La administración de ADN tetraedro mejora la apoptosis inducida por doxorrubicina de las células de cáncer de colon HT-29

Diagrama esquemático de ácido fólico-ADN tetra-Dox, ADN tetra-Dox y ácido fólico-ADN tetra. Se proporcionaron las secuencias de ADN monocatenario del ADN tetraedro. Se describió el proceso de apuntar a las células tumorales, penetrar a través de la membrana celular e insertar los ADN

Síntesis y caracterización de ácido fólico-ADN tetra-Dox

Los grupos de hidrógeno libre de Dox y ácido fólico se modificaron con un grupo azida y luego se acoplaron con 3'-OH de ssDNA mediante una reacción química de clic [21]. Cuando se agrega una cantidad diferente de ADNss etiquetado con un grupo funcional, la proporción de grupos funcionales podría controlarse estequiométricamente mediante la hibridación específica de las cadenas laterales. Para la síntesis de ácido fólico-ADN tetra, la relación molar de ácido fólico y ADN tetraedro se estableció en 1:1. Para la síntesis de ADN tetra-Dox, la relación molar de Dox y ADN tetraedro se estableció en 4:1. Para la síntesis de ácido fólico-ADN tetra-Dox, la relación molar de ácido fólico, ADN tetraedro y Dox se estableció respectivamente en 1:1:3. Toda la síntesis se llevó a cabo a nivel micromolar a 37 ° C y luego se almacenó a 4 ° C [22].

En este estudio, la serie de tetracomplejos de ADN se caracterizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con gel de separación al 8% (39% Acr-Bis) para comprobar la pureza y los tamaños moleculares relativos. Las muestras consistieron en las diferentes tetraestructuras de ADN y tampón de carga 6x con una proporción de mezcla de 2:1. Las muestras se tiñeron y analizaron después de la electroforesis en gel durante 90 minutos a 110 V. Para averiguar las diferencias en los tamaños de partículas, las muestras de ADN tetra también se escanearon mediante instrumentos de dispersión de luz dinámica (DLS) con luz dinámica.

Captación celular de ADN tetra-facilitada

Para las diferentes estructuras de acoplamiento diseñadas en esta investigación, se compararon las tasas de absorción por las células HT-29 para determinar la eficiencia de la administración del fármaco. La eficiencia de absorción celular se evaluó y cuantificó utilizando el espectro de fluorescencia característico de Dox, es decir, luz de excitación a 470 nm y luz de emisión a 590 nm. Las células HT-29 a 2 × 10 ⁵ / mL se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Las células se incubaron con varias tetraestructuras de ADN a 10 µM durante otras 24 h. A continuación, se desechó el medio y las células se aclararon con PBS tres veces. Para la fijación de las células, se añadió inmediatamente paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente para una coincubación de 30 minutos y las células se enjuagaron con PBS tres veces de nuevo. Por último, las placas de 24 pocillos se observaron mediante microscopio confocal láser para comparar la eficiencia de absorción celular en función de la intensidad de la luz de emisión.

Citotoxicidad y eficacia contra el cáncer

La citotoxicidad y la eficacia anticancerígena se evaluaron mediante el ensayo MTT, en el que se produce una reacción redox entre el MTT en DMSO y la succinato deshidrogenasa intracelular. Se sembraron células HT-29 en placas de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h.

Para la citotoxicidad del ADN tetra como portador de fármacos, se añadió medio que contenía ADN tetraestructuras a una concentración de 0 a 100 μM para otra incubación de 24 o 48 h. Luego, se agregaron 100 μL de solución de MTT (5 mg / mL) a cada pocillo y la mezcla se incubó a 37 ° C durante 4 h. A continuación, se eliminó el líquido y las células se lisaron y disolvieron con 200 µl de DMSO. La absorbancia del sobrenadante se midió a 570 nm mediante Microreader. La muestra de HT-29 no tratada se consideró como grupo de control.

Para el ADN tetraedro acoplado con ácido fólico o Dox, por un lado, la investigación se centró en la estabilidad, bioseguridad y eficiencia de inhibición; por otro lado, también se exploró si el Dox del ADN tetra-Dox tiene propiedades antitumorales comparables a las anteriores o no. Por tanto, se evaluó la citotoxicidad y la eficacia antitumoral de los tetracomplejos de ADN. Los complejos, respectivamente, a 100 µM se incubaron con células HT-29. Se recolectaron muestras de células cada 6 hy luego se detectaron mediante un ensayo MTT para evaluar el efecto del período de incubación. Se prestó especial atención a la diferencia en la eficacia anticáncer resultante de las variaciones de estructuras. Además, los efectos de la concentración sobre la inhibición de HT-29 después de ser tratado con ácido fólico-ADN tetra-Dox se evaluaron a 0-200 μM mediante ensayos MTT.

