Nanorods de oro modificados con sílice conjugada con anticuerpo para el diagnóstico y la terapia fototérmica de Cryptococcus neoformans:un experimento in vitro
Resumen
Antecedentes
Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada. Todavía hay poca solución rápida y eficaz para el diagnóstico o el tratamiento de C. neoformans Infección en una etapa temprana en la clínica. Nanorods de oro modificados con sílice conjugado con anticuerpo (GNR-SiO 2 -Ab) puede conjugar C. neoformans selectivamente. Puede brindar una posibilidad para el tratamiento de la criptococosis de manera segura y eficaz.
Métodos
Se sintetizaron nanovarillas de oro (GNR) de acuerdo con el protocolo asistido por molde mediado por semillas. Anti- C. neoformans el anticuerpo se ancló covalentemente en la superficie de los GNR con un agente de acoplamiento de silano. Se realizaron imágenes de tomografía computarizada in vitro para explorar el efecto diagnóstico del GNR-SiO 2 -Ab. Se evaluó la viabilidad de las células para confirmar el efecto de la terapia fototérmica de GNR-SiO 2 -Ab combinado con luz láser de infrarrojo cercano (NIR).
Resultados
GNR-SiO 2 -Ab tiene una aplicación potencial como agente de contraste positivo para imágenes de rayos X / TC. Un anticuerpo puede inducir una agregación mucho mayor de GNR al unirse a la superficie de C. neoformans células resultando en valores de atenuación mucho más altos que nunca. Después de la irradiación, C. neoformans las células sufrieron daños fototérmicos y se destruyó la estructura normal de las células. La viabilidad de las células se redujo significativamente en comparación con las células no tratadas.
Conclusiones
Nuestro trabajo confirmó que las nanovarillas de oro modificadas con sílice conjugadas con anticuerpos podrían mejorar la atenuación de rayos X de C. neoformans células en imágenes de TC. Y los GNR inmunes, que fueron mediados por anticuerpos, podrían aumentar los efectos de la terapia fototérmica inducida por NIR en C. neoformans células.
Antecedentes
Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada, que fue descrita por primera vez por Busse en 1894 [1]. Infección por la levadura encapsulada Cryptococcus neoformans puede resultar en una colonización inofensiva de las vías respiratorias, pero también puede provocar meningitis o enfermedad diseminada [2], especialmente en personas con inmunidad celular defectuosa. La criptococosis representa una importante infección micótica potencialmente mortal en pacientes con infección grave por VIH y también puede complicar el trasplante de órganos, la neoplasia reticuloendotelial, el tratamiento con corticosteroides o la sarcoidosis [3]. La meningitis criptocócica asociada con la infección por VIH es responsable de más de 600.000 muertes por año en todo el mundo [4]. La meningitis criptocócica y la enfermedad diseminada eran invariablemente fatales. En 1995, Speed y Dunt informaron de una tasa de mortalidad del 14% entre los pacientes con enfermedad criptocócica que fueron tratados con anfotericina B más flucitosina [5]. El estudio en pacientes con sospecha de criptococosis dependió del cultivo de hongos. Sin embargo, todavía hay poca solución rápida y eficaz para el diagnóstico o el tratamiento de C. neoformans Infección en una etapa temprana. Además, la mayoría de los pacientes con infecciones criptocócicas no reciben los tratamientos oportunos, lo que genera una alta tasa de mortalidad.
