Investigación de ROS y arresto del ciclo celular en efectos genotóxicos de nanoestructuras núcleo-oro/capa-plata

Resumen

Para entender la genotoxicidad inducida en hígado por nanopartículas de plata (AgNPs) e iones plata, se usó una nanoestructura ingeniero núcleo nanobarra oro/capa plata (Au@Ag NR) y células hepatocito humanizadas HepaRG. Se investigó la implicación de estrés oxidativo y arresto del ciclo celular en daño ADN y cromosómico inducido por 0,4–20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR mediante ensayo cometa, ensayo γ-H2AX y prueba micronúcleo. Además, se analizó la distribución de Au@Ag NR. Resultados demostraron que tanto Ag⁺ como Au@Ag NR causaron rotura ADN y daño cromosómico (clastogenicidad) en células HepaRG, y Au@Ag NR retenido en núcleo puede liberar más Ag⁺, agravando daños, causados principalmente por arresto ciclo celular y formación ROS. Resultados revelan correlación entre acumulación intracelular, liberación iones Ag⁺ y potencial genotoxicidad de AgNPs.

Introducción

Las nanopartículas de plata (AgNPs), 1-100 nm, exhiben amplio espectro propiedades antimicrobianas penetrando patógenos e inactivando grupo sulfhidrilo interno de enzimas metabólicas. Demostraron potentes efectos bacteriostáticos y bactericidas en Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, y se emplean ampliamente como recubrimientos médicos, productos domésticos y apósitos. Evidencia convincente muestra nanopartículas capaces de entrar núcleo e interferir síntesis y transcripción ADN. En estudio previo, reportamos que dosis intravenosa única 5 mg/kg AgNPs introdujo rotura cromosómica notable en células médula ósea ratas Sprague-Dawley. Inyección intraperitoneal única 10 mg/kg o más AgNPs indujo daño ADN y cromosómico. Flower et al. sugirieron AgNPs a 50 y 100 µg mL⁻¹ disparan daño ADN en cinco minutos, destacando genotoxicidad de plata liberada rápidamente. Considerando riesgo exposición excesiva, investigación de nanogenotoxicología o daño ADN y potencial carcinogénico de nanomateriales ingenierados ha recibido mucha atención.

Mecanismos principales para lesiones genéticas inducidas por AgNPs: sobreproducción especies reactivas oxígeno, inflamación, perturbación ciclo celular. Estudios previos sugieren AgNPs podrían interactuar directamente con ADN vía daño oxidativo e interferir en interfase a nivel ADN y mitosis a nivel cromosómico, o interactuar con nucleoproteína y aparato huso mitótico perturbando puntos control ciclo celular. Sin embargo, si genotoxicidad por AgNPs es parcialmente atribuible a nanopartículas o completamente a iones Ag⁺ liberados sigue sin clarificar.

Investigar genotoxicidad AgNPs es difícil por liberación inestable e ininterrumpida de plata en tejidos, dificultando localizar AgNPs y diferenciar nanonúcleo de Ag. Nuestro grupo desarrolló recientemente nanoestructura núcleo nanobarra oro/capa plata (Au@Ag NR) para estudiar toxicidad inducida por nanopartículas. Núcleo oro Au@Ag NR es fisiológicamente inerte en tejido y sirve como estándar interno para monitorear liberación iones Ag⁺ de la barra monitorizando cambio relación Ag/Au, medido por espectrometría masas plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Por este método, diferentes orígenes toxicidades pueden identificarse. Estudios previos mostraron iones Ag⁺ liberados de capa Au@Ag NR resultaron en daño oxidativo riñón y eventualmente cambios morfológicos e deterioro función filtración glomérulo. Jiang et al. sugirieron que tanto actividad específica partícula como liberación intracelular iones plata por Au@Ag NR contribuyen respuesta tóxica células granulosa. También adoptamos Au@Ag NR como modelo para estudiar genotoxicidad in vivo de AgNPs y demostramos que clastogenicidad, no mutagenicidad, es forma primaria genotoxicidad inducida por tanto capa Ag como iones Ag⁺ liberados, sin diferencia en patrones toxicidad.