Western Blot y citometría de flujo

Para caracterizar la apoptosis celular inducida por Dox facilitada por la entrega de ADN tetra, las muestras de proteínas de las células tratadas se calentaron y se rompieron usando líquido de pirólisis, se analizaron con SDS-PAGE al 12% en la condición de 100 V a corriente constante para separar las muestras, y luego se transfirieron a membranas de PVDF de 0,22 μm de diámetro durante 1 h. Las muestras se bloquearon con leche desnatada durante 1 h. Después de lavarse tres veces con PBST, las muestras se incubaron durante la noche con anti-caspasa-3 de conejo. Luego, las muestras se sondaron con un anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra durante 1 hora y luego se lavaron con PBST y se obtuvieron imágenes a través del sistema de imágenes de proteínas Bio-Rad. Además, se eligió GAPDH como proteína de referencia interna debido a su expresión estable en las células.

La citometría de flujo se utilizó además para cuantificar los niveles de apoptosis en la concentración seleccionada y el punto de tiempo mediante ensayos MTT. Las células HT-29 se incubaron con inhibidores durante un período de tiempo y luego se midieron mediante citometría de flujo cuantitativa utilizando el método de tinción doble de Anexina V-PI.

Cuantificación de la proliferación celular

Se utilizó el método de recuento celular para cuantificar la proliferación celular con el tiempo. En detalle, después de ser tratadas con ácido fólico-ADN tetra-Dox durante un período de tiempo a 100 μM, las células se digirieron con tripsina al 0.25% durante 30 s, y luego, se agregó el mismo volumen de medio completo para terminar la reacción. El sobrenadante se descartó después de centrifugar a 1000 rpm durante 3 min y las células se resuspendieron con medio completo. El número de células en cada punto de detección se registró bajo microscopio óptico utilizando placas de recuento de células, a fin de trazar la curva de proliferación celular.

Análisis estadístico

En esta investigación, los significados de las diferencias se determinaron utilizando la t de Student prueba (de dos colas; varianza igual de dos muestras). P <0.05 significa diferencias significativas entre diferentes grupos.

Resultados

Preparación de ácido fólico-ADN tetra-Dox

En un proceso de síntesis específico, Dox se mezcló con ADN tetraedro en diferentes proporciones para completar la carga y el ensamblaje de Dox ( w _m =543.52) y ácido fólico ( w _m =441,4). Como se muestra en la Fig. 2a, debido a que Dox y ácido fólico son monómeros con peso molecular relativamente bajo y similar, el ADN en un tetraedro y los conjugados con una molécula funcional tenían pesos moleculares aproximadamente equivalentes. Sin embargo, el ensamblaje de Dox o ácido fólico con los cuatro vértices de ADN del tetraedro hizo que el tamaño molecular del ADN tetra aumentara obviamente. Como se muestra en la Fig. 2b, la mayor parte del tamaño del monómero tetraédrico de ADN era menor de 15 nm. Con el aumento de los grupos de acoplamiento, la estructura simétrica del ADN tetra se destruyó y el tamaño medio de las partículas de los compuestos aumentó significativamente. En particular, la expansión de tamaño de ácido fólico-ADN tetra-Dox extendió el diámetro del medio a 20 nm.

Caracterización de ADN tetra con diferentes constituyentes. un De izquierda a derecha:escalera de ADN, ADN tetra, ácido fólico-ADN tetra, ácido fólico-ADN tetra-Dox y ADN tetra-Dox en imágenes en SDS-PAGE al 8%. b La distribución de tamaño de ADN tetra, ácido fólico-ADN tetra, ácido fólico-ADN tetra-Dox y ADN tetra-Dox detectado mediante dispersión dinámica de luz

Eficiencia en la administración de medicamentos

Después de incubarse con diferentes tetraestructuras de ADN durante 24 h, se evaluó la eficiencia intracelular de Dox con imágenes de fluorescencia, donde la fluorescencia roja intracelular es la fluorescencia característica de Dox; por lo tanto, las células incubadas con ADN tetra no exhibieron ninguna señal fluorescente como se muestra en la Fig.3a, y las señales rojas de las células incubadas con complejos de ácido fólico-ADN tetra-Dox y ADN tetra-Dox fueron obviamente más altas que con Dox, lo que significa la eficiencia de absorción celular significativamente mejorada de Dox resultante del ADN tetra facilitó la penetración a través de la membrana, así como la estabilidad intracelular de los conjugados entre Dox y ADN tetra.