Entre todas las técnicas de imagen, la tomografía computarizada (TC) de rayos X es una de las herramientas de diagnóstico más útiles en los hospitales en términos de disponibilidad, eficiencia y costo [6]. La TC puede identificar patrones anatómicos y proporcionar información anatómica complementaria, incluida la ubicación, el tamaño y la diseminación del tumor con el contraste endógeno [7]. Una manifestación común de la criptococosis pulmonar es la presencia de nódulos o masas pulmonares solitarios o múltiples, cavitación o anomalías parenquimatosas. Estas manifestaciones se detectan claramente mediante tomografía computarizada (TC) [8]. Usando imágenes radiográficas, las siguientes características de meningitis criptocócica se presentan típicamente:espacios de Virchow-Robin dilatados, realce meníngeo, fisura coroidea prominente y quistes parahipocampales [9]. Sin embargo, la criptococosis temprana no se puede detectar con imágenes radiológicas. Es decir, no podemos realizar un tratamiento rápido en una etapa temprana. Recientemente, los avances en el control de la forma / morfología de la superficie de los nanomateriales de oro han demostrado la gran capacidad para diseñar su resonancia de plasmón de superficie localizada [10, 11]. Aquí, investigamos un tipo de material de oro a nanoescala llamado nanobarras de oro (GNR), que puede conjugarse selectivamente con los hongos. En la tomografía computarizada clínica, los compuestos yodados son el medio de contraste más utilizado. Sin embargo, el número atómico y la densidad electrónica del oro son mucho más altos que los del yodo. El oro puede inducir una fuerte atenuación de los rayos X, lo que lo convierte en un candidato ideal para los agentes de contraste para TC [7]. Al conjugar GNR con anticuerpos específicos, los científicos pueden captar imágenes de tejidos y patógenos específicos y capturar imágenes de ellos [12].
La anfotericina B es un importante agente terapéutico para el tratamiento de la enfermedad criptocócica, que se ha utilizado desde finales de la década de 1960 [13]. Sin embargo, la eficacia clínica de la anfotericina B es limitada y presenta una nefrotoxicidad significativa [14]. La eficacia de los fármacos actuales se ve comprometida por la toxicidad, la resistencia a los fármacos o un rango de actividad inadecuado [15, 16]. Por lo tanto, es necesario diseñar nuevos métodos terapéuticos selectivos para la enfermedad criptocócica. Recientemente, los tratamientos fototérmicos se utilizan ampliamente para atacar y destruir células cancerosas, virus y bacterias [17,18,19]. En comparación con los regímenes terapéuticos tradicionales, el mecanismo de tales agentes terapéuticos es completamente diferente. La luz láser de infrarrojo cercano (NIR) es un método de tratamiento fototérmico ideal, que puede ser absorbido específicamente por tejidos o materiales. La luz puede penetrar de forma eficaz a través de los tejidos que acompañan a un daño mínimo a los tejidos normales [20]. Los GNR absorben luz en la región NIR (650-900 nm) y la energía luminosa absorbida se puede convertir en energía térmica. Basado en este principio, es un método ideal para combinar la luz láser NIR con GNR para el tratamiento. En comparación con los fotosensibilizadores clásicos, los GNR tienen varias características ventajosas:sección transversal de alta absorción, alta solubilidad, excelente compatibilidad biológica, hipotoxicidad, gran estabilidad a la luz y fácil conjugación con moléculas diana [21]. Varios informes han descrito cómo se utilizan los GNR para tratamientos fototérmicos [22,23,24]. Carpin llevó a cabo un experimento en células de cáncer de mama, que sobreexpresaban el gen HER2 y se incubaron con nanocapas de oro y sílice conjugadas con anti-HER2. Posteriormente, los complejos se irradiaron mediante radiación NIR de 808 nm. En comparación con el grupo de control, las células fueron destruidas [17]. Wang informó que los GNR conjugados con anticuerpos podrían seleccionar el objetivo y destruir la Salmonella patógena. bacterias cuando se exponen a la radiación NIR. Hubo una reducción muy significativa de Salmonella viabilidad celular [19].
En este documento, utilizamos nanobarras de oro modificadas con sílice conjugadas con anticuerpos para unir específicamente C. neoformans células. Además, las células que se unen a los complejos se pueden distinguir fácilmente en imágenes de TC. Estas nanopartículas de oro se asociaron con C. neoformans las células a través de la conjugación inmune y la lisis fototérmica causaron una reducción significativa en la viabilidad celular. Nuestro estudio confirmó una nueva opción para el diagnóstico y la terapia fototérmica de C. neoformans in vitro y ofrece la posibilidad de tratar la criptococosis de forma segura y eficaz.
