Evaluación de las propiedades antimicrobianas, apoptóticas y de administración de genes de células cancerosas de nanopartículas de oro cubiertas con proteínas sintetizadas a partir del hongo micorrízico comestible Tricholoma crassum

Métodos

Hongos, bacterias y condiciones de crecimiento de las plantas

Tricholoma crassum (Berk.) Sacc. se utilizó para la producción de nanopartículas. Para ensayos antimicrobianos, E. coli (DH5α), Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), cepas de E. coli (DH5α) y A. tumefaciens (LBA4404). Los hongos fitopatógenos Magnaporthe oryzae y Alternaria solani fueron usados. Se cultivaron plántulas de tomate (variedad Pusa Ruby) y tabaco (Variedad SR1) en suelo en cámaras de crecimiento con fotoperiodos 16:8 h claro / oscuro, 28 ± 1 ° C e intensidad de luz de 50 μmol m ^{- 2 s - 1 .}

Síntesis de AuNP

T. crassum El micelio se cultivó en caldo de patata dextrosa (PDB) durante 7 días a 28 ° C. Se agitó 1 g de esterilla micelial con 10 ml de agua desionizada en un agitador a 50 RPM durante 24, 48 y 72 ha 28ºC. Los sobrenadantes se filtraron a través de papel de filtro Whatman núm. 1. El filtrado celular (pH 5,2) se incubó con una solución acuosa 1 mM de cloroaurato (HAuCl ₄ ) y se agitó a 28 ° C en la oscuridad según nuestro informe [2] durante 1 h para cada tipo de filtrado celular elaborado por 24, 48 y 72 h de incubación con micelio.

Para la biosíntesis de AuNP a diferentes pH, se usó HCl 1 M o NaOH 1 M para ajustar el pH del filtrado libre de células al rango ácido (3,5) y al rango alcalino (7, 8 y 9) antes de la incubación. Las AuNP también se sintetizaron usando diferentes temperaturas de reacción (0, 15, 28, 75 y 100 ° C), diferentes concentraciones de filtrado libre de células (× 0.5, × 1, × 2) e iones de cloroaurato (0.5, 1, 2 mM ).

Espectroscopía UV-visible

Se analizó la absorbancia de los sobrenadantes de cada filtrado celular incubado durante 1 h con solución de cloroaurato utilizando un espectrofotómetro UV-visible entre 450 y 750 nm para representar los espectros de absorbancia.

Microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y difracción de rayos X (XRD)

Estos análisis se realizaron de acuerdo con Chowdhury et al. [15] con pocas modificaciones. Nanopartículas de oro producidas usando filtrados celulares de 24 h seguidas de 1 h de incubación con HAuCl ₄ 1 mM La solución a 28 ° C (pH 5,5) se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y difracción de rayos X (XRD). Se secó al vacío una película delgada de AuNP en un trozo de vidrio y se sometió a SEM utilizando FEI Quanta 200 (FEI, EE. UU.).

Las formas y tamaños de AuNP se determinaron mediante TEM. Se colocó una gota (10 µl) de la suspensión de AuNP sobre rejillas de cobre recubiertas de carbón y se sometió a desecación al vacío antes de cargarla en un portamuestras. Las micrografías TEM de estas nanopartículas se obtuvieron utilizando TECNAI G TEM con una construcción de bajo voltaje (100 kV).

Para la obtención de imágenes AFM, las AuNP se depositaron en una hoja de mica Ruby moscovita recién cortada (Ruby Mica Co. Ltd., India) y se secaron utilizando un secador de vacío. El AFM en modo de corriente alternativa acústica (AAC) se realizó con un AFM Pico plus 5500 ILM (Agilent Technologies, EE. UU.).

Para el estudio de XRD, se extendió una película delgada de suspensión de AuNP uniformemente sobre un portaobjetos de vidrio y se secó usando un secador de vacío. Los patrones de XRD se registraron en un D8 Advance DAVINCI XRD System (Bruker AXS Pvt.Ltd.) Operado a un voltaje de 40 kV y una corriente de 40 mA con radiación CuKα (λ =1.54060 / 1.54443 Å), y se registraron las intensidades difractadas de 35 ° a 80 ° 2θ ángulos.

Análisis de software de computadora

Las mediciones de AuNP y la construcción de un histograma se realizaron utilizando la herramienta MEASURE IT del software OLYMPUS. La concentración de nanopartículas se calculó según Sriram et al. [18] y nuestra publicación anterior, Chowdhury et al. [15].

Transformación de bacterias para desarrollar resistencia a múltiples fármacos

A. tumefaciens cepa LBA4404 y E. coli La cepa DH5α se hizo resistente a múltiples fármacos mediante transformación utilizando los plásmidos pCAMBIA2301 y pUC19 con pZPY112, respectivamente, utilizando nuestro protocolo publicado [2, 15].

