Nanorodas de oro recubiertas de sílice y funcionalizadas con anticuerpos para diagnóstico rápido y tratamiento fototérmico de Cryptococcus neoformans

Resumen

Antecedentes

Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada. Aún hay pocas soluciones rápidas y efectivas para diagnóstico o tratamiento de infección por C. neoformans en etapa temprana en clínica. Nanorodas de oro conjugadas con anticuerpos y modificadas con sílice (GNR-SiO₂-Ab) pueden conjugar C. neoformans selectivamente. Pueden proporcionar posibilidad para tratamiento de criptococosis segura y efectivamente.

Métodos

Nanorodas de oro (GNRs) se sintetizaron según protocolo asistido por plantilla mediado por semillas. Anticuerpo anti-C. neoformans se ancló covalentemente en superficie de GNRs con agente de acoplamiento silano. Imagenología por tomografía computarizada in vitro se realizó para explorar efecto diagnóstico de GNR-SiO₂-Ab. La viabilidad celular se evaluó para confirmar efecto de terapia fototérmica de GNR-SiO₂-Ab combinado con láser infrarrojo cercano (NIR).

Resultados

GNR-SiO₂-Ab tiene aplicación potencial como agente de contraste positivo para imagenología RX/CT. Un anticuerpo puede inducir agregación mucho mayor de GNRs al unirse a superficie de células C. neoformans resultando en valores de atenuación mucho mayores que nunca. Tras irradiación, células C. neoformans sufrieron daños fototérmicos y la estructura normal de células fue destruida. La viabilidad celular se redujo significativamente comparada con células no tratadas.

Conclusiones

Nuestro trabajo confirmó que nanorodas de oro conjugadas con anticuerpos y modificadas con sílice podrían aumentar atenuación RX de células C. neoformans en imágenes CT. Y GNRs inmunes, mediados por anticuerpos, podrían aumentar efectos de terapia fototérmica inducida por NIR en células C. neoformans.

Introducción

Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada, descrita primero por Busse en 1894. La infección con la levadura encapsulada Cryptococcus neoformans puede resultar en colonización inofensiva de vías respiratorias, pero también puede llevar a meningitis o enfermedad diseminada, especialmente en personas con inmunidad mediada por células defectuosa. La criptococosis representa infección fúngica mayor potencialmente mortal en pacientes con infección severa por VIH y también puede complicar trasplante de órganos, malignidad reticuloendotelial, tratamiento con corticosteroides o sarcoidosis. La meningitis criptocócica asociada a VIH es responsable de más de 600.000 muertes anuales mundiales. La meningitis criptocócica y enfermedad diseminada eran invariablemente fatales. En 1995, Speed y Dunt reportaron tasa de mortalidad 14% entre pacientes con enfermedad criptocócica tratados con anfotericina B más flucitosina. El diagnóstico en pacientes con sospecha de criptococosis dependía de cultivo fúngico. Sin embargo, aún hay pocas soluciones rápidas y efectivas para diagnóstico o tratamiento de infección por C. neoformans en etapa temprana. Además, la mayoría de pacientes con infecciones criptocócicas no reciben tratamientos oportunos, resultando en alta mortalidad.

Entre todas las técnicas de imagen, tomografía computarizada por rayos X (CT) es una de las herramientas diagnósticas más útiles en hospitales por disponibilidad, eficiencia y costo. CT puede identificar patrones anatómicos y proporcionar información anatómica complementaria incluyendo ubicación, tamaño y diseminación de tumor en contraste endógeno. Una manifestación común de criptococosis pulmonar es presencia de nódulos o masas pulmonares solitarios o múltiples, cavitación o anomalías parenquimatosas. Estas manifestaciones son claramente detectadas por tomografía computarizada (CT). Usando imagen radiográfica, las siguientes características de meningitis criptocócica se presentan típicamente: espacios de Virchow-Robin dilatados, realce meníngeo, fisura coroidea prominente y quistes para-hipocampales. Sin embargo, criptococosis temprana no puede detectarse con imagen radiológica. Es decir, no podemos realizar tratamiento oportuno en etapa temprana. Recientemente, avances en control de forma/morfología superficial de nanomateriales de oro han demostrado gran capacidad para ingeniar su resonancia de plasmon de superficie localizado. Aquí investigamos un nanomaterial de oro a nanoescala llamado nanorodas de oro (GNRs), que pueden conjuntar selectivamente con hongos. En imagenología CT clínica, compuestos yodados son medio de contraste más usado. Sin embargo, número atómico y densidad electrónica de oro son mucho mayores que los de yodo. El oro puede inducir fuerte atenuación RX, haciéndolo candidato ideal para agentes de contraste CT. Conjugando GNRs con anticuerpos específicos, científicos potencialmente pueden objetivar y capturar imágenes de tejidos y patógenos específicos.