Métodos
Materiales
Anti- C. neoformans el anticuerpo se adquirió en Meridian Life Science (Memphis, TN, EE. UU.). Ácido cloroáurico (HAuCl 4 · 3H 2 O) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Nitrato de plata (AgNO 3 ), tetraetilortosilicato (TEOS), 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTS), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), borohidruro de sodio (NaBH 4 ), 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC), poli (4-estirenosulfonato de sodio) (PSS) y ácido ascórbico se obtuvieron de J &K Chemical Limited (China). Todos los productos químicos anteriores se usaron sin ninguna purificación adicional. En todas las preparaciones se utilizó agua desionizada (grado Millipore Milli-Q) con una resistividad de 18,2 MΩ cm.
Síntesis de nanovarillas de oro modificadas con sílice conjugada con anticuerpo
En un experimento típico, los GNR se sintetizaron de acuerdo con el protocolo asistido por plantilla mediado por semillas [25, 26, 27]. Vía sintética para fabricar nanobarras de oro modificadas con sílice conjugadas con anticuerpos (GNR-SiO 2 -Ab) se ilustra en la Fig. 1. Se centrifugaron veinticinco mililitros de la solución de GNR a 12000 rpm durante 15 min. Se eliminó el sobrenadante, que contenía principalmente moléculas de CTAB, y el precipitado se resuspendió en 20 mL de etanol anhidro ajustado a pH 10 con 20 μL de amoniaco al 28%. Después de que el sistema se sometió a ultrasonidos, se añadió TEOS de 5 ml (10 mM) y luego todo el sistema se agitó vigorosamente durante 24 h. Los GNR recubiertos de sílice se recogieron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 30 min y se lavaron tres veces con agua y dos veces con etanol. El GNR-SiO 2 purificado obtenido las muestras se volvieron a dispersar en 10 ml de etanol para experimentos adicionales [28]. Posteriormente, se agregaron 10 mL de APTS para formar una solución mixta y se dejó reaccionar a reflujo a 60 ° C durante 1 h. El resultante se lavó con agua desionizada cinco veces y se secó a 60 ° C durante 3 h en un horno de vacío para obtener el GNR-SiO 2 -NH 2 . El resultante se revistió adicionalmente con un polímero (PSS) mediante una técnica capa por capa que proporcionaba grupos amina accesibles al disolvente [29]. Se permitió que estas nanobarras terminadas en amina reaccionaran con el ácido carboxílico de los anticuerpos purificados durante 12-16 h en presencia de EDC, una carbodiimida soluble en agua que promueve la formación de enlaces amida entre el ácido carboxílico y la amina primaria [30]. Después de la incubación, los complejos nanobarra-anticuerpo se purificaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS [31].
Procedimiento sintético de GNR-SiO 2 -Ab
Caracterización de GNR-SiO 2 -Ab
El tamaño y la morfología de GNR y GNR-SiO 2 -Ab se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.), Operando a un voltaje de aceleración de 120 kV [20]. Los espectros UV-vis se midieron a 20 ° C con un espectrofotómetro UV-visible (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japón) equipado con una celda de cuarzo de 10 mm, donde la longitud de la trayectoria de la luz era de 1 cm. Se escaneó la longitud de onda de 200 a 1000 nm, ya que incluye los picos de absorbancia de los GNR, anti- C. neoformans anticuerpo y GNR-SiO 2 -Ab. El GNR-SiO 2 -Ab se incubó a 4 ° C durante 2 y 4 semanas. Se escaneó la longitud de onda de 200 a 1000 nm en los dos puntos de tiempo.
Unidades Hounsfield de GNR-SiO 2 -Medición de ab
La solución acuosa de GNR-SiO 2 -Ab con diferente concentración en el rango de 0,04 a 4 mg / ml se detectó directamente utilizando un escáner de TC Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, Países Bajos). Los valores de atenuación se obtuvieron del software de imágenes de TC.