La eficiencia de absorción de las células HT-29 después de haber sido incubadas con diferentes complejos durante 24 h. un Detección de microscopía confocal (el rojo es la luz de excitación de fluorescencia de Dox, barra de escala =10 μm). b Intensidad de la fluorescencia celular. ** P <0.05 en comparación con el grupo de ADN tetra

El análisis cuantitativo adicional de la intensidad de la fluorescencia (Fig. 3b) evidenció los hallazgos visuales y no hubo diferencias significativas entre los complejos de ácido fólico-ADN tetra-Dox y ADN tetra-Dox ( P <0,05). La metodología de co-incubación de fármacos y células obstaculiza la exhibición completa de la capacidad de focalización del ácido fólico. La concentración relativamente alta confirmó el reconocimiento específico de los receptores de folato, que en teoría es más obvio en las aplicaciones in vivo con el sistema circulante complejo. En resumen, la entrega de ADN tetra garantizó la eficacia anticancerosa de Dox.

Citotoxicidad y eficacia anticáncer

En primer lugar, se examinó la viabilidad de las células HT-29 co-incubadas con diferentes concentraciones de ADN tetra utilizando un ensayo MTT. No hubo citotoxicidad obvia del tratamiento con ADN tetra en células HT-29 a 0-100 μM durante 24 y 48 h (Fig. 4a). Por lo tanto, el tetraedro de ADN de tamaño nanométrico proporcionó una plataforma portadora de fármacos biosegura.

La citotoxicidad y eficacia antitumoral de complejos Dox y ADN tetra para células HT-29. un La viabilidad de las células HT-29 incubadas con ADN tetra a diferentes concentraciones durante 24 o 48 h. b La eficacia antitumoral de los complejos Dox a 100 μM. c La viabilidad de las células HT-29 incubadas con ácido fólico-ADN tetra-Dox a diferentes concentraciones durante 24 o 48 h

En segundo lugar, como resultado de la diferencia en la eficiencia de administración de Dox, el ácido fólico-ADN tetra-Dox y el ADN tetra-Dox exhibieron una eficiencia de inhibición más significativa en 48 h (Fig. 4b). Debido a la falta de componentes anticancerígenos eficaces, el ácido tetrafólico de ADN conduce a una disminución insignificante (<10%) de la viabilidad durante la co-incubación de 48 h. Debido a que Dox no puede penetrar objetivamente la membrana, la disminución de la viabilidad celular inducida por Dox fue menor que en los otros grupos. Particularmente, el ácido fólico-ADN tetra-Dox mostró una disminución más temprana y significativa a las 6 h después de la incubación, lo que demuestra que la focalización del ácido fólico ayuda a que los medicamentos se ubiquen en la membrana y hacen que el Dox surta efecto de manera más oportuna. Por el contrario, el ADN tetra-Dox comenzó a surtir efecto obviamente a las 12 h posteriores a la incubación, lo que demuestra la importancia de los grupos objetivo.

Además, las células HT-29 se trataron con ácido fólico-ADN tetra-Dox a 0-200 µM para detectar la concentración efectiva (Fig. 4c). La viabilidad celular de las células HT-29 disminuyó rápidamente al aumentar la concentración (0-100 μM) del complejo, pero no hubo diferencias significativas entre la concentración de 100 y 200 μM, lo que indica una forma dependiente de la dosis de ácido fólico-ADN tetra- Dox, donde 100 μM se puede considerar como una concentración eficaz para el efecto antitumoral. Además, la viabilidad celular cambió significativamente de 24 a 48 h para los grupos de 10, 20 y 50 μM, lo que indica que el período de incubación también fue un factor que influyó en la eficacia anticancerígena basada en ácido fólico-ADN tetra-Dox.

Apoptosis inducida por ácido fólico-ADN tetra-Dox

En consecuencia, con base en los ensayos de western blot (Fig.5a), hubo un aumento significativo de la expresión de caspasa-3 inducida por ácido fólico-ADN tetra-Dox y ADN tetra-Dox, lo que demuestra que la apoptosis era la principal vía de Dox- muerte celular inducida.