Anfotericina B es agente terapéutico mayor para tratamiento de enfermedad criptocócica, usado desde finales 1960s. Sin embargo, eficacia clínica de anfotericina B es limitada y exhibe nefrotoxicidad significativa. La eficacia de fármacos presentes se ve comprometida por toxicidad, resistencia a fármacos o rango inadecuado de actividad. Así, nuevos métodos terapéuticos selectivos para enfermedad criptocócica necesitan idearse. Recientemente, tratamientos fototérmicos se usan extensivamente para objetivar y destruir células cancerosas, virus y bacterias. Comparado con regímenes terapéuticos tradicionales, el mecanismo de tales agentes terapéuticos es completamente diferente. Luz láser infrarroja cercana (NIR) es método ideal de tratamiento fototérmico, que puede ser absorbida específicamente por tejidos o materiales. La luz puede penetrar efectivamente tejidos acompañando daño mínimo a tejidos normales. GNRs absorben luz en región NIR (650–900 nm), y la energía lumínica absorbida puede convertirse en energía térmica. Basado en este principio, es método ideal combinar luz láser NIR con GNRs para tratamiento. Comparado con fotosensibilizadores clásicos, GNRs tienen varias ventajas: alta sección transversal de absorción, alta solubilidad, excelente biocompatibilidad, hipotoxicidad, gran estabilidad lumínica y fácil conjugación con moléculas objetivo. Varios reportes describen cómo GNRs se usan para tratamientos fototérmicos. Carpin realizó experimento en células cáncer mama sobreexpresando gen HER2 incubadas con nanocáscaras sílice-oro conjugadas anti-HER2. Posteriormente, complejos se irradiaron con radiación NIR 808 nm. Comparado con grupo control, células fueron destruidas. Wang reportó que GNRs conjugados con anticuerpos podían seleccionar objetivo y destruir bacterias patógenas Salmonella expuestas a radiación NIR. Hubo reducción altamente significativa en viabilidad de Salmonella.

Aquí usamos nanorodas de oro conjugadas con anticuerpos y modificadas con sílice para unir específicamente células C. neoformans. Además, células unidas a complejos pueden distinguirse fácilmente en imágenes CT. Estas nanopartículas de oro se asociaron con células C. neoformans vía conjugación inmune, y lisis fototérmica causó reducción significativa en viabilidad celular. Nuestro estudio confirmó una opción nueva para diagnóstico y terapia fototérmica de C. neoformans in vitro y proporciona posibilidad para tratamiento de criptococosis segura y efectivamente.

Métodos

Materiales

Anticuerpo anti-C. neoformans se compró de Meridian Life Science (Memphis, TN, EE. UU.). Ácido cloroáurico (HAuCl₄·3H₂O) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Nitrato de plata (AgNO₃), tetraetilortosilicato (TEOS), 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTS), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), borohidruro de sodio (NaBH₄), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), poli(sodio-4-estirensulfonato) (PSS) y ácido ascórbico se obtuvieron de J & K Chemical Limited (China). Todos los químicos se usaron sin purificación adicional. Agua desionizada (grado Millipore Milli-Q) con resistividad 18,2 MΩ cm se usó en todas las preparaciones.