Adjunto de C. neoformans a GNR-SiO 2 -Ab
C.neoformans La cepa tipo A H99 se obtuvo del Laboratorio Clave de Micología Médica Molecular de Shanghai (Hospital Changzheng de Shanghai, Segunda Universidad Médica Militar, Shanghai, China). Se dejó incubar los hongos con los GNR y los complejos anticuerpo-nanovarilla durante 1 h antes de prepararlos para el análisis TEM. Las imágenes se recopilaron en un instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.) Que funciona a un voltaje de aceleración de 120 kV.
Tomografía computarizada in vitro de complejos de hongo-anticuerpo-nanorod
Los materiales y los hongos se dividieron en tres grupos, que incluyen el grupo de hongos (N), GPR-SiO 2 -Ab grupo (G) y GPR-SiO 2 -Ab-adjunta C. neoformans grupo (G + N). La concentración de GNR-SiO 2 La solución acuosa de -Ab anterior fue de 4 mg / ml. Para la obtención de imágenes de TC in vitro, las soluciones de los tres grupos se prepararon en tubos Ep estériles de 1,5 ml. Todas las tomografías computarizadas se realizaron utilizando el sistema de tomografía computarizada anterior.
Efectos de fototerapia térmica in vitro
C. neoformans células incubadas con y sin GNR-SiO 2 -Ab fueron expuestos a irradiación con láser NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) durante 5 min, con una longitud de onda de 808 nm y una intensidad de 30 mW (4 W / cm 2 ). Las imágenes se recogieron en un instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EE. UU.) Que funciona a un voltaje de aceleración de 120 kV. Después de irradiar, las células se incubaron durante 2 ha 37 ° C en la oscuridad. C. neoformans células incubadas con y sin GNR-SiO 2 -Ab se diseñaron como grupos de control. La viabilidad celular se determinó realizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante [28]. Este ensayo de viabilidad celular en particular fue un método homogéneo, que podría determinar el número de células viables. La reacción catalizada por luciferasa entre luciferina y ATP se utilizó para la síntesis de células metabólicamente activas. Todos los experimentos se repitieron seis veces y se determinaron sus valores medios.
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron utilizando SPSS versión 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Los datos se expresan como media ± DE. P Se tomó un valor inferior a 0,05 para indicar significación estadística. Todas las cifras que se muestran en este artículo se obtuvieron de más de tres experimentos independientes con resultados similares.
Resultados
Síntesis y caracterización de GNR-SiO 2 -Ab
Se ha informado anteriormente de un método para GNR recubiertos de sílice con TEOS como fuente de sílice y APTS como agente de acoplamiento [30]. La forma o el tamaño de los GPR no cambió cuando se conjugaron con anti- C. neoformans . La Figura 2 muestra la imagen TEM de GNR-SiO 2 -Ab. Estas nanopartículas tienen 18,48 ± 2,39 nm de ancho y 57,56 ± 4,57 nm de largo.
un , b Imagen TEM de GNR-SiO 2 -Ab. Las nanovarillas presentaban una apariencia parecida a una varilla. La forma o el tamaño de los GPR no cambió cuando se conjugaron con anti- C. neoformans
Propiedad espectroscópica y estabilidad de GNR-SiO 2 -Ab
Respecto a la propiedad foto-física de GNR-SiO 2 -Ab, la Fig. 3 muestra los espectros de absorbancia de GNR-SiO 2 , GNR-SiO 2 -Ab y anti- C. neoformans anticuerpo. El espectro de GNR-SiO 2 muestra que GNR-SiO 2 tiene dos bandas de absorción, una longitud de onda de resonancia de plasmón superficial transversal débil (TSPRW) alrededor de 520 nm y una longitud de onda de resonancia de plasmón superficial longitudinal fuerte (LSPRW) alrededor de 808 nm. Después de ser conjugado con anticuerpos, el TSPRW y LSPRW de GNR-SiO 2 -Ab son 540 y 835 nm, respectivamente. En una comparación entre el espectro del anticuerpo y GNR-SiO2-Ab, ambos tienen el mismo pico especial alrededor de 280 nm. Este resultado prueba que el anti- C. neoformans el anticuerpo se conjugó con éxito con GNR-SiO 2 . Después de incubar a 4 ° C durante 2 semanas, el TSPRW y LSPRW de GNR-SiO 2 -Ab son 540 y 835 nm, respectivamente. Y se observaron los mismos datos a las 4 semanas. El TSPRW y LSPRW de GNR-SiO 2 -Ab no cambió después de incubar durante 4 semanas. Confirmó la estabilidad de GNR-SiO 2 -Ab.