La expresión celular de la caspasa-3 relacionada con la apoptosis después de ser tratada con diferentes complejos ( a ) y la citometría de flujo de las células HT-29 después de incubarlas con ADN tetra, Dox, ADN tetra-Dox y ácido fólico-ADN tetra-Dox ( b - e )

La citometría de flujo (Fig. 5b-e) demostró además que la incubación de 6 h con ácido fólico-ADN tetra-Dox a 100 µM indujo una apoptosis del 68,7%. Mientras tanto, los niveles de apoptosis inducidos por Dox y ADN tetra-Dox fueron solo 32,8 y 60,5% con la misma condición de incubación.

Inhibición de la proliferación celular

Según los ensayos de MTT, 100 µM fue la concentración eficaz para la inducción de la apoptosis y se seleccionó en el experimento de proliferación celular. Como se muestra en la curva de proliferación celular (Fig. 6), debido al proceso de absorción celular que consume mucho tiempo, la inhibición de la proliferación celular no se mostró totalmente durante la etapa inicial de la co-incubación. Se presentó un efecto inhibitorio significativo tras ser incubado con ácido fólico-ADN tetra-Dox durante más de 6 h, comprobando la existencia de endocitosis con ADN tetra-potenciada. Mientras tanto, 6 h es un período de tiempo comparativo con el período de tiempo efectivo detectado en la Fig. 4b.

Inhibición de la proliferación celular inducida por la incubación con ácido fólico-ADN tetra-Dox a 100 μM durante diferentes períodos de tiempo

Discusión

Como medio común de modificación del ADN, la reacción química de clic tenía las ventajas de una alta eficiencia de reacción, control de pozos y fácil operación [21]. Electroforetograma mostrado con una sola marca (Fig. 2a), lo que indica que los productos con alta pureza se obtuvieron mediante acoplamiento covalente mediante una reacción química de clic. La propiedad fluorescente de Dox lo hace rastreable in vitro e in vivo; mientras tanto, la fluorescencia dentro de las células tumorales demostró indirectamente la estabilidad del ácido fólico-ADN tetra-Dox durante el proceso de penetración a través de la membrana celular. Por lo tanto, el ácido fólico-ADN tetra-Dox era capaz y estable para aplicaciones biomédicas.

El ADN tetra tiene la capacidad de administrar medicamentos a las células. Todas las secuencias de ADN utilizadas en esta investigación no fueron codificadas para ninguna información genética. Por lo tanto, no se informaron efectos secundarios tanto en la expresión génica como en el metabolismo celular en todos los exámenes. Mientras tanto, debido a la alta expresión del receptor de folato en la superficie de las células tumorales, el ácido fólico se selecciona como moléculas diana específicas del sistema de administración de fármacos para mejorar la eficiencia de absorción de los tetracomplejos de ADN. Sin embargo, con las circunstancias del ADN tetra a una concentración relativamente alta, la ventaja de dirigirse al receptor de folato no se reflejó completamente in vitro. En consecuencia, para la aplicación in vivo, el ácido fólico tenía el potencial de mejorar la eficacia de la focalización en el complejo sistema circulatorio.

En la actualidad, los fármacos contra el cáncer suelen traer efectos secundarios inesperados, por lo que la investigación sobre la mejora de la capacidad de direccionamiento de las células tumorales y la eficiencia de administración ha sido un tema candente [23, 24, 25]. Estudios anteriores demostraron que la capacidad del ADN tetraedro para transportar fármacos se basaba en su buena compatibilidad. El tetraedro de ADN es un contenedor artificial de modificación favorable y biocompatibilidad adecuada. En este estudio, el acoplamiento exitoso de Dox y ácido fólico con ADN tetraedro logró un efecto inhibidor satisfactorio y condujo a una apoptosis obvia de las células HT-29. Debido a que el ADN tetra puede modificarse y acoplarse con fármacos y moléculas diana, se logró el enriquecimiento de la concentración local del fármaco en la célula tumoral. Los resultados anteriores demostraron el buen reconocimiento de las células tumorales y el correspondiente efecto inhibidor mejorado a través de la administración de ADN tetra, y este sistema de administración de fármacos de tamaño nanométrico se puede utilizar de manera más extensa.

Conclusiones

Como estrategia de administración de fármacos desarrollada recientemente, las estructuras de ADN de tamaño nanométrico son de bajo costo, alta estabilidad y viabilidad de sintetizar; mientras tanto, es bioseguro debido a la falta de actividad inmunitaria exógena. La estrategia de acoplamiento del tetraedro de ADN facilita la administración dirigida de Dox, mejora la eficacia anticancerosa de Dox en las células de cáncer de colon y proporciona una inspiración e idea prometedoras para el diseño de fármacos.

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