Síntesis de nanorodas de oro conjugadas con anticuerpo y modificadas con sílice

En experimento típico, GNRs se sintetizaron según protocolo asistido por plantilla mediado por semillas. Ruta sintética para fabricar nanorodas de oro conjugadas con anticuerpo y modificadas con sílice (GNR-SiO₂-Ab) se ilustra en Fig. 1. Veinticinco mililitros de solución GNR se centrifugaron a 12000 rpm 15 min. El sobrenadante, conteniendo principalmente moléculas CTAB, se removió, y el precipitado se resuspendió en 20 mL etanol anhidro ajustado a pH 10 con 20 µL amoníaco 28%. Tras sonicación, se añadieron 5 mL TEOS (10 mM) y todo el sistema se agitó vigorosamente 24 h. GNRs recubiertos de sílice se colectaron por centrifugación a 4000 rpm 30 min y se lavaron tres veces con agua y dos con etanol. Las muestras purificadas GNR-SiO₂ se redispersaron en 10 mL etanol para experimento posterior. Subsecuentemente, se añadieron 10 mL APTS para formar solución mixta y permitir reacción bajo reflujo a 60 °C 1 h. El resultado se lavó con agua desionizada cinco veces y secó a 60 °C 3 h en horno al vacío para obtener GNR-SiO₂-NH₂. El resultado se recubrió adicionalmente con polímero (PSS) por técnica capa a capa proporcionando grupos amina accesibles a solvente. Estas nanorodas terminadas en amina reaccionaron con ácido carboxílico de anticuerpos purificados 12–16 h en presencia de EDC, carbodiimida soluble en agua que promueve formación de enlace amida entre ácido carboxílico y amina primaria. Tras incubación, complejos nanoroda-anticuerpo se purificaron por centrifugación y resuspendieron en PBS.

Caracterización de GNR-SiO₂-Ab

Tamaño y morfología de GNR y GNR-SiO₂-Ab se caracterizaron usando microscopía electrónica de transmisión (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.), operando a voltaje acelerador 120 kV. Espectros UV-vis se midieron a 20 °C con espectrofotómetro UV-vis (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japón) equipado con cubeta cuarzo 10 mm, longitud camino luz 1 cm. Longitud onda 200–1000 nm se escaneó, ya que incluye picos absorbancia de GNRs, anticuerpo anti-C. neoformans y GNR-SiO₂-Ab. GNR-SiO₂-Ab se incubó a 4 °C 2 y 4 semanas. Longitud onda 200–1000 nm se escaneó en ambos puntos temporales.

Medición de unidades Hounsfield de GNR-SiO₂-Ab

La solución acuosa de GNR-SiO₂-Ab con diferentes concentraciones en rango 0,04–4 mg/mL se detectó directamente usando escáner CT Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, Países Bajos). Los valores de atenuación se obtuvieron del software imagenología CT.

Unión de C. neoformans a GNR-SiO₂-Ab

C. neoformans tipo A cepa H99 se obtuvo de Laboratorio Clave Shanghái Micología Médica Molecular (Hospital Changzheng Shanghái, Segunda Universidad Médica Militar, Shanghái, China). Hongos se incubaron con GNRs y complejos nanoroda-anticuerpo 1 h previo a preparación para análisis TEM. Imágenes se colectaron en instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.) operando a voltaje acelerador 120 kV.

Escaneo CT in vitro de complejos hongo-anticuerpo-nanoroda

Materiales y hongos se dividieron en tres grupos: grupo hongo (N), grupo GPR-SiO₂-Ab (G), y grupo GPR-SiO₂-Ab-unido C. neoformans (G+N). Concentración solución acuosa GNR-SiO₂-Ab fue 4 mg/mL. Para imagenología CT in vitro, soluciones de tres grupos se prepararon en tubos Ep estériles 1,5 mL. Todos escaneos CT se realizaron con sistema CT mencionado.

Efectos terapia fototérmica in vitro

Células C. neoformans incubadas con y sin GNR-SiO₂-Ab se expusieron a láser NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) por 5 min, longitud onda 808 nm e intensidad 30 mW (4 W/cm²). Imágenes se colectaron en instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.) a 120 kV. Tras irradiar, células se incubaron 2 h a 37 °C en oscuridad. Células C. neoformans incubadas con y sin GNR-SiO₂-Ab diseñaron grupos control. Viabilidad celular se determinó realizando ensayo viabilidad celular CellTiter-Glo® luminescente (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.) según instrucciones fabricante. Este ensayo viabilidad fue método homogéneo que determinó número células viables. Reacción luciferasa-catalizada entre luciferina y ATP se usó para síntesis células metabólicamente activas. Todos experimentos se repitieron seis veces y se determinaron valores medios.