Ensayos antibacterianos y ensayos de crecimiento bacteriano

Estos ensayos se realizaron de acuerdo con nuestro protocolo publicado [15]. Nanopartículas de oro, que se sintetizaron utilizando filtrados celulares de 24 h y 1 h de incubación con HAuCl ₄ 1 mM solución a 28 ° C (pH 5,5), se utilizaron para todos los ensayos biológicos. Para los ensayos de disco de papel, se utilizaron cantidades crecientes de AuNP polidispersas (0,249, 0,498, 0,747, 0,996, 1,245 μg). A partir de cultivos frescos durante la noche de cada cepa bacteriana, se esparció una alícuota de 25 μl en placas de agar LB. Se prepararon series de diluciones de la solución de nanopartículas utilizando una solución de AuNP de concentración 31.121 mg / L y agua desionizada estéril. Se colocaron discos de papel estériles de 5 mm de diámetro con una cantidad creciente de nanopartículas de oro en cada disco, como 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 y 1,245 μg (en un volumen total de 40 μl) en las placas bacterianas y se incubaron. A. tumefaciens Las placas se incubaron a 28 ° C durante 48 h y E. coli a 37 ° C durante 12 h. Para los ensayos de crecimiento de DH5α y LBA4404, se complementaron 7,5 ml de cultivo bacteriano con 2,5 ml de AuNP.

Ensayo antifúngico

Suspensión acuosa de M. oryzae las esporas se produjeron a 6,1 × 10 ⁵ esporas / ml con un hemocitómetro. Se esparcieron 150 µl de esta suspensión en una placa MEA. Se colocaron discos de papel estériles de 5 mm de diámetro con cantidades crecientes de AuNP polidispersas (0,249, 0,498, 0,747, 0,996 y 1,245 µg) sobre las placas y se incubaron a 28ºC. Las zonas de inhibición se midieron después de 2 días.

Ensayo antimicrobiano para células bacterianas tratadas con AuNP

El cultivo de LBA4404 líquido durante la noche se trató con un volumen igual de suspensión de AuNP (15,56 mg / L) durante 12 h a 28 ° C. Se mezclaron 50 μl de la suspensión con un volumen igual de solución de azul tripán al 0,4% (0,5 g de azul tripán, 500 ml de glicerol, 450 ml de H2 destilada ₂ O, 50 ml de HCL) bajo microscopio compuesto (Leica DMLS, Alemania).

Ensayo de germinación de esporas de hongos en presencia de AuNP

Se hizo una serie de diluciones de nanopartículas con 20, 40, 60, 80 y 100% de v / v utilizando una solución madre de nanopartículas de concentración 15,56 mg / L haciendo que el volumen final sea de 100 μl con agua. Se agregaron volúmenes iguales de estas suspensiones a 50 μl de Alternaria solani suspensión de esporas (4,2 × 10 ⁵ esporas / ml) y se incubó a 28 ° C. Las esporas se observaron a las 0, 2, 4 y 6 h bajo microscopio compuesto (Leica DMLS, Alemania).

Ensayos de cometas

Las propiedades apoptógenas de los AuNP se midieron mediante ensayo cometa estándar [19] con pocas modificaciones. Las hojas de tabaco o tomate se expusieron a concentraciones crecientes (0, 15, 20 y 30% v / v para el tabaco; 5, 10, 15 y 20% v / v para tomate) de AuNP (15,56 mg / L de stock) durante 24 h. La electroforesis de núcleos aislados se realizó a 0,74 V / cm (25 V, 300 mA) durante 30 min a 4ºC. Los portaobjetos se neutralizaron con tampón Tris 0,4 M, se deshidrataron en metanol, se tiñeron con bromuro de etidio (20 μg / ml) y se observaron al microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 515 a 560 nm y filtro de barrera de 590 nm. Los datos se analizaron con el software Tritek CometScore.

SDS-PAGE

Las proteínas se aislaron de acuerdo con nuestra publicación [15]. Para el análisis de las proteínas unidas a las nanopartículas, las AuNP se lavaron con agua estéril y se hirvieron en tampón Laemmli durante 10 min y se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min. Las muestras tratadas con SDS y sin tratar se procesaron en SDS-PAGE al 12%.

Cultivo de líneas de células cancerosas

La línea celular Sarcoma 180 se cultivó en medio RPMI 1640 [20] que contenía suero bovino fetal al 10%, 200 U / ml de penicilina y 200 μg / ml de estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO ₂ en incubadora humidificada.

Entrega del complejo de ADN plasmídico-AuNP en las células cancerosas

El plásmido se aisló de DH5α que contenía pCAMBIA1302 utilizando el protocolo publicado [15]. El plásmido que contiene la construcción de gfp La secuencia clonada bajo el promotor pCaMV35s se entregó en células de Sarcoma 180 utilizando un protocolo estándar [21]. Las células se observaron al microscopio de fluorescencia utilizando un filtro específico para GFP (excitación máxima =395 nm) (Axioskop-40, Carl Zeiss). Las células tratadas con ADN plasmídico desnudo se mantuvieron como control.