Espectros de absorción de:GNR + SiO 2 + Ab (A), GNR + SiO 2 (B) y anti- C. neoformans anticuerpo (C). El GNR-SiO 2 tiene dos bandas de absorción, una longitud de onda de resonancia de plasmón superficial transversal débil (TSPRW) alrededor de 520 nm y una longitud de onda de resonancia de plasmón superficial longitudinal fuerte (LSPRW) alrededor de 808 nm. Después de ser conjugado con anticuerpos, el TSPRW y LSPRW de GNR-SiO 2 -Ab son 540 y 835 nm, respectivamente
Unidades Hounsfield de GNR-SiO 2 -Medición de ab
Las unidades Hounsfield (Hu) de GNR-SiO 2 -Ab según la evaluación de una TC clínica. La Figura 4 muestra las imágenes de TC en el rango de 0.04–4 mg / mL de GNR-SiO 2 -Ab. Como la concentración de GNR-SiO 2 -Ab aumentó, la intensidad de la señal de CT aumentó continuamente. Como se muestra en la Fig.3, Hu en función de GNR-SiO 2 -La concentración de ab muestra una relación lineal bien correlacionada ( R 2 =0.9903), descrito por la siguiente ecuación típica: y =12,52 x + 11,971. Estos resultados sugieren que GNR-SiO 2 -Ab tiene una aplicación potencial como agente de contraste positivo para imágenes de rayos X / TC.
Unidades Hounsfield de GNR-SiO 2 -Ab. un Imágenes de TC in vitro de GNR-SiO 2 -Ab suspendido en PBS. La concentración (mg / mL) en cada muestra se proporciona en la parte superior de la imagen respectiva. b Gráfico de atenuación de CT de GNR-SiO 2 -Ab en varias concentraciones en el rango de 0.04 a 4 mg / mL
Adjunto de C. neoformans Celdas a GNR-SiO 2 -Ab
Las imágenes TEM muestran la característica morfológica de C. neoformans células y complejos hongo-anticuerpo-nanovarilla. Estas células tienen un diámetro que varía de 2 a 20 μm. La Figura 5a muestra la imagen TEM de C. neoformans células, que está rodeado por una cápsula de polisacárido. Estas células tenían 4-6 μm de diámetro sin unirse a ninguna estructura. Como se muestra en la Fig. 5b, el C. neoformans las células están cubiertas por lotes de GNR-SiO 2 agregados -Ab, después de incubar con los complejos anticuerpo-nanovarilla. Incubamos las células del hongo con GNR-SiO 2 para explorar si GNR-SiO 2 se adjuntó a C. neoformans. Nuestros resultados indicaron que GNR-SiO 2 se dispersaron como se muestra en la Fig. 5c. Nuestro estudio muestra que C. neoformans las células pueden conjugarse con GNR-SiO 2 -Ab selectivamente.
