Nanopartículas de Oro Recubiertas de Proteína Sintetizadas en Verde desde Tricholoma crassum: Potencial Antimicrobiano, Apoptótico y de Entrega Génica

Resumen

Reportamos la primera síntesis verde de nanopartículas de oro recubiertas de proteína (AuNPs) usando el hongo micorrícico comestible Tricholoma crassum. Las AuNPs, 5–25 nm de diámetro y diversas formas, se forman en una hora a 28 °C. Espectroscopía UV-vis muestra pico SPR característico a 552 nm, desplazándose con tiempo de reacción y pH. Caracterización detallada por MEB, MET, AFM, DRX y DLS confirma monodispersidad y corona proteica natural de 40 kDa. Las partículas exhiben potente actividad antimicrobiana contra patógenos Gram-negativos, Gram-positivos y fúngicos, incluyendo cepas multi-resistentes, e inhiben germinación de esporas. Ensayos cometa revelan inducción apoptótica dosis-dependiente en células vegetales, mientras la capa proteica de 40 kDa facilita entrega génica eficiente a células Sarcoma 180, evidenciada por expresión GFP. Pruebas de hemólisis muestran toxicidad sanguínea despreciable bajo 20 µl mL⁻¹, indicando ventana terapéutica segura. Producción a gran escala en fermentadores es factible, posicionando estas AuNPs como agentes versátiles para aplicaciones antimicrobianas, anticancerígenas y de entrega génica.

Antecedentes

La rápida adopción de nanopartículas en agricultura, medicina y productos de consumo ha aumentado la necesidad de entender su perfil de seguridad. La síntesis verde, que emplea organismos vivos o sus enzimas, ofrece una ruta ecológica, rentable que elimina químicos peligrosos. Los hongos filamentosos, con su alta secreción enzimática, son particularmente aptos para producir nanopartículas metálicas extracelulares. Aunque varios hongos han producido AuNPs, pocos reportan capas proteicas naturales en estas partículas, críticas para estabilidad coloidal y funcionalización. Las AuNPs son atractivas para uso terapéutico porque no eliciten resistencia y pueden diseñarse para atacar células tumorales vía efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR). Las AuNPs recubiertas de proteína mejoran captación celular y proporcionan sitios de anclaje para fármacos o genes, obviando pasos adicionales de recubrimiento químico. No obstante, biocompatibilidad, citotoxicidad y riesgos de agregación deben evaluarse cuidadosamente antes de aplicación clínica.

Métodos

Condiciones de Crecimiento de Hongos, Bacterias y Plantas

Tricholoma crassum se cultivó para síntesis de nanopartículas. Pruebas antimicrobianas usaron E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) y sus derivados multi-resistentes, así como patógenos vegetales M. oryzae y A. solani. Plántulas de tomate y tabaco crecieron bajo condiciones controladas (28 ± 1 °C, 16:8 h luz/oscuridad, 50 µmol m⁻² s⁻¹).

Síntesis de AuNPs

Tapetes miceliales se incubaron en caldo dextrosa papa (PDB) 7 días a 28 °C. Tras 24, 48, o 72 h, 1 g de micelio se agitó con 10 mL agua desionizada 24 h a 50 RPM. El filtrado (pH 5,2) se mezcló con 1 mM HAuCl₄ y agitó a 28 °C en oscuridad 1 h. Ajustando pH del filtrado (3,5–9) y temperatura de reacción (0–100 °C), afinamos tamaño y forma de partícula. Variaciones en volumen de filtrado (×0,5–×2) y concentración Au³⁺ (0,5–2 mM) refinaron further la síntesis.

Técnicas de Caracterización

• Espectroscopía UV-Vis (450–750 nm) para análisis SPR.
• MEB, MET y AFM para morfología y distribución de tamaño.
• DRX para confirmación de fase cristalina.
• DLS para tamaño hidrodinámico.
• SDS-PAGE para identificación de corona proteica.