Hígado es órgano mayor propenso a acumulación AgNPs y reconocido órgano diana para genotoxicidad inducida AgNPs. Estudio previo mostró que algo de plata (8,26±3,90 µg/g) y oro (80,07±64,72 µg/g) permanecieron en hígados ratas SD ocho semanas tras administración intravenosa una dosis Au@Ag NR. En este estudio, intentamos identificar roles de arresto ciclo celular y estrés oxidativo reactivo en daños cromosómicos y ADN inducidos AgNPs usando Au@Ag NR en células HepaRG derivadas hepatoma humano. Ensayos genotoxicidad, incluyendo ensayo cometa, γ-H2AX y prueba micronúcleo, se realizaron en paralelo con scavenger radicales oxidativos para sondear contribución ROS en daño ADN/cromosoma, mientras apoptosis celular, ciclo celular y proteínas relacionadas determinadas para explorar mecanismos por cuales AgNPs interrumpen síntesis y replicación ADN. Además, acumulación y distribución intracelular Au@Ag NR investigada combinando ICP-MS y microscopía electrónica transmisión (TEM) para diferenciar papel nanopartículas e iones Ag liberados.

Materiales y métodos

Cultivo y tratamiento celular

Línea celular hepatoma humano HepaRG (Thermo Fisher Scientific) usada. Células cultivadas en RPMI 1640 con 10% suero fetal bovino (FBS, origen Australia, Gibco) y 1% penicilina-estreptomicina-glutamina (Gibco) en atmósfera humidificada 5% CO₂ a 37 °C. Células tratadas con concentraciones crecientes Au@Ag NR por 24 h o 72 h, concentraciones determinadas según IC₅₀ estimado por ensayo viabilidad. Para investigar papel ROS en genotoxicidad, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC, Sigma-Aldrich) aplicada 1 h previo a tratamiento Au@Ag NR.

Ensayo viabilidad/crecimiento celular ATP

Células sembradas en placa 96 pozos a densidad 5×10³/pozo. Tras 24 h incubación, medio aspirado y células expuestas a diferentes concentraciones Au@Ag NR por 24 h o 48 h. Espectro amplio concentraciones preparado, cuatro pozos por tratamiento en un período. Citotoxicidad Au@Ag NR examinada por ensayo trifosfato adenosina (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0, Promega), que mide actividad metabólica cuantificando ATP, parámetro metabolismo importante en células viables. Señales luminescentes, que reflejan cantidad células viables, detectadas lector placa VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer), y valores IC₅₀ estimados como concentración Au@Ag NR para viabilidad mitad-máxima por Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA). Ratio viabilidad calculado: % = RLU_muestra / RLU_control × 100%, donde RLU unidad luz relativa media cuatro pozos, RLU_control células sin nanobarras, RLU_muestra células tratadas diferentes concentraciones Au@Ag NR.

Determinación concentración plata y oro en células

Muestras celulares digeridas en ácido nítrico usando sistema digestión microondas. Tras digestión, muestras preparadas con mezcla 1% ácido nítrico y ácido clorhídrico. Cantidades Ag y Au en soluciones determinadas por ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). Análisis TEM usado para determinar presencia Au NR y Au@Ag NR en célula. Muestras fijadas en mezcla 2,5% glutaraldehído y 2% paraformaldehído 2 h a 4 °C. Pellets celulares fijados y enjuagados tres veces en tampón fosfato (pH 7,4) y post-fijados 1% tetróxido osmio 2 h a 4 °C. Muestras enjuagadas agua destilada tres veces y deshidratadas 15 min en concentraciones etanol (50%, 70%, 90%, 100%) sucesivamente. Posteriormente, óxido propileno 1:1 y 1:3 diluciones aplicado a resina 20-26 °C 2 h. Polimerización por calentamiento graduado: 35 °C 16 h, 45 °C 8 h, 55 °C 14 h, 65 °C 48 h. Secciones ultrafinas teñidas 25 min con acetato uranilo y citrato plomo y analizadas microscopio transmisión (H-7650, HITACHI, Japón).

