Efectos de nanopartículas de oro de 15 nm sobre proliferación, apoptosis y formación esferoides en células de carcinoma de colon HT29 y riñón embrionario SPEV

Resumen

Los modelos de cultivo celular proporcionan una plataforma confiable para evaluar la potencial toxicidad de nanomateriales y diseccionar su impacto mecanicista en la biología del cáncer. Aquí evaluamos cómo nanopartículas de oro de 15 nm estabilizadas con citrato (AuNPs) influyen en dos líneas celulares epiteliales de origen distinto: la línea continua de riñón embrionario porcino SPEV y la línea de carcinoma colorrectal humano HT29. La exposición a concentraciones de AuNP de 1 a 12 µg mL⁻¹ permitió monitorear adhesión celular, proliferación, apoptosis/necrosis y la capacidad de formar esferoides multicelulares. Encontramos que 6-12 µg mL⁻¹ AuNPs redujeron significativamente la proliferación celular y aumentaron las poblaciones apoptóticas/necróticas tempranas y tardías en ambas líneas. Por el contrario, dosis bajas de AuNP (1-3 µg mL⁻¹) estimularon la formación de esferoides, mientras que dosis más altas ejercieron efectos citotóxicos y anti-cohesivos en cultivo en suspensión. Estos resultados resaltan el papel dual dependiente de la dosis de AuNPs y apoyan su continua exploración como estrategia anticancerígena dirigida.

Antecedentes

Las nanopartículas de oro (AuNPs) son apreciadas por su biocompatibilidad, propiedades ópticas y potencial terapéutico emergente en un espectro de malignidades, incluyendo cáncer de mama, hígado, gástrico, colon y pulmón. Los rasgos físico-químicos únicos de AuNPs —tamaño, forma, carga superficial y concentración— gobiernan su captación celular, distribución y efectos biológicos. Mientras muchos estudios se centran en la eficacia anticancerígena de AuNPs, el perfilado de toxicidad integral en modelos clínicamente relevantes sigue siendo esencial para una traducción segura.

La entrega dirigida de AuNPs a tejido tumoral sigue siendo un desafío; se han reportado tasas de captación diferencial entre células epiteliales de diversos orígenes. Variaciones en composición de membrana, expresión de glicoproteínas y capacidad endocítica probablemente subyacen a estas diferencias, subrayando la necesidad de estudios comparativos en líneas epiteliales normales y malignas.

Los ensayos de cultivo celular ofrecen un ambiente controlado para diseccionar las respuestas celulares a AuNPs, informando tanto evaluaciones de seguridad como optimización terapéutica. En este estudio, comparamos los efectos de AuNPs en una línea de riñón embrionario tipo normal (SPEV) y una línea de carcinoma colorrectal (HT29) usando lecturas de adhesión, proliferación, apoptosis/necrosis y formación de esferoides.

Métodos

Cultivo de Células SPEV

Las células SPEV se mantuvieron en DMEM (Sigma, EE. UU.) suplementado con 5 % FCS (HyClone, EE. UU.), penicilina/estreptomicina (PAA, Austria) y anfotericina B (5 µg mL⁻¹). Las células se sembraron a 0,5-2 × 10⁴ células cm⁻² y cultivaron en 5 % CO₂ a 95 % humedad. El medio se renovó cada 48 h, y los pasajes se realizaron al alcanzar confluencia, preservando la morfología de monocapa a través de pasajes.

Cultivo de Células HT29

Las células HT29 se cultivaron en RPMI-1640 (Sigma, EE. UU.) con 10 % FCS, 2 mM L-glutamina y 40 mg mL⁻¹ gentamicina (Sigma, EE. UU.). La densidad de trabajo fue 0,5-4 × 10⁴ células cm⁻². Las células se obtuvieron del Banco de Líneas Celulares en el Instituto RE Kavetsky de Patología Experimental, Oncología y Radiobiología, NAS de Ucrania.

Manipulación con AuNPs

Los AuNPs se sintetizaron por el método de reducción con citrato y fueron suministrados por el Instituto de Bioquímica y Fisiología de Plantas y Microorganismos, Academia de Ciencias de Rusia. Las partículas promediaron 15 nm de diámetro, con concentración de stock de 57 µg mL⁻¹. Microscopía electrónica de campo oscuro y espectros de extinción confirmaron la distribución de tamaño (Fig. 1). Las células se trataron con 1, 3, 6 u 12 µg mL⁻¹ AuNPs por 24-48 h; cultivos sin tratar sirvieron como controles.

Ensayo de Adhesión y Proliferación

La adhesión se cuantificó contando células aplanadas a los 30, 60, 120, 180 y 1440 min tras la siembra, usando microscopio invertido. La proliferación durante 1-4 días se evaluó por desprendimiento con tripsina-EDTA y conteo en cámara de Goryaev. Los datos se expresaron como media ± EE.

Evaluación de Apoptosis/Necrosis

Tras 4 días de exposición a AuNPs, las células se tiñeron con Annexin-V y 7-AAD y analizaron por citometría de flujo (FACS Calibur, BD). Los resultados se procesaron con WinMDI v2.8.