Análisis estadístico

Todos análisis se realizaron usando SPSS versión 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Datos se expresan como media ± DE. Valor p < 0,05 indicó significancia estadística. Todas figuras en este artículo se obtuvieron de más de tres experimentos independientes con resultados similares.

Resultados

Síntesis y caracterización de GNR-SiO₂-Ab

Un método para GNRs recubiertos de sílice con TEOS como fuente sílice y APTS como agente acoplamiento se reportó previamente. La forma o tamaño de GPRs no cambió al conjugarse con anti-C. neoformans. Figura 2 muestra imagen TEM de GNR-SiO₂-Ab. Estas nanopartículas son 18,48 ± 2,39 nm ancho y 57,56 ± 4,57 nm largo.

Propiedad espectroscópica y estabilidad de GNR-SiO₂-Ab

Respecto a propiedad foto-física de GNR-SiO₂-Ab, Fig. 3 muestra espectros absorbancia de GNR-SiO₂, GNR-SiO₂-Ab y anticuerpo anti-C. neoformans. Espectro GNR-SiO₂ muestra dos bandas absorción: resonancia plasmon superficie transversal débil (TSPRW) ~520 nm y resonancia plasmon superficie longitudinal fuerte (LSPRW) ~808 nm. Tras conjugación con anticuerpos, TSPRW y LSPRW de GNR-SiO₂-Ab son 540 y 835 nm respectivamente. En comparación entre espectro anticuerpo y GNR-SiO₂-Ab, ambos tienen mismo pico especial ~280 nm. Esto prueba que anticuerpo anti-C. neoformans se conjugó exitosamente con GNR-SiO₂. Tras incubar 4 °C 2 semanas, TSPRW y LSPRW de GNR-SiO₂-Ab son 540 y 835 nm respectivamente. Mismos datos observados a 4 semanas. TSPRW y LSPRW de GNR-SiO₂-Ab no cambiaron tras incubar 4 semanas. Confirmó estabilidad GNR-SiO₂-Ab.

Medición unidades Hounsfield GNR-SiO₂-Ab

Las unidades Hounsfield (Hu) de GNR-SiO₂-Ab evaluadas por CT clínico. Figura 4 muestra imágenes CT en rango 0,04–4 mg/mL GNR-SiO₂-Ab. A medida que concentración GNR-SiO₂-Ab aumentaba, intensidad señal CT aumentaba continuamente. Como se muestra Fig. 3, Hu en función concentración GNR-SiO₂-Ab muestra relación lineal bien correlacionada (R² = 0,9903), descrita por ecuación típica: y = 12,52x + 11,971. Estos resultados sugieren GNR-SiO₂-Ab tiene aplicación potencial como agente contraste positivo imagenología RX/CT.

Unión células C. neoformans a GNR-SiO₂-Ab

Imágenes TEM muestran rasgo morfológico células C. neoformans y complejos hongo-anticuerpo-nanoroda. Estas células tienen diámetro 2–20 µm. Figura 5a muestra imagen TEM células C. neoformans, rodeadas por cápsula polisacárida. Estas células eran 4–6 µm diámetro sin unir estructuras. Como muestra Fig. 5b, células C. neoformans están cubiertas por muchos GNR-SiO₂-Ab agregados, tras incubar con complejos nanoroda-anticuerpo. Incubamos células hongo con GNR-SiO₂ para explorar si GNR-SiO₂ unía C. neoformans. Nuestros resultados indicaron GNR-SiO₂ dispersos como muestra Fig. 5c. Nuestro estudio muestra que células C. neoformans pueden conjugar con GNR-SiO₂-Ab selectivamente.

Escaneo CT in vitro de complejos hongo-anticuerpo-nanoroda

Realizamos análisis cuantitativo intensidad señal CT vía programa visualización estándar fabricante (Philips portal, Philips Healthcare, Best, Países Bajos). Figura 6 muestra valores atenuación RX tres grupos. Valores grupo G+N fueron significativamente mayores que grupos G y N. Además, valores atenuación RX grupo G fueron significativamente mayores que grupo N. Este resultado concuerda con hallazgos literatura previa.