Ensayo hemolítico

El ensayo hemolítico se realizó siguiendo el protocolo estándar [22]. Volúmenes iguales de eritrocitos (1,6 × 10 ⁹ eritrocitos / mL) con concentraciones variables de AuNPs (0.1, 0.5, 1, 5, 10 y 20 μl / mL de una reserva de 15.56 mg / L) durante 1 hy se calcularon las actividades hemolíticas de las nanopartículas a diferentes concentraciones.

Resultados y discusión

Biosíntesis de AuNP a pH 5,5

Durante la síntesis, la formación de AuNP está indicada por el cambio de color del filtrado celular de amarillo claro a violeta [23] debido al cambio en la resonancia del plasmón de superficie (SPR). HAuCl ₄ 1 mM La solución sin filtrado fúngico era de color amarillo verdoso (Fig. 1a, "A") y el filtrado celular de T. crassum que era de color amarillo pálido (Fig. 1a, "B"). Después de la incubación, el color de la mezcla cambió a violeta en 1 h (Fig. 1a, "C"), lo que indica la formación de AuNP.

Biosíntesis de AuNP con Tricholoma crassum y análisis espectroscópico. un Cambio de color durante la reacción. A Solución 20 mM de HAuCl ₄ . B Filtrado celular libre de micelios de Tricholoma crassum . C HAuCl ₄ 1 mM con un filtrado celular de 24 h durante 1 h que muestra un color violeta que indica la síntesis de AuNP. b Espectros UV-vis de las AuNP sintetizadas con diferentes periodos de incubación (24, 48, 72 h). La flecha sólida muestra el pico de absorción a 552 nm durante un período de incubación de 24 h. La flecha punteada muestra un ligero desplazamiento hacia el rojo de los máximos de absorción con un aumento en el período de incubación. c AuNPs sintetizados bajo diferentes pH mostrando diferentes colores. d Espectros UV-vis del mismo. La flecha sólida muestra el pico de absorción a 552 nm para pH 5,5 y la flecha discontinua indica el cambio al azul de los máximos de absorción con un aumento del pH

Un inconveniente de otros métodos de producción de nanopartículas a partir de microorganismos es que consumen mucho tiempo y los organismos producen toxinas. Anteriormente, Phanerochate chrysosporium Se utilizó extracto libre de células para producir AuNP en 90 min [3]. Recientemente, se biosintetizaron nanopartículas de plata y oro usando Sporosarcina koreensis utilizando un tiempo de reacción extendido de 1 a 2 días [24]. En nuestro informe, el tiempo de producción de AuNP se ha reducido a solo 1 h.

Espectroscopia ultravioleta a visible

Los espectros de absorción óptica de las nanopartículas metálicas se rigen por la forma, la agregación y el SPR, que cambian de acuerdo con el tamaño y la forma de las partículas [25, 26]. La Figura 1b muestra los espectros UV-vis de AuNP sintetizados utilizando filtrados celulares producidos durante 24, 48 y 72 h, seguido de 1 h de incubación con HAuCl ₄ 1 mM. solución (pH 5,5). Aquí, el pico de absorbancia está a 552 nm para el filtrado celular de 24 h. La banda de resonancia de plasmón transversal que aparece primero a 552 nm se desplaza ligeramente hacia el rojo de 24 a 48 y 72 h (mostrada como línea continua frente a línea discontinua, Fig. 1b), confirmando un desplazamiento hacia el rojo con intensidad de absorbancia progresivamente amplificada. El ensanchamiento de los picos indica que las partículas están polidispersas. El fuerte SPR centrado en ca. 550–560 nm es típico del oro coloidal (fig. 1b). A medida que la concentración del filtrado celular aumentó con el aumento de los períodos de incubación (es decir, 24, 48, 72 h), la absorbancia también aumentó proporcionalmente. Cuando la reacción se realizó a 28 ° C, alcanzó el equilibrio después de 1 hora y se mantuvo estable durante 30 días sin evidencia de agregación probablemente debido a la capa de proteína estabilizadora. En estudios anteriores, los AuNP recubiertos con BSA no mostraron agregación [27]. Se realizaron más estudios utilizando AuNP preparados con filtrado celular de 24 h.

Biosíntesis de AuNP a diferentes espectroscopía de pH y UV-vis

Los AuNP se sintetizaron a diferentes pH de 3,5, 5,5, 7, 8 y 9 dando como resultado una coloración de rosa a violeta intenso (Fig. 1c). La espectroscopía UV-vis mostró los máximos de absorbancia y la longitud de onda de la SPR aumentó de pH 3,5 a pH 5,5 dando como resultado un desplazamiento hacia el rojo. Sin embargo, con un aumento adicional del pH de 7 a pH 9, los máximos de absorbancia y la longitud de onda de SPR disminuyeron, mostrando un desplazamiento hacia el azul (Fig. 1d). El pico a pH 9 tenía una amplitud más pequeña y un color sin cambios, lo que indica que solo se formaron pequeñas cantidades de AuNP. Al tratarse de una biosíntesis enzimática, el pH 9 probablemente inhibió la reacción enzimática necesaria para la formación de AuNP (Fig. 1d). Las nanopartículas producidas a diferentes pH no se agregaron después de 1 mes a temperatura ambiente.