Ensayo cometa convencional y modificado

Células sembradas placas 12 pozos densidades 2×10⁵/pozo o 3×10⁵/pozo para tratamiento 24 h o 72 h. Peróxido hidrógeno (H₂O₂) 200 µmol expuesto células como control positivo una hora. Por muestra, dos pozos preparados para tratamiento convencional y tratamiento glicosilasa formamidopirimidina (Fpg). Ensayo cometa convencional en condiciones alcalinas (pH>13) como descrito. Para pozos Fpg, tratamiento Fpg adicional antes procedimiento desenrollado ADN, láminas sumergidas tampón enzima (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg mL⁻¹ BSA) tres veces 5 min cada. Fpg (New England Biolabs, UK) diluido 1:50.000 con tampón enzima. Aliquotas 100 mL enzima diluida añadidas cada gel en láminas microscopio e incubadas cámara humedad 37 °C 30 min. Pasos restantes mismos tratamiento convencional. Ensayos cometa triplicado. Al menos 50 células por muestra puntuadas independientemente microscopio fluorescente Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokyo, Japón), mientras Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, UK) usado analizar valor medio % ADN en cola y momento cola oliva (OTM) cada muestra.

Cuantificación focos γ-H2AX por citometría flujo y cribado alto contenido

Para cuantificación citometría flujo, células sembradas placas 12 pozos densidades 2×10⁵/pozo o 3×10⁵/pozo para 24 h o 72 h; para cribado alto contenido, placas 96 pozos densidades 6×10³/pozo o 1×10⁴/pozo. Como control positivo, 2 µM metil metanosulfonato (MMS, Sigma-Aldrich) aplicado paralelo células una hora. Células enjuagadas tampón tris-salino (TBS) y fijadas 4% paraformaldehído 15 min temperatura ambiente. Tras lavado TBS, células incubadas 50 µL metanol frío 30 min -20 °C. Células enjuagadas TBS tres veces, reactivo bloqueo (TBS 0,3% Triton X-100, 10% suero cabra) aplicado 1 h. Anticuerpo primario (ratón anti-fosfo-H2AX Ser139, Millipore) diluido 1:200 reactivo bloqueo e incubado células overnight 4 °C. Placa enjuagada TBS tres veces, anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón, Life Technologies), diluido reactivo bloqueo 1:20, añadido. Muestras mantenidas oscuridad temperatura ambiente 1 h, 2 µg mL⁻¹ (20 µL/pozo) DAPI (Invitrogen) añadido cada pozo. Fluorescencia medida citometría flujo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) o Sistema Análisis Alto Contenido (Operetta CLS, PerkinElmer). Para citometría, datos al menos 10.000 células grupo analizados, experimentos triplicado; para alto contenido, 20 campos visuales pozo y al menos cinco pozos grupo analizados.

Ensayo citoma micronúcleo bloqueo citocinesis (CBMN-cyt)

CBMN-cyt realizado según procedimiento Fenech et al. Células sembradas placas 12 pozos densidades 2×10⁵/pozo o 3×10⁵/pozo para 24 h o 72 h. 0,2 µg mL⁻¹ Mitomicina C (MMC, Tokyo Chemical Industry, Japón) expuesto células control positivo 24 h. 3 µg mL⁻¹ citochalasa B aplicada tras tratamiento 24 h o 72 h para bloquear citocinesis, células cosechadas tras 40 h. Muestras teñidas 5% Giemsa tras hipotonicidad con 0,075 mol L⁻¹ KCl precalentado y fijación mezcla 3:1 metanol/ácido acético. Triplicado pozos grupo, al menos 1000 células binucleadas pozo examinadas.