Las imágenes TEM ilustran la interacción entre GNR-SiO 2 -Ab y C. neoformans células. un Imagen TEM de C. neoformans células. b Imagen TEM de los complejos hongo-anticuerpo-nanobarra. c Imagen TEM de C. neoformans células incubadas con GNR-SiO 2
Tomografía computarizada in vitro de complejos de hongo-anticuerpo-nanorod
Realizamos un análisis cuantitativo de la intensidad de la señal de TC a través del programa de visualización estándar del fabricante (portal de Philips, Philips Healthcare, Best, Países Bajos). La Figura 6 muestra los valores de atenuación de rayos X de los tres grupos. Los valores del grupo G + N fueron significativamente más altos que los de los grupos G y N. Además, los valores de atenuación de rayos X del grupo G fueron significativamente más altos que los del grupo N. Este resultado concuerda con los hallazgos de la literatura anterior [31].
un , b Tomografía computarizada in vitro de diferentes grupos. Los valores del grupo G + N fueron significativamente más altos que los de los grupos G y N. Además, los valores de atenuación de rayos X del grupo G fueron significativamente más altos que los del grupo N
Efectos in vitro de la terapia fototérmica
Evaluamos la viabilidad celular mediante la realización de un ensayo de viabilidad celular en un instrumento luminiscente CellTiter-Glo®. Las células sin irradiar tenían mayor viabilidad que las células irradiadas con NIR ( P <0,05). Además, la viabilidad de los hongos fue mayor que la de las células conjugadas con GNR-SiO 2 -Ab después de la irradiación NIR ( P <0,05). Además, las células tenían una mayor viabilidad que los complejos de hongo-anticuerpo-nanobarra ( P <0,05). La Figura 7 ilustra claramente la variación en la viabilidad de C. neoformans células con diferentes tratamientos. Después de la irradiación, C. neoformans las células sufrieron daños fototérmicos y se destruyó la estructura normal de las células. Como se muestra en la Fig. 8, las células mostraban apariencias atróficas, irregulares y colapsadas. La cápsula de polisacárido característica resultó dañada.
Viabilidad de células tratadas de forma diferente. Las células sin irradiar tenían mayor viabilidad que las células irradiadas con NIR ( P <0,05). Además, la viabilidad de los hongos fue mayor que la de las células en conjunción con GNR-SiO 2 -Ab después de la irradiación NIR ( P <0,05). Además, las células tenían una mayor viabilidad que los complejos de hongo-anticuerpo-nanobarra ( P <0.05)
un , b Las imágenes TEM demuestran daños fototérmicos de C. neoformans células que se conjugaron con GNR-SiO 2 -Ab. Las células mostraban apariencias atróficas, irregulares y colapsadas. La cápsula de polisacárido característica estaba dañada
Discusión
La sílice tiene muchas ventajas sobre el polímero [32]. Los procesos de preparación involucrados son bastante fáciles, y el grosor de una capa de sílice puede cambiarse al tamaño y porosidad deseados. Además, la sílice es extremadamente estable y tiene biocompatibilidad, no presenta hinchazón ni cambios de porosidad con un cambio de pH y no es vulnerable al ataque microbiano. Además, la sílice tiene facilidad de modificación de la superficie con una variedad de grupos funcionales usando la química del silano y reactivos de organosilicio disponibles comercialmente para biotargeting. Los GNR recubiertos de sílice conservan las propiedades ópticas superiores de los GNR y pueden mejorar su estabilidad térmica bajo irradiación de alta energía. En nuestro estudio, después de ser recubierto con sílice y conjugado con anti- C. neoformans anticuerpo, los GNR exhibieron un desplazamiento hacia el rojo en el pico de resonancia del plasmón superficial, debido al aumento del índice de refracción del medio circundante [32, 33]. Los resultados también indicaron que el tamaño de la muestra se vuelve cada vez más grande después de la modificación y la conjugación. Estos datos indicaron que conjugamos con éxito nanopartículas de oro con un anti- C. neoformans anticuerpo. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que el GNR-SiO 2 La herida posee un poder especial para conjugar células después de unirse con los anticuerpos, y realizaremos un estudio adicional en el futuro. En este estudio, adjuntamos con éxito GNR-SiO 2 -Ab a la cápsula celular mediante una simple reacción antígeno-anticuerpo. Además, nos aseguramos con éxito de que nuestros complejos se dirigieran a los antígenos de la cápsula celular.