Producción de AuNP utilizando diferentes temperaturas, concentraciones de sustrato y concentraciones de precursores

La optimización de las condiciones físico-químicas durante la biosíntesis es fundamental para la generación de nanopartículas funcionalmente eficientes [28]. La síntesis usando concentraciones más altas de filtrado mostró una mayor producción de AuNP con más intensidad de color y máxima absorbancia (Fig. 2a, b). Se observó un ligero desplazamiento al azul de la resonancia máxima de plasmón de superficie localizada (LSPR) para la síntesis con un filtrado de × 2 que indica un aumento de la distancia entre partículas y una disminución del tamaño del grupo [29, 30].

Biosíntesis y espectroscopia UV-vis de AuNP de Tricholoma crassum utilizando diferentes parámetros de síntesis. un , b Diferentes concentraciones de filtrado celular. c , d Diferentes concentraciones de HAuCl ₄ . e , f Diferentes temperaturas de reacción. g , h En la oscuridad y bajo la luz. La flecha sólida muestra el pico de absorción típico a 552 nm para el filtrado celular × 1 y HAuCl ₄ 1 mM a 28 ° C pH 5,5 y la flecha punteada indica el cambio azul de los máximos de absorción, la flecha punteada muestra el cambio rojo en la banda SPR

De las tres concentraciones de cloruro de oro probadas (0,5, 1 y 2 mM), la síntesis fue máxima para 1 mM, con un máximo de absorción a 552 nm. (Figura 2c, d). Se encontró que 28 ° C era óptimo para la síntesis. Las temperaturas más altas (75 y 100 ° C), aunque mediaron una síntesis más rápida de AuNP, el color oscuro y el corrimiento al rojo del máximo de absorción (Fig. 2e, f) indicaron partículas más grandes que a 28 ° C. A 0 y 15 ° C, no hubo desarrollo de color ni pico de absorbancia dentro de 550–600 nm. La síntesis a la luz dio como resultado una coloración violeta profunda (Fig. 2g) y un corrimiento al rojo del máximo de absorción con un pico ancho (Fig. 2h) que significa partículas más grandes. El tamaño y número de partículas se evaluó con DLS (Fig. 3a-j). Esta variación en el tamaño y la agregación de las nanopartículas depende de la naturaleza y la cantidad de materia orgánica asociada [30] que nuevamente varía con las condiciones de síntesis.

DLS que muestra distribuciones de tamaño de los AuNP sintetizados a con × 1 filtrado sin células, HAuCl4 1 mM a 28 ° C en la oscuridad, b bajo la luz, c con filtrado sin células × 0,5, d con filtrado sin células × 2, e a 0 ° C, f a 15 ° C, g a 75 ° C, h a 100 ° C, i con HAuCl ₄ 0,5 mM y j con HAuCl ₄ 2 mM

Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM)

SEM mostró AuNP de tamaños pequeños y formas geométricas distintas con un aumento de × 80000 (Fig. 4a). El análisis TEM mostró claramente AuNP polidispersas en el rango de tamaño de 2 a 22 nm de diámetro (Fig. 4b). El gráfico de distribución de tamaño muestra que los AuNP del rango de tamaño de 5 a 10 nm fueron de la frecuencia más alta, seguidos sucesivamente por 2 a 5 nm, 10 a 15 nm, 15 a 20 nm y 20 a 22 nm (figura 4c). Estos eran de diferentes formas geométricas, como pequeñas circulares o romboides con un diámetro de 5 nm o menos, hexágonos, cuboides, triángulos isósceles y triángulos casi equiláteros con lados que variaban de 4,36 a 22,94 nm (Fig. 4d, e).

Microscopía electrónica de las AuNP. un SEM con un aumento de × 80.000. b TEM que muestra partículas dispersas de diferentes tamaños en un campo microscópico. c Un histograma que muestra la distribución del tamaño de partículas de los AuNP. Vista ampliada de AuNP individuales que muestran diferentes formas geométricas y sus representaciones esquemáticas con dimensiones. d Esférico (izquierda) y romboidal (derecha) de pequeño rango de tamaño. e De izquierda a derecha:hexagonal, triangular equilátero, romboidal, poliédrica y triangular isósceles

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

La Figura 5a muestra una imagen AFM de los AuNP dispersos. La vista bidimensional (Fig. 5a) muestra que las partículas tenían un grosor de superficie casi similar. Las alturas de estas partículas se visualizaron con AFM 3D de superficie única (Fig. 5b). El gráfico AFM 2D de los AuNP que se encuentran en una zona lineal aleatoria (marcada con una línea de puntos, Fig. 5c) muestra alturas que varían de 1 a 4 nm. La banda de plasmón de la superficie plana indicó que el grosor de las partículas era menor que la longitud del borde.