Formación de Esferoides Multicelulares

Para generar esferoides, 5 × 10⁴ células cm⁻² se sembraron en placas de 24 pocillos recubiertas con 1 % agar y cultivaron en 0,24 % carboximetil-celulosa (CMC) con rotación a 80 rpm. Los esferoides se permitieron formar por 24 h, luego se mantuvieron 48 h adicionales en presencia de AuNPs. El tamaño y número de esferoides se midieron por microscopía de campo oscuro y analizaron con Axio Vision 4.7, calculando volumen mediante V = 0,4 × a × b² (a, b = diámetros). Los agregados se agruparon por volumen (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² mm³) para determinar volúmenes medianos y conteos.

Análisis Estadístico

Los datos se analizaron usando ANOVA de una vía y prueba t de Student (Statistica 8). La significancia se estableció en p ≤ 0,05, presentados como media ± EE.

Resultados

Adhesión de Células SPEV y HT29

La Figura 2 ilustra el impacto de AuNPs en la adhesión de SPEV. Tras 1 h, 1, 3 y 6 µg mL⁻¹ AuNPs redujeron conteos de células adheridas respecto al control, con 12 µg mL⁻¹ causando una disminución 1,8 veces que persistió por 24 h. Las células HT29 mostraron tendencia similar: concentraciones bajas tuvieron efectos insignificantes, mientras que 6 y 12 µg mL⁻¹ redujeron la adhesión 1,16 y 1,28 veces, respectivamente (Fig. 3).

Proliferación de Células SPEV y HT29

La Figura 4 muestra que 1-6 µg mL⁻¹ AuNPs no alteraron la proliferación de SPEV durante días 2-4, mientras que 12 µg mL⁻¹ redujo números celulares hasta 1,5 veces (Fig. 4). La proliferación de HT29 permaneció inalterada hasta día 3; en día 4, 6 y 12 µg mL⁻¹ redujeron conteos celulares 1,33 y 1,44 veces, respectivamente (Fig. 5).

Inducción de Apoptosis/Necrosis

Dosis bajas de AuNP (1-3 µg mL⁻¹) no alteraron significativamente perfiles Annexin-V/7-AAD en ninguna línea (Tablas 1-2). A 6-12 µg mL⁻¹, tanto SPEV como HT29 mostraron aumento de poblaciones apoptóticas/necróticas tempranas y tardías. Para SPEV, 12 µg mL⁻¹ aumentó células Annexin-V⁺/7-AAD⁺ en 7,8 % (p ≤ 0,05); para HT29, 6 y 12 µg mL⁻¹ aumentaron esta fracción en 3,2 % y 4,8 %, respectivamente.

Formación de Esferoides

Las Figuras 6 y 7 muestran cómo AuNPs modulan número y volumen de esferoides. Esferoides control de HT29 promediaron 5,19 × 10⁻³ mm³, mientras que esferoides SPEV promediaron 0,79 × 10⁻⁵ mm³. 1-3 µg mL⁻¹ AuNPs amplificaron volumen de esferoides SPEV 9,7 y 7,4 veces, y volumen HT29 1,4 y 1,2 veces. Aumentar concentración de AuNP a 12 µg mL⁻¹ redujo volumen de esferoides en ambas líneas (HT29: 7,18 → 4,24 × 10⁻³ mm³; SPEV: 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ mm³) mientras aumentaba número de esferoides HT29 de 3 a 10 por campo y disminuía esferoides SPEV de 32 a 19.

Discusión

Nuestros datos confirman un perfil citotóxico dependiente de dosis de AuNPs de 15 nm en ambas células SPEV y HT29. Concentraciones de 6-12 µg mL⁻¹ inhibieron proliferación, aumentaron apoptosis/necrosis y disruptaron cohesión celular en suspensión, como evidencian tamaño y número de esferoides alterados. La mayor sensibilidad de HT29 (6 µg mL⁻¹) relativa a SPEV (12 µg mL⁻¹) se alinea con reportes previos de captación diferencial y disruptión citoesquelética por AuNPs.

Mecanísticamente, AuNPs pueden interferir con complejos de adhesión focal, modular dinámica de actina y desencadenar estrés oxidativo mitocondrial —vías que culminan en arresto de ciclo celular y muerte celular programada. El efecto anti-cohesivo observado a dosis más altas probablemente refleja disruptión de uniones célula-célula, llevando a mayor fragmentación de esferoides.

Aunque los hallazgos in vitro son prometedores, la validación in vivo es esencial para confirmar eficacia terapéutica y seguridad. No obstante, nuestro estudio proporciona un referente riguroso para el diseño de estrategias anticancerígenas basadas en AuNPs que explotan su doble capacidad para inhibir crecimiento tumoral y modular microambientes celulares.

Conclusiones

Los AuNPs de 15 nm exhiben efectos claros dependientes de concentración en tanto células SPEV tipo normal como HT29 malignas: reducción de proliferación, aumento de apoptosis/necrosis y dinámica de esferoides alterada. Dosis bajas (1-3 µg mL⁻¹) promueven formación de esferoides, mientras que dosis más altas (6-12 µg mL⁻¹) ejercen acciones citotóxicas y anti-cohesivas. Estos hallazgos apoyan investigación adicional de AuNPs como modalidad anticancerígena dirigida, con atención a optimización de dosis para máximo beneficio terapéutico y mínima toxicidad off-target.