Medición MDA, GSH total y SOD

Células cultivadas placas 12 pozos densidades 5×10⁵/pozo o 3×10⁵/pozo para 24 h o 72 h. Posteriormente, células cosechadas y enjuagadas tres veces tampón fosfato salino (PBS). Cantidades malondialdehído (MDA) homogenados determinadas método basado ácido tiobarbitúrico (Nanjing Jiancheng Bio-engineering, Nanjing, China). Cantidades glutatión total (GSH) y superóxido dismutasa (SOD) determinadas kits cuantificación glutatión total y ensayo SOD (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japón). Densidades ópticas (O.D) cada pozo medidas lector VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer).

Análisis citométrico ciclo celular

Células cultivadas placas 6 pozos densidades 1×10⁶/pozo o 5×10⁵/pozo para 24 h o 72 h, fijadas 70% etanol 4 °C overnight. Muestras enjuagadas PBS tres veces y teñidas tampón tinción PI/Rnasa (BD Biosciences) 15 min temperatura ambiente. Poblaciones células fases G0/G1, S, G2/M entre 20.000 células determinadas empleando regiones FL2 área vs FL2 ancho. Análisis citometría flujo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) y FlowJo (BD Bioscience), experimentos triplicado.

Análisis citométrico apoptosis celular

Células cultivadas placas 6 pozos densidades 1×10⁶/pozo o 5×10⁵/pozo para 24 h o 72 h. Enjuagadas dos veces PBS y diluidas 500 µL 1× tampón unión (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) ajustar suspensión ~1×10⁶ células/mL, posteriormente 100 µL dilución mezclada 5 µL FITC Annexin V y 5 µL PI. Muestras teñidas temperatura ambiente 15 min, al menos 10.000 células analizadas determinar población apoptosis temprana y tardía empleando regiones FL1H vs FL2H citometría flujo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) y FlowJo (BD Bioscience). Experimentos triplicado.

Análisis Western blot

Células cultivadas frasco 75 cm² densidades 1×10⁷/pozo y 6×10⁶/pozo para 24 h y 72 h. Células lisadas tampón RIPA con inhibidor proteasa (PMSF), concentración proteínas determinada kit cuantificación BCA (Beyotime Biotechnology, China). Concentraciones muestras ajustadas tampón RIPA previo desnaturalización calentamiento 95 °C 3 min. Muestras proteínas separadas electroforesis gel 12% SDS poliacrilamida y transferidas membranas nitrocelulosa (Millipore). Membranas bloqueadas 5% leche descremada 30 min e incubadas anticuerpos primarios p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz), β-actina (sc-47778, Santa Cruz) y secundarios cabra anti-ratón IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio). Niveles expresión proteínas diana visualizados método quimioluminiscencia mejorada (ECL) y analizados sistema ImageJ (NIH).

Análisis estadísticos

Datos presentados media ± SEM. ANOVA unidireccional usado probar significancia estadística diferencias entre control negativo y grupos tratados, seguido prueba comparación múltiple Dunnett usando SPSS (v22, IBM, Armonk, NY, USA), datos significativos P<0,05. Figuras preparadas GraphPad Prism 7 Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Resultados

Caracterización Au NR y Au@Ag NR

Nanobarras oro (Au NRs), núcleos nanobarra oro y nanoestructuras capa plata (Au@Ag NR) ingenieradas, preparadas y caracterizadas como descrito. Brevemente, diámetros y longitudes medias: 15,0±2,5 nm, 66,7±2,5 nm (Au NRs) y 26,2±3,0 nm, 72,7±8,9 nm (Au@Ag NRs). Espesor capa Ag ~5 nm. Potenciales zeta Au NRs y Au@Ag NRs recubiertos PDDAC dispersos agua: 37,7±1,6 mV y 52,5±1,4 mV. Relación peso Ag/Au Au@Ag NR preparada estimada 2,3. Resultados caracterización Fig. 1.

