiencia de Entrega de Fármaco

Tras incubar con diferentes estructuras de tetraedro de ADN por 24 h, la eficiencia intracelular de Dox se evaluó con imágenes de fluorescencia, donde la fluorescencia roja intracelular es la fluorescencia característica de Dox; por tanto, células incubadas con tetraedro de ADN no exhibieron ninguna señal fluorescente como se muestra en Fig. 3a, y las señales rojas de células incubadas con complejos ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox y tetraedro de ADN-Dox fueron obviamente mayores que con Dox, significando la eficiencia de captación celular significativamente mejorada de Dox resultante de la penetración facilitada por tetraedro de ADN a través de la membrana, así como la estabilidad intracelular de los conjugados entre Dox y tetraedro de ADN.

El análisis cuantitativo adicional de intensidad de fluorescencia (Fig. 3b) evidenció los hallazgos visuales, y no hubo diferencia significativa entre complejos ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox y tetraedro de ADN-Dox (P < 0,05). La metodología de co-incubación de fármacos y células obstaculiza la exhibición completa de la capacidad de direccionamiento del ácido fólico. La concentración relativamente alta confirmó el reconocimiento específico de receptores de folato, que teóricamente es más obvio en aplicaciones in vivo con el sistema circulatorio complejo. En resumen, la entrega de tetraedro de ADN garantizó la eficiencia anticancerígena de Dox.

Citotoxicidad y Eficiencia Anticancerígena

Primero, la viabilidad de células HT-29 co-incubadas con diferentes concentraciones de tetraedro de ADN se examinó usando ensayo MTT. No hubo citotoxicidad obvia del tratamiento con tetraedro de ADN en células HT-29 a 0-100 µM por 24 y 48 h (Fig. 4a). Por tanto, el tetraedro de ADN nanoestructurado proporcionó una plataforma de transportador de fármacos biosegura.

En segundo lugar, resultante de la diferencia en eficiencia de entrega de Dox, ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox y tetraedro de ADN-Dox exhibieron inhibición más significativa dentro de 48 h (Fig. 4b). Debido a la falta de componentes anticancerígenos efectivos, tetraedro de ADN-ácido fólico llevó a disminución despreciable (< 10 %) de viabilidad durante la co-incubación de 48 h. Debido a que Dox no puede penetrar objetivamente la membrana, la disminución de viabilidad celular inducida por Dox fue menor que los otros grupos. Particularmente, el ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox mostró una disminución más temprana y significativa a las 6 h post-incubación, probando que el direccionamiento de ácido fólico ayuda a los fármacos a localizarse en la membrana, y hace que Dox surta efecto más oportunamente. Por el contrario, tetraedro de ADN-Dox comenzó a surtir efecto obviamente a las 12 h post-incubación, demostrando la importancia de grupos de direccionamiento.

Además, células HT-29 se trataron con ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox a 0-200 µM para detectar la concentración efectiva (Fig. 4c). La viabilidad celular de HT-29 disminuyó rápidamente con el aumento de concentración (0-100 µM) del complejo, pero no hubo diferencias significativas entre la concentración de 100 y 200 µM, indicando una manera dependiente de dosis de ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox, donde 100 µM puede considerarse como concentración efectiva para efecto antitumoral. Además, la viabilidad celular cambió significativamente de 24 a 48 h para los grupos de 10, 20 y 50 µM, indicando que el período de incubación también fue un factor en afectar la eficiencia anticancerígena basada en ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox.

Apoptosis Inducida por Ácido Fólico-Tetraedro de ADN-Dox

En consecuencia, basado en ensayos western blot (Fig. 5a), hubo aumento significativo de la expresión de caspasa-3 inducida por ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox y tetraedro de ADN-Dox, probando que la apoptosis fue la principal vía de muerte celular inducida por Dox.