Ensayos Antimicrobianos y Antifúngicos

Ensayos de difusión en disco y curvas de crecimiento cuantificaron inhibición contra cepas bacterianas y fúngicas. Germinación de esporas fúngicas se evaluó con concentraciones variables de AuNPs. El método involucró incubación estándar y observación microscópica.

Evaluación de Apoptosis

Ensayo cometa en núcleos de hoja de tabaco y tomate midió fragmentación ADN tras exposición a AuNPs. Diferentes concentraciones (0–30 % v/v) y tiempos incubación (15–30 min) se probaron.

Entrega Génica en Células Sarcoma 180

Plásmido pCAMBIA1302 (marcador GFP) se complejizó con AuNPs e incubó con células Sarcoma 180. Expresión GFP confirmó transfección exitosa. Ensayos hemólisis con eritrocitos humanos evaluaron compatibilidad sanguínea.

Resultados y Discusión

Formación de AuNPs y Características Espectroscópicas

La transición de amarillo pálido a violeta en 1 h indica formación de AuNPs. Espectros UV-Vis muestran pico SPR a 552 nm para filtrado 24 h, desplazándose al rojo con incubación mayor y al azul con pH mayor. Síntesis óptima ocurre a 28 °C con 1 mM HAuCl₄, produciendo partículas monodispersas estables >30 días.

Efecto de Parámetros de Síntesis

Aumentar volumen de filtrado o concentración Au³⁺ eleva intensidad de color y absorbancia, con ligero desplazamiento azul a ×2 filtrado. Temperaturas mayores (75–100 °C) producen partículas mayores, menos estables. Exposición a luz aumenta tamaño de partícula y ensancha pico SPR.

Morfología y Distribución de Tamaño

MEB y MET revelan AuNPs 5–22 nm en formas desde esferas y romboides a hexágonos y triángulos. AFM confirma alturas sub-10 nm, y DRX confirma oro cúbico centrado en caras con difracción {111} dominante a 38,23°.

Actividad Antimicrobiana

AuNPs inhibieron crecimiento de E. coli, A. tumefaciens y M. oryzae con zonas inhibición dosis-dependientes. Cepas multi-resistentes también suprimidas, indicando eficacia amplio espectro. Análisis de curvas crecimiento mostraron fase logarítmica retardada y densidad celular reducida tras tratamiento con AuNPs.

Germinación de Esporas Fúngicas

Concentraciones crecientes de AuNPs redujeron progresivamente germinación de esporas y longitud de tubo germinativo de A. solani, demostrando potencia antifúngica.

Propiedades Apoptogénicas

Ensayos cometa revelaron daño ADN significativo a >20 % exposición AuNPs, mientras 5–10 % causaron apoptosis despreciable. Así, existe ventana terapéutica para aplicaciones antimicrobianas o entrega génica sin citotoxicidad.

Identificación de Corona Proteica

SDS-PAGE de NPs hervidas muestra banda única 40 kDa idéntica a proteína extracelular de T. crassum. La capa proteica estabiliza partículas y proporciona sitios unión para ADN.

Entrega Génica y Hemólisis

Complejos AuNP-plásmido lograron expresión GFP en células Sarcoma 180, mientras plásmido desnudo no. Hemólisis permaneció bajo 8 % a concentraciones hasta 20 µl mL⁻¹, confirmando baja toxicidad sanguínea.

Conclusiones

El hongo micorrícico comestible Tricholoma crassum permite síntesis verde rápida de AuNPs recubiertas de proteína con formas diversas y robustas propiedades antimicrobianas, apoptóticas y de entrega génica. La corona proteica natural de 40 kDa asegura estabilidad coloidal y funcionalización, mientras datos de hemólisis apoyan uso terapéutico seguro. Producción a gran escala en fermentadores es factible, ofreciendo plataforma escalable para aplicaciones antimicrobianas, anticancerígenas y nanomedicina.