Viabilidad celular

Citotoxicidad Au@Ag NR hacia células HepaRG investigada ensayo viabilidad ATP (Tabla 1), células expuestas Au@Ag NR 24 o 48 h concentraciones 0,125-160 µg mL⁻¹. Au@Ag NR indujo efectos citotóxicos significativos manera tiempo- y dosis-dependiente tras 24 y 48 h, con % viabilidad IC₅₀ 20 µg mL⁻¹ y 6 µg mL⁻¹, ajustados software GraphPad Prism 7.0. Considerando citotoxicidad general, períodos tratamiento ajustados 24 h y 72 h, concentraciones aplicadas 0,8, 4, 20 µg mL⁻¹. Además, Au NR incluido control inerte, contenido Au grupo AuNR mismo 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR (16 µg mL⁻¹). En contraste, 1 mM NAC pretratamiento adoptado grupo Au@Ag NR+NAC control respuesta estrés oxidativo (concentración Au@Ag NR 20 µg mL⁻¹).

Distribución celular Au NR y Au@Ag NR

Distribución contenido Au y Ag en células HepaRG analizada ICP-MS. Como Tablas 2 y 3, contenido Ag aumentó manera dosis-dependiente. Sin embargo, antioxidante NAC como scavenger radicales libres puede restringir captación celular nanopartículas, observándose menor contenido Ag aunque misma concentración Au@Ag NR (20 µg mL⁻¹) aplicada este grupo. Declive relación Ag/Au 24 a 72 h indicó liberación continua Ag⁺ de capa Au@Ag NR. Además, captación celular Ag mucho mayor que Au (Tabla 4). Datos TEM mostraron mayoría Au NR y Au@Ag NR retenidos en células como aglomerados. Estructuras nanobarras claramente vistas dentro células expuestas Au NR o Au@Ag NR sin entrar núcleo (Fig. 2).

Daño ADN

Daño ADN desencadenado Au@Ag NR evaluado ensayo cometa y γH2AX (Fig. 3). Observado cometa que 0,8-20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR introdujo daño ADN significativo. Tras exposición 24 h o 72 h Au@Ag NR, tanto % ADN cola como OTM aumentaron manera tiempo- y concentración-dependiente. Además, daño ADN asociado inducción estrés oxidativo observado células tratadas 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR por ensayo cometa modificado enzima Fpg (Fig. 3a, b). Para evaluar rotura doble cadena (mayor correlación génesis cáncer), tanto células γ-H2AX-positivas como intensidades medias fluorescencia en células γ-H2AX-positivas analizadas. Tras 24 h exposición Au@Ag NR, no diferencia entre grupos en células γ-H2AX-positivas. Sin embargo, grupo 4 µg mL⁻¹ Au@Ag NR causó aumento significativo tras 72 h. Aumentos significativos intensidades fluorescencia observados todos grupos Au@Ag NR tras 72 h vs control vehículo (Fig. 3c-e, P<0,05).

Daño cromosómico

Formación micronúcleos biomarcador significativo identificar daño cromosómico, daño más crítico material genético que rotura ADN. Ratio células binucleadas conteniendo micronúcleo puntuado Fig. 4c. Au@Ag NR aumentó formación micronúcleos patrón concentración-dependiente. Tras 24 h exposición, ratios micronúcleo células tratadas 4 µg mL⁻¹ y 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR: 1,133±0,145% y 1,567±0,318%, significativamente superiores control vehículo. Tras 72 h, ratio micronúcleo 4 µg mL⁻¹: 1,767±0,233% (significativo vs control); 20 µg mL⁻¹: 2,167±0,252% (significativo vs control y vs 16 µg mL⁻¹ Au NR 0,700±0,153%). En contraste, no diferencia entre 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR+NAC y control vehículo, sugiriendo participación ROS en rotura cromosómica inducida Au@Ag NR.

Efectos Au@Ag NR en formación ROS

Para explorar papel formación ROS en daños ADN/cromosoma inducidos Au@Ag NR, estimados niveles MDA, GSH, SOD. Aumento significativo formación MDA (P<0,05) observado tras exposición 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR tanto 24 como 72 h (Fig. 5a). Además, niveles GSH y SOD en células expuestas Au@Ag NR mostraron reducción significativa (P<0,05) manera tiempo- y concentración-dependiente. Resultados sugieren desequilibrio oxidación-antioxidación generado por exposición Au@Ag NR (Fig. 5b, c).