AFM y difracción de rayos X de las AuNP. un Imagen AFM:vista superior. b Imagen AFM:vista tridimensional. c Una imagen AFM de AuNP y un perfil gráfico para las alturas de las nanopartículas que se encuentran en la línea de puntos en el campo. d Patrón de difracción de rayos X de las nanopartículas que muestran picos típicos del oro

Estudios de difracción de rayos X (XRD)

El patrón XRD de la película delgada de las partículas reveló la presencia de solo AuNP. Un pico de difracción fuerte alrededor de 38 ° generalmente se atribuye a {111} faceta de la estructura cúbica centrada en la cara (FCC) [3]. El patrón XRD aquí mostró un pico de difracción dominante en 38,23 atribuido a la estructura de FCC. Los picos de difracción de otras cuatro facetas fueron más débiles. Los cuatro picos de difracción de Bragg distintos a 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 y 81,63 coincidían estrechamente con los de AuNP (Fig. 5d, archivo adicional 1:Tabla S1).

Cálculo de la concentración de AuNPs

Se encontró que la concentración de las nanopartículas [15] era de 15,56 mg / L para las partículas producidas con un filtrado celular de 24 h incubado con HAuCl ₄ 1 mM. .

Ensayo antimicrobiano de las AuNP utilizando bacterias y hongos patógenos

Los AuNP exhibieron fuertes actividades antimicrobianas contra bacterias humanas, así como hongos y bacterias patógenas de plantas. La actividad antimicrobiana de las nanopartículas se ensayó usando discos de papel con cantidades crecientes de AuNP, es decir, 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 y 1,245 µg. Bacterias humanas E. coli (DH5α), la bacteria fitopatógena A. tumefaciens (LBA4404) y el hongo fitopatógeno M. oryzae fueron usados. Los AuNP fueron inhibidores de todos estos microorganismos incluso en las concentraciones más bajas, y las zonas de inhibición aumentaron proporcionalmente al aumento de la concentración de partículas (Fig. 6). La Figura 6a-c muestra que las zonas de inhibición para E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) y M. oryzae , respectivamente. La Figura 6f-h muestra el gráfico de las zonas de inhibición de estos tres microbios en función de la cantidad de AuNP utilizados. El extracto de hongos solo no tuvo ningún efecto inhibidor. La tendencia comparativa de inhibición para los tres microbios indica un mayor efecto inhibidor sobre DH5α en comparación con el de LBA4404 y M. oryzae (Archivo adicional 2:Fig. S1a).

Ensayo de las propiedades antimicrobianas de las AuNP en bacterias patógenas, hongos y bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR). un , f Placas y gráficos correspondientes que muestran el ensayo de difusión en disco de las nanopartículas con zonas de inhibición crecientes para E. coli . Zonas de inhibición obtenidas en ensayos similares con b , g Agrobacterium tumefaciens . c , h Magnaporthe oryzae . d , yo MDR E. coli . e , j MDR A. tumefaciens . Todos los experimentos se realizaron con cantidades crecientes de AuNP en discos de papel; en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior:0,249 μg (20%), 0,498 μg (40%), 0,747 μg (60%), 0,996 μg (80%) y 1,245 μg (100%) de AuNP. Los datos son medias ± SE de tres réplicas. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las muestras ( P <0.05, prueba HSD de Tukey). Efecto de AuNP en la curva de crecimiento de k E. coli , l A. tumefaciens , m MDR E. coli y n MDR A. tumefaciens . Los asteriscos indican diferencias significativas para controlar ( t de Student prueba, P <0,05). o Microscopía de control A. tumefaciens células. p A. tumefaciens mostrando pérdida de integridad celular después del tratamiento con AuNPs

Ensayo de actividad antimicrobiana de AuNP utilizando bacterias patógenas humanas y vegetales resistentes a múltiples fármacos

Se prepararon plásmidos portadores de DH5α y LBA4404 resistentes a múltiples fármacos (MDR) con genes de resistencia. El MDR DH5α que portaba pUC19 era resistente a 100 µg / ml de ampicilina y 35 µg / ml de cloranfenicol. LBA4404 transformado con pCAMBIA2301 fue resistente a 25 µg / ml de rifampicina y 50 µg / ml de kanamicina. Las AuNP mostraron una potente actividad inhibidora contra MDR DH5α y MDR LBA4404 (Fig. 6d, e). Las figuras 6i, j son los gráficos que muestran el aumento de la inhibición con el aumento de la concentración de las nanopartículas. La tendencia comparativa de inhibición para las dos bacterias MDR indica mayores zonas inhibidoras para A. tumefaciens comparado con el de E. coli (Archivo adicional 2:Fig. S1b).