Efectos terapia fototérmica in vitro

Evaluamos viabilidad celular realizando ensayo viabilidad en instrumento luminescente CellTiter-Glo®. Células sin irradiar tuvieron mayor viabilidad que células irradiadas NIR (p < 0,05). Además, viabilidad hongos fue mayor que células conjugadas con GNR-SiO₂-Ab tras irradiar NIR (p < 0,05). Adicionalmente, células tuvieron mayor viabilidad que complejos hongo-anticuerpo-nanoroda (p < 0,05). Figura 7 ilustra claramente variación viabilidad células C. neoformans con diferentes tratamientos. Tras irradiación, células C. neoformans sufrieron daños fototérmicos y estructura normal células fue destruida. Como muestra Fig. 8, células mostraron apariencias atróficas, irregulares y colapsadas. La cápsula polisacárida característica fue dañada.

Discusión

La sílice tiene muchas ventajas sobre polímeros. Los procesos preparativos son bastante fáciles, y el espesor de capa sílice puede ajustarse a tamaño y porosidad deseados. Además, sílice es extremadamente estable y biocompatible, no hincha ni cambia porosidad con cambio pH, y no es vulnerable a ataque microbiano. Adicionalmente, sílice tiene facilidad modificación superficial con variedad grupos funcionales usando química silano y reactivos organosilicio comerciales para biodireccionamiento. GNRs recubiertos sílice retienen propiedades ópticas superiores GNRs y pueden mejorar estabilidad térmica bajo irradiación alta energía. En nuestro estudio, tras recubrirse sílice y conjugarse con anticuerpo anti-C. neoformans, GNRs exhibieron corrimiento al rojo en pico resonancia plasmon superficie, debido a aumento índice refracción medio circundante. Resultados también indicaron tamaño muestra se vuelve mayor tras modificación y conjugación. Estos datos indicaron conjugación exitosa nanopartículas oro con anticuerpo anti-C. neoformans. Sin embargo, no podemos excluir posibilidad que GNR-SiO₂ posea poder especial para conjugar células tras unión con anticuerpos, y realizaremos estudio futuro. En este estudio, unimos exitosamente GNR-SiO₂-Ab a cápsula celular mediante simple reacción antígeno-anticuerpo. Además, aseguramos exitosamente que nuestros complejos objetivaran antígenos en cápsula celular.

GNRs han ganado atención amplia última década. Hainfeld et al. reportaron primero GNRs como agentes contraste RX. GNRs confieren ventajas sobre moléculas yodadas, agente contraste condicional. Debido a alto número atómico y densidad electrónica, GNRs exhiben coeficiente atenuación RX relativamente alto. Número atómico y densidad electrónica oro (79 y 19,32 g/cm³) son mayores que yodo (53 y 4,9 g/cm³). Yodo como agente contraste RX tiene efectos secundarios serios como nefrotoxicidad y reacciones alérgicas severas. Sin embargo, GNRs persisten en cuerpo mucho más que agentes contraste yodo, dando tiempo suficiente para observar imágenes. Además, GNRs pueden objetivar células cancerosas, virus y bacterias vía funcionalización superficial con variedad moléculas como péptidos o anticuerpos. Reuveni et al. mostraron que varios tipos moléculas pueden unirse superficie GNRs. En este estudio, intensidad señal CT aumentó continuamente con concentración GNR-SiO₂-Ab, resultando imágenes más brillantes. GNR-SiO₂-Ab exhibió potencial positivo significativo como agentes contraste imagenología RX/CT, como GNRs. Absorción RX nanorodas oro permaneció inafectada, incluso con modificación superficial. Estos datos indican propiedades atenuación RX GNR-SiO₂-Ab no cambiaron significativamente por modificación superficial. Esto concuerda con hallazgos literatura previa. Funcionalización superficial es herramienta poderosa que permite direccionamiento pasivo o activo GNRs a sitio específico interés. En nuestro estudio, unimos exitosamente GNR-SiO₂-Ab a cápsulas C. neoformans. Además, determinamos si estas partículas conjugadas anticuerpo podían usarse como nanoprobes para imagenología CT dirigida de células C. neoformans in vitro. Observamos imágenes CT células C. neoformans dispersas PBS parecían similares a imágenes derivadas células C. neoformans dispersas agua. Sin embargo, es difícil distinguir imágenes hongos de tejidos blandos. Un anticuerpo puede inducir agregación mucho mayor GNRs al unirse superficie células C. neoformans resultando valores atenuación mucho mayores que nunca. Así, podemos lograr atenuación RX distinguible hongos. Basado en resultados, detección C. neoformans por imagenología CT podría lograrse y traer oportunidades novedosas diagnóstico.