Efectos Au@Ag NR en ciclo celular y apoptosis

Tras 72 h exposición Au@Ag NR, aumento células fase G2/M observado en 4 µg mL⁻¹, 20 µg mL⁻¹ y Au@Ag NR+NAC, con proporciones 32,63%±1,77%, 32,267%±2,17%, 32,967%±4,25%, significativamente mayores control vehículo (22,37%±0,92%) (Fig. 6a, b). Mientras tanto, apoptosis inducida Au@Ag NR observada tras 72 h, tasa apoptosis tardía células 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR y 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR+NAC: 78,90±1,19% y 70,20±4,50% (Fig. 6c, d). Au@Ag NR indujo más apoptosis tardía que temprana, y tratamiento NAC alivió tasa apoptosis tardía desencadenada Au@Ag NR.

Niveles expresión p21 y p53 detectados Western blot, patrón similar. Niveles p53 y p21 en células tratadas 4 µg mL⁻¹ y 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR aumentaron marcadamente (P<0,05) y disminuyeron significativamente en células tratadas 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR+NAC (P<0,05 vs grupo 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR, Fig. 6e-h). Sabido que p53 molécula central mediando activación punto control G2/M respuesta daño ADN, y p21 reconocido inhibidor ciclo celular dependiente p53. Así, Au@Ag NR podría interferir replicación ADN y obstaculizar reparación ADN por arresto ciclo celular.

Discusión

Actualmente, roles iones Ag⁺ liberados y AgNPs en generar genotoxicidad lejos de claros. Estudios previos nuestro grupo y otros demostraron que mientras Ag⁺ es fuente principal toxicidades, nanopartículas también altamente tóxicas. Por ejemplo, AgNPs contribuyen genotoxicidad induciendo formación radicales hidroxilo. Además, daño cromosómico más severo, estrés oxidativo y apoptosis introducidos por AgNPs vs Ag⁺ solo, sugiriendo diferentes vías involucradas. Empleamos Au@Ag NR modelo entender formas y distribuciones AgNPs en células, y cantidades Ag y Au intracelulares determinadas ICP-MS. Relación peso Ag/Au Au@Ag NR preparada estimada 2,3. Sin embargo, tras 24 h exposición, aumentó bruscamente 16,5 en células tratadas Au@Ag NR, sugiriendo gran cantidad Ag liberado capa Au@Ag NR en ese período. Al extender exposición 72 h, relación peso Au/Ag disminuyó 1,7, indicando Ag⁺ liberado de célula y nanobarra forma principal Au@Ag NR en célula en esa etapa. Por tanto, deducible que una vez Au@Ag NR entra célula, Ag⁺ se disuelve rápidamente de su capa dentro 24 h y libera gradualmente entorno extracelular, mientras Au@Ag NR se retiene en célula período más largo.

Estrés oxidativo considerado uno mecanismos toxicológicos más importantes nanopartículas. N-acetilcisteína (NAC) es tiol, agente mucolítico y precursor L-cisteína que reduce glutatión. NAC también fuente grupos sulfhidrilo células y ejerce actividad scavenger ROS interactuando con OH· y H₂O₂. En este estudio, niveles GSH y SOD disminuyeron significativamente tras exposición Au@Ag NR, mientras MDA aumentó manera concentración- y tiempo-dependiente, indicando Au@Ag NR introdujo estrés oxidativo en células.