La citometría de flujo (Fig. 5b-e) probó además que la incubación de 6 h con ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox a 100 µM indujo 68,7 % apoptosis. Mientras tanto, los niveles de apoptosis inducidos por Dox y tetraedro de ADN-Dox fueron solo 32,8 y 60,5 % con la misma condición de incubación.

Inhibición de la Proliferación Celular

Basado en ensayos MTT, 100 µM fue la concentración efectiva para inducción de apoptosis y se seleccionó en el experimento de proliferación celular. Como se muestra por la curva de proliferación celular (Fig. 6), debido al proceso lento de captación celular, la inhibición de la proliferación celular no se mostró totalmente durante la etapa temprana de co-incubación. Un efecto inhibitorio significativo se presentó tras incubar con ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox por más de 6 h, probando la existencia de endocitosis mejorada por tetraedro de ADN. Mientras tanto, 6 h es un período comparativo con el período efectivo detectado en Fig. 4b.

Discusión

Como medio común de modificación de ADN, la reacción de química click tuvo ventajas de alta eficiencia de reacción, buen control y operación fácil. El electroforetograma mostró una sola banda (Fig. 2a), indicando que productos de alta pureza se obtuvieron por acoplamiento covalente vía reacción de química click. La propiedad fluorescente de Dox lo hace rastreable in vitro e in vivo; mientras tanto, la fluorescencia dentro de las células tumorales probó indirectamente la estabilidad de ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox durante el proceso de penetración a través de la membrana celular. Por tanto, el ácido fólico-tetraedro de ADN-Dox fue capaz y estable para aplicaciones biomédicas.

El tetraedro de ADN tiene la capacidad de entregar fármacos en células. Todas las secuencias de ADN usadas en esta investigación no codificaban ninguna información genética. Así, no se reportaron efectos secundarios en expresión génica ni metabolismo celular en todos los exámenes. Mientras tanto, debido a la alta expresión de receptor de folato en superficie de células tumorales, el ácido fólico se seleccionó como moléculas de direccionamiento específico del sistema de entrega de fármacos para mejorar la eficiencia de captación de complejos de tetraedro de ADN. Sin embargo, con las circunstancias de tetraedro de ADN a concentración relativamente alta, la ventaja del direccionamiento de receptor de folato no se reflejó completamente in vitro. En consecuencia, para aplicación in vivo, el ácido fólico fue potencial para mejorar la eficiencia de direccionamiento en el sistema circulatorio complejo.

Actualmente, los fármacos anticancerígenos comúnmente traen efectos secundarios inesperados, por lo que la investigación sobre mejorar la capacidad de direccionamiento a células tumorales y eficiencia de entrega ha sido tema candente. Estudios previos mostraron que la capacidad del tetraedro de ADN para transportar fármacos se basaba en su buena compatibilidad. El tetraedro de ADN es un contenedor artificial de modificación favorable y biocompatibilidad adecuada. En este estudio, el acoplamiento exitoso de Dox y ácido fólico con tetraedro de ADN logró efecto inhibitorio satisfactorio y llevó a apoptosis obvia de células HT-29. Debido a que el tetraedro de ADN puede modificarse y acoplarse con fármacos y moléculas de direccionamiento, se realizó el enriquecimiento de concentración local de fármaco en célula tumoral. Los resultados anteriores probaron el buen reconocimiento para células tumorales y correspondiente efecto inhibitorio mejorado vía entrega de tetraedro de ADN, y este sistema de entrega de fármacos nanoestructurado puede usarse más extensamente.

Conclusiones

Como una estrategia de entrega de fármacos recién desarrollada, las nanoestructuras de ADN son de bajo costo, alta estabilidad y factibilidad para sintetizar; al mismo tiempo, son bioseguras debido a la falta de actividad inmune exógena. La estrategia de acoplamiento de tetraedro de ADN facilita la entrega dirigida de Dox, mejora la eficiencia anticancerígena de Dox en células de cáncer de colon, y proporciona una inspiración e idea prometedora para el diseño de fármacos.