Ensayo de crecimiento bacteriano durante un período de tiempo en presencia de AuNP

La curva de crecimiento de DH5α tratada con AuNP fue significativamente diferente del conjunto de control (Fig. 6k, m). En los conjuntos de control de DH5α y MDRDH5α, la fase logarítmica de la curva de crecimiento comenzó dentro de las 2 h de la inoculación, mientras que en DH5α y MDR DH5α tratadas con AuNP, no se observó crecimiento hasta 6 h después de la inoculación. Las curvas de crecimiento alcanzaron la fase estacionaria después de 12 h tanto en las células de control como en las tratadas, pero el crecimiento se redujo significativamente en el caso de las bacterias tratadas. La curva de crecimiento de LBA4404 mostró el inicio de la fase logarítmica a las 4 h después de la inoculación en el grupo de control frente a las 6 h en el grupo tratado con AuNP. Se observó un efecto similar en la curva de crecimiento de MDR LBA4404 aunque en el control MDR LBA4404, la fase logarítmica comenzó en 2 h (Fig. 6l, n).

Efecto de las AuNP sobre la morfología y la viabilidad de las células bacterianas

En general, la mayoría de las nanopartículas pueden adherirse eficazmente a las membranas celulares, adsorberse y, posteriormente, afectar la integridad celular [31]. Normal A. tumefaciens las bacterias tienen forma de varilla con contornos claros (Fig. 6o). Las bacterias, cuando se incubaron con las AuNP, mostraron una morfología distorsionada, una desintegración de la membrana externa que provocó un contorno irregular y una pérdida de la integridad de la forma y el tamaño de las células (Fig. 6p). Esto está de acuerdo con lo observado previamente en E. coli células tratadas con nanopartículas de sílice [32]. Descubrimos que la incubación de células bacterianas con las nanopartículas durante períodos más prolongados mostraba una desintegración completa de las células.

Ensayo de germinación de esporas de hongos

Los AuNP fueron un potente supresor de la virulencia del hongo patógeno de las plantas Alternaria solani . El tratamiento de conidios fúngicos con dosis crecientes de AuNP durante diferentes períodos de incubación mostró una disminución gradual de las frecuencias de germinación y la longitud de los tubos germinativos (Fig. 7a). Las imágenes representativas de los conidios (Fig. 7a) y los gráficos muestran que el porcentaje de germinación (Fig. 7b) y las longitudes promedio de los tubos germinativos (Fig. 7c) que emergen de los conidios fúngicos disminuyeron al aumentar las dosis de partículas y aumentar la incubación. períodos. Por lo tanto, estos AuNP tenían una propiedad antifúngica significativa que está mediada por la supresión de la germinación de las esporas y el retraso en el crecimiento de las hifas.

Efecto de los AuNP sobre la germinación de esporas del hongo fitopatógeno Alternaria solani ; un Esporas después del tratamiento con AuNP (barra =30 μm). Filas de arriba a abajo:esporas de control seguidas de esporas tratadas con diferentes diluciones de AuNP (15,56 mg / L de stock). Columnas de izquierda a derecha:aumento del tiempo de incubación con AuNP que muestra la menor germinación a las 6 h de incubación con 100% de AuNP. b Frecuencia de germinación de esporas (%) a diferentes concentraciones de AuNP en función del tiempo de incubación. Los asteriscos indican diferencias significativas para controlar ( t de Student prueba, P <0,05). c Longitud promedio del tubo germinal a diferentes concentraciones de AuNP en función del tiempo de incubación. Los datos representan medias ± SE de tres repeticiones. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las muestras ( P <0.05, prueba de rango múltiple de Duncan). La frecuencia de germinación de las esporas y la longitud promedio del tubo germinativo disminuyeron con el aumento de las dosis de AuNP y el aumento del período de incubación

Por lo tanto, estos AuNP tienen funciones antimicrobianas en bacterias y hongos, lo que rara vez se informa para AuNP. Estos AuNP, que son tóxicos para las bacterias humanas resistentes a múltiples fármacos, se pueden utilizar en el tratamiento de MDR o enfermedades humanas relacionadas con bacterias extensivamente resistentes a fármacos (XDR) que son difíciles de tratar. Además, el efecto antimicrobiano contra fitopatógenos típicos como Agrobacterium y hongos, hace que las partículas sean adecuadas como bactericidas y fungicidas en forma de nanoagroquímicos. Esto permitiría una gestión sostenible de la pérdida de cultivos mediante la eliminación del uso excesivo e indiscriminado de agroquímicos que provocan el deterioro de la salud del suelo, la degradación del agroecosistema, la contaminación ambiental y la resistencia de patógenos [33].