Los GNR han ganado una atención generalizada durante la última década. Hainfeld y col. [34] informó en primer lugar que los GNR se pueden utilizar como agente de contraste de rayos X. Los GNR confieren varias ventajas sobre las moléculas yodadas, un agente de contraste condicional. Debido a un alto número atómico y densidad de electrones, los GNR exhiben un coeficiente de atenuación de rayos X relativamente alto. El número atómico y la densidad electrónica del oro (79 y 19,32 g / cm 3 , respectivamente) son más altos que los del yodo (53 y 4,9 g / cm 3 ) [7]. El yodo como agente de contraste de rayos X tiene muchos efectos secundarios graves, como nefrotoxicidad y reacciones alérgicas graves. Sin embargo, los GNR persisten en el cuerpo mucho más tiempo que los agentes de contraste de yodo, lo que significa que hay tiempo suficiente para observar las imágenes. Además, los GNR pueden apuntar a células cancerosas, virus y bacterias mediante la funcionalización de la superficie con una variedad de moléculas, como péptidos o anticuerpos. Reuveni y col. [31] han demostrado que se pueden unir varios tipos diferentes de moléculas a la superficie de los GNR. En este estudio, la intensidad de la señal de CT aumentó continuamente, junto con el aumento de la concentración de GNR-SiO 2 -Ab, lo que da como resultado imágenes más brillantes. GNR-SiO 2 -Ab exhibió un potencial positivo significativo como agentes de contraste para imágenes de rayos X / TC, así como GNR. La absorción de rayos X de las nanobarras de oro no se vio afectada, incluso con la modificación de la superficie. Estos datos indican que las propiedades de atenuación de rayos X de GNR-SiO 2 -Ab no cambió significativamente como resultado de la modificación de la superficie. Esto concuerda con los hallazgos informados en la literatura anterior [35,36,37]. La funcionalización de superficies es una herramienta poderosa que permite la orientación pasiva o activa de GNR a un sitio de interés específico. En nuestro estudio, adjuntamos con éxito GNR-SiO 2 -Ab a las cápsulas de C. neoformans . Además, determinamos si estas partículas conjugadas con anticuerpos podrían usarse como nanosensas mientras se realizan imágenes de CT dirigidas de C. neoformans células in vitro. Observamos que las imágenes de TC de C. neoformans las células dispersas en PBS parecían bastante similares a las imágenes derivadas de C. neoformans células dispersas en agua. Sin embargo, es difícil distinguir las imágenes de los hongos de los tejidos blandos. Un anticuerpo puede inducir una agregación mucho mayor de GNR al unirse a la superficie de C. neoformans células resultando en valores de atenuación mucho más altos que nunca. Por lo tanto, podemos lograr con éxito una atenuación de rayos X distinguible de los hongos. Según nuestros resultados, la detección de C. neoformans mediante tomografía computarizada podría lograrse y brindar nuevas oportunidades en el diagnóstico.
Los GNR se han utilizado ampliamente para la terapia fototérmica de tumores [22, 38, 39]. Nuestro estudio indica que GNR-SiO 2 -Ab podría ser una herramienta selectiva para destruir C. neoformans células. Nuestros resultados confirmaron que la membrana celular de C. neoformans las células sufrieron una destrucción irreparable y grave después de ser irradiadas por NIR. Además, la viabilidad de las células se redujo significativamente en comparación con las células no tratadas. Estos resultados indicaron que la radiación NIR por sí sola causa la muerte de C. neoformans células. Sin embargo, la viabilidad de las células incubadas con GNR-SiO 2 -Ab también había estado deprimido. En células incubadas con GNR-SiO 2 -Ab y sometidas a irradiación NIR, la viabilidad de las células se redujo significativamente en comparación con otros grupos. Nos aseguramos de que el GNR-SiO 2 -Ab conjugado con los hongos de forma selectiva y mejora los efectos de la