GNRs se han empleado ampliamente para terapia fototérmica tumor. Nuestro estudio indica GNR-SiO₂-Ab podría ser herramienta selectiva destruir células C. neoformans. Nuestros resultados confirmaron membrana celular C. neoformans sufrió destrucción irreparable y grave tras irradiación NIR. Además, viabilidad células se redujo significativamente comparada células no tratadas. Estos resultados indicaron radiación NIR sola causa muerte células C. neoformans. Sin embargo, viabilidad células incubadas con GNR-SiO₂-Ab también deprimió. En células incubadas con GNR-SiO₂-Ab y sometidas irradiación NIR, viabilidad células redujo significativamente comparada otros grupos. Nos aseguramos que GNR-SiO₂-Ab conjugado con hongos selectivamente y mejoró efectos radiación NIR. GNR-SiO₂-Ab tiene capacidad efectos terapia fototérmica selectiva en células C. neoformans. Mecanismo efecto no se reportó antes. Especulamos disrupción membrana celular probablemente inducida por muerte celular inducida irradiación. Norman et al. reportaron viabilidad Pseudomonas aeruginosa redujo significativamente cuando esta especie expuesta irradiación y unida nanorodas oro conjugadas covalentemente anticuerpos específicos. Estas células también mostraron áreas membrana celular gravemente disrutas con daño irreparable causado por exposición irradiación NIR. Cuando nanopartículas expuestas radiación NIR, membrana celular dañada debido varios factores: explosión nanopartícula, ondas choque, formación burbujas, desintegración térmica.

En este estudio, muerte o actividad reducida células C. neoformans ocurrió cuando membrana celular disintegrada y destruida por energía térmica. Sin embargo, estudios futuros deberían confirmar esta hipótesis. Células C. neoformans dañadas por: aumentos localizados temperatura, explosión nanopartícula, ondas choque, formación burbujas, desintegración térmica causada radiación NIR. En particular, células C. neoformans dañadas sustancialmente expuestas solo radiación NIR. Dos razones posibles explican cómo GNR-SiO₂-Ab dirigidas estimulan radiación NIR eliciting destrucción fototérmica células C. neoformans. Una posibilidad: en cápsula células C. neoformans, GNR-SiO₂-Ab dirigidas induce aumento localizado temperatura. Segunda posibilidad: debido reacción antígeno-anticuerpo entre GNR-SiO₂-Ab y cápsula células C. neoformans, hay cambios estructurales pared celular y cápsula. Debido tales cambios, células más sensibles hacia tratamiento fototérmico. Estudios previos confirmaron baja toxicidad nanorodas oro, y estudios futuros investigarán efecto terapia fototérmica in vivo. Lo más lamentable nuestro estudio es no discutir capacidad carga GNR-SiO₂-Ab. Estudio futuro concentrará relación capacidad carga GNR-SiO₂-Ab y efecto fototérmico.

Conclusiones

Fabricamos exitosamente GNR-SiO₂-Ab dirigido hacia células C. neoformans. Estas nanorodas de oro conjugadas con anticuerpos específicos aumentaron atenuación RX células C. neoformans en imágenes CT. Nuestros resultados indicaron GNRs inmunes, mediados por anticuerpos, aumentaron efectos terapia fototérmica inducida NIR en células C. neoformans. Además, GNR-SiO₂-Ab permitió manipulación fácil y procedimientos mínimamente invasivos en diagnóstico y tratamiento infecciones C. neoformans, enfocándose potencial aplicación clínica este enfoque.