Los AuNP tienen potentes propiedades apoptogénicas

El ensayo electroforético en gel monocelular o ensayo cometa es un método sensible para comparar los efectos apoptoicos de los materiales [34, 35]. El tratamiento de las células de la hoja de tabaco con 7,78 mg / L de AuNP durante un período de 15, 20 y 30 minutos resultó en un aumento gradual de la apoptosis indicado por un aumento en el porcentaje de ADN en la cola (Fig. 8a, 'A', 'B' , 'CD'). La migración máxima de ADN se produjo después de 30 minutos de tratamiento mostrando un valor de ADN de la cola de 28,44 ± 0,74% que fue significativamente mayor que el de las células de control sin tratar (1,7 ± 0,59%). Los períodos de incubación de 15 y 20 min causaron menos migración de ADN con valores de ADN de la cola de 7,25 ± 2,56 y 19,19 ± 1,54%, respectivamente (Fig. 8b). Por tanto, estos AuNP tienen la capacidad de inducir apoptosis en células eucariotas en dosis más altas. Recientemente, las nanopartículas se están utilizando en estrategias novedosas para atacar y destruir las células cancerosas. Como lo ilustran las imágenes dinámicas y cuantitativas, la aplicación exitosa de nanopartículas como terapia alternativa para el cáncer depende de las propiedades apoptóticas de las partículas [36]. Por lo tanto, el presente hallazgo muestra potentes propiedades apoptogénicas de estos AuNP, lo que es prometedor en la futura terapia contra el cáncer.

Ensayo de propiedades apoptóticas de las AuNP. un Ensayo de cometa e imágenes microscópicas fluorescentes de núcleos de hojas de tabaco tratadas con AuNP para A 0 min. B 15 min, C 20 min y D 30 min (bar =5 μm). En los conjuntos de control (incubación de 0 min), la mayor parte del ADN se encuentra en la cabeza del cometa, mientras que las células sometidas a un tratamiento más prolongado muestran un daño en el ADN cada vez mayor y colas de cometa más largas. b Media del% de ADN de la cola ± SE después de diferentes períodos de incubación. Los datos representan medias ± SE de tres repeticiones. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las muestras ( P <0.05, prueba HSD de Tukey). c Ensayo de dosis umbral de AuNP para apoptosis que muestra imágenes de núcleos de células de hojas de tomate tratadas con A 0% (control), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% de suspensión de AuNP durante 24 h (bar =10 μm). d Porcentaje medio de ADN de la cola ± SE después de 24 h de tratamiento con diferentes concentraciones de AuNP. Los datos representan medias ± SE de tres repeticiones. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las muestras ( P <0.05, prueba HSD de Tukey). Las dosis inferiores al 10% muestran un daño insignificante en el ADN, mientras que las superiores al 20% muestran el inicio del daño en el ADN

Estos AuNP no son apoptógenos en dosis más bajas

La aplicación segura de nanopartículas metálicas como agente terapéutico requiere una determinación previa del efecto biológico de las partículas en el límite de la toxicidad [37]. Se obtuvo un nivel umbral de nanopartículas requerido para la apoptosis mediante el tratamiento de células de hojas de tomate con diferente concentración de AuNP durante 24 h (Fig. 8c). Concentración baja, por ejemplo, 5% v / v de la suspensión madre de AuNP (15,56 mg / L) no mostró un efecto apoptogénico significativo en las células de tomate incluso después de 24 h de exposición. Los núcleos después del tratamiento con AuNP al 10% mostraron un porcentaje de 6,52 ± 0,63 de ADN en la cola, que fue mayor que los núcleos de control sin tratar (0,95 ± 0,66 por ciento de ADN en la cola) y los tratados con una suspensión de AuNP al 5% (1,04 ± 0,89 por ciento de ADN en la cola). ). El tratamiento de las células de la hoja de tomate con AuNP al 15 y al 20% dio como resultado un ligero aumento en el daño del ADN mostrando 7,15 ± 1,70 y 13,47 ± 2,16 por ciento de ADN en la cola, mostrando un efecto apoptogénico significativo (Fig. 8d). Por lo tanto, en dosis más bajas, el efecto apoptogénico es insignificante, ya que existe la posibilidad de que estas nanopartículas se utilicen como agente antimicrobiano o vehículo de administración de fármacos / genes en células eucariotas.

Los AuNP están recubiertos de proteínas

Algunos estudios anteriores han mencionado nanopartículas recubiertas con proteína de origen natural [15]. La TEM de menor aumento mostró que las AuNP están rodeadas por material similar a una proteína (Fig. 9a, b). Para confirmar la naturaleza del material, las AuNP se lavaron y se procesaron en SDS-PAGE junto con extractos libres de células en otros carriles (Fig. 9c). Hervir en SDS sirvió para separar las proteínas unidas a la superficie de las nanopartículas. Las nanopartículas hervidas (carril 4) mostraron la presencia de una única banda intensa de 40 kDa que era similar a una banda de proteína presente en el carril 2 (filtrado celular). Sin embargo, en la muestra que no se hirvió (carril 3), se observó una débil banda de proteína unida a AuNP al nivel de 116 kDa. Aunque apareció otra banda tenue al nivel de 40 kDa debido a la disociación de las proteínas de protección de las partículas. Se sabe que las capas proteicas promueven la estabilidad de las nanopartículas en solución y su actividad catalítica [28, 38]. La capa de proteína formada naturalmente alrededor de las nanopartículas las hace funcionalmente eficientes para usos biomédicos, incluida la fácil adsorción y administración de ADN o fármacos hidrófobos [39]. Los péptidos y la administración de AuNP asistida por proteínas se han utilizado con éxito para superar la barrera hematoencefálica en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central [14]. Por lo tanto, estos AuNP biocompatibles pueden ser potencialmente adecuados para varias aplicaciones biomédicas debido a su pequeño tamaño, propiedades físico-químicas únicas y otras ventajas.