Potenciales Ag y Au@Ag NR interferir material genético investigados serie ensayos genotoxicidad. Notable co-cultivar NAC con Au@Ag NR mejoró formación ROS, lo que respalda participación estrés oxidativo en genotoxicidad desencadenada Au@Ag NR. En este estudio, ensayos cometa y γ-H2AX confirmaron Au@Ag NR interactúa con ADN e induce daño ADN, y endonucleasa reparación Fpg incluida ensayo cometa identificar daño ADN oxidativo. Fgp reconoce pirimidinas oxidadas y elimina purinas oxidadas (ej. 8-hidroxiguanina), creando sitios apurínicos/apirimidínicos que introducen huecos hebras ADN. Rotura ADN inducida estrés oxidativo determinada posteriormente otro ensayo cometa. Mei et al. observaron AgNPs 5 nm indujeron daño ADN específico lesiones oxidativas empleando endonucleasas hOGG1, EndoIII, Fpg en ensayo cometa. Li et al. sugirieron AgNPs recubiertos PVP y sílice (15-100 nm y 10-80 nm) causaron aumento significativo rotura ADN hepatocitos ratones en presencia hOGG1 y EndoIII. Formación focos γ-H2AX, respuesta celular temprana estrés genotóxico, biomarcador más sensible y específico detectar roturas doble cadena (DSBs). Como demostrado, focos γ-H2AX en células expuestas Au@Ag NR aumentaron marcadamente 24 h, y aumento adicional 72 h. Reducción grupo 20 µg mL⁻¹ podría deberse citotoxicidad células HepaRG mayor concentración. Resultados similares observados AgNPs diferentes recubrimientos. Además, resultados sugieren Au@Ag NR induce daño cromosómico en HepaRG, tasas micronúcleo aumentaron significativamente. Consistente estudios previos, donde AgNPs aumentaron tasa micronúcleo en HaCaT y TK6. En contraste, adición scavenger NAC inhibió formación micronúcleo inducida Au@Ag NR. En conjunto, datos sugieren participación estrés oxidativo en riesgo clastogenicidad introducido AgNPs in vitro.

Estudios previos investigaron arresto ciclo celular y citotoxicidad inducida AgNPs. Al prolongar exposición, impacto AgNPs en ciclo celular y apoptosis podría intensificarse y agravar citotoxicidad y genotoxicidad. Usualmente, puntos control ciclo celular (ej. G2/M) iniciados por células experimentando daño ADN, mecanismo previene entrada mitosis (fase M). Arresto G2/M indica porcentaje creciente células detenidas fase G2 reparación ADN. Células con reparación exitosa proceden mitosis; sin embargo, daños fatales, arresto G2/M irreversible y apoptosis ocurren. Observamos Au@Ag NR detiene mayoría células HepaRG fase G2/M, induce apoptosis tardía y aumenta expresión p53 y p21, proteínas importantes regulación ciclo celular. Como p53 también induce apoptosis cuando ADN no reparado, p21 podría participar indirectamente apoptosis por arresto ciclo celular vía p53-dependiente down-regulando proteína nuclear ICBP90 replicación ADN y regulación ciclo. Además, apoptosis y arresto G2/M inducidos activación sistema p53/p21 reportados células HepG2 tras administración extractos ajo. Así, inferible daño ADN/cromosoma desencadenado estrés oxidativo facilita expresión p53 y p21, que subsecuentemente induce arresto ciclo celular. Extender período exposición Au@Ag NRs ADN/cromosoma durante replicación puede agravar genotoxicidad o apoptosis.

Conclusión

Genotoxicidad inducida AgNPs atribuible a estrés oxidativo inducido nanopartículas e iones liberados. Este estudio empleó Au@Ag NR modelo determinar distribución y comportamiento liberación Ag tras entrada nanopartículas en células. Considerando formas dispares Au@Ag NR en célula, tras exposición Ag⁺ se disuelve rápidamente capa plata. Ag⁺ y Au@Ag NR introducen citotoxicidad y genotoxicidad (clastogenicidad) en células, y Au@Ag NR retenido en núcleo puede liberar más Ag⁺ agravando daño, causados principalmente por arresto ciclo celular y formación ROS (resumido Fig. 7). Colectivamente, datos revelan correlación entre acumulación intracelular, liberación Ag⁺ y potencial genotoxicidad AgNPs.