Análisis de la capa de proteína. un , b Imágenes TEM que muestran la capa de proteína de cobertura (flechas) alrededor de las AuNP. c SDS-PAGE de proteína extracelular secretada por T. crassum y proteína asociada a nanopartículas. Carril 1, marcador de tamaño molecular. Carril 2, proteína extracelular total. Carril 3, las nanopartículas cargadas sin hervir muestran una banda de proteína débil unida a las AuNP en la marca de 116 kDa. También hay una banda de proteína desprendida en la marca de 40 kDa. Carril 4, nanopartículas después de hervir con tampón de carga de SDS al 1% que muestra la desaparición de la banda de 116 kDa y una banda distinta de 40 kDa. La flecha indica 40 kDa

Los AuNP podrían administrar el gen de la proteína de fluorescencia verde (GFP) en líneas celulares de cáncer de Sarcoma 180

ADN plasmídico pCAMBIA1302 que alberga gfp Se usó un gen marcador, complejado con AuNP, para tratar las células del Sarcoma 180. Las células produjeron fluorescencia verde que indica la captación del complejo ADN plasmídico / AuNPs y la expresión posterior del gen en la célula cancerosa, mientras que las células tratadas solo con ADN plasmídico desnudo no mostraron fluorescencia (Fig. 10a, b). Esto confirma el alto potencial de estas partículas para no solo entregar genes a las células cancerosas, sino que los genes se expresaron de manera estable y permanecieron funcionales una vez administrados a las células.

Entrega de genes usando AuNP en células cancerosas de Sarcoma 180 y ensayo de hemólisis con eritrocitos humanos; imagen microscópica de fluorescencia de a células cancerosas que expresan proteína de fluorescencia verde después de la captación del complejo ADN-AuNP y b células de control tratadas con ADN plasmídico libre (barras =20 μm). c Porcentaje de hemólisis con diferentes diluciones de AuNP. Los datos representan medias ± SE de tres repeticiones. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las muestras ( P <0.05, prueba HSD de Tukey)

Se ha demostrado que las nanopartículas metálicas anteriores exhiben un inmenso potencial terapéutico en el tratamiento de una variedad de enfermedades como la neovascularización retiniana, el VIH, el linfoma de Dalton y exhiben actividad contra el virus de la hepatitis, el virus sincitial respiratorio y el virus del herpes simple [18]. En congruencia con estos informes, la administración de fármacos basada en nanoportadores de oro en el presente estudio que utiliza AuNP puede considerarse como un mediador prospectivo en numerosas aplicaciones médicas, incluidos el diagnóstico, la administración de fármacos y la terapéutica del cáncer.

Compatibilidad de las AuNP con eritrocitos humanos y ensayo de toxicidad

Los eritrocitos son un modelo simple y conveniente del sistema de membrana celular y se utilizan para estudiar las interacciones entre las nanopartículas y la membrana [40]. El ensayo hemolítico aclara la actividad lítica de la membrana de las AuNP a diferentes concentraciones. La Figura 10c muestra que la actividad lítica de la membrana de las nanopartículas era insignificante a bajas concentraciones. La actividad hemolítica más alta encontrada en concentraciones más altas de suspensión de nanopartículas (hasta 20 μl / mL) fue menos del 8%, lo que indica una toxicidad sanguínea muy baja. La actividad hemolítica que aumenta gradualmente con una concentración creciente de AuNP se debe probablemente a una mayor afinidad y adhesión de un mayor número de partículas con los eritrocitos. Se espera que esta afinidad de las partículas por las membranas celulares facilite su transporte celular. La baja actividad hemolítica junto con la captación celular eficaz hacen que las nanopartículas sean muy adecuadas para el desarrollo de agentes teranósticos seguros y eficientes [41].

Conclusiones

El uso de hongos micorrízicos comestibles para sintetizar AuNP de diferentes formas geométricas en un tiempo de reacción corto con una capa de proteína natural hace que este método sea simple y único. La capa de proteína proveniente del hongo comestible no tuvo efectos tóxicos apreciables y favoreció la fácil adhesión del ADN a la superficie de las partículas. En general, estos AuNP se muestran prometedores como agentes antimicrobianos y apoptóticos para la entrega de genes en las células cancerosas.

Dado que los hongos filamentosos pueden resistir la presión del flujo o la agitación [15], T. crassum pueden cultivarse en fermentadores para producir AuNP a gran escala utilizando desechos agrícolas no tóxicos, lo que permite una fácil extracción del producto y las opciones de reposición del sistema [2]. Dado que los AuNP tienen diferentes formas geométricas, existe el surtido basado en la forma del osciloscopio con medios mecánicos como la centrifugación [42] y se pueden utilizar de acuerdo con sus propiedades específicas basadas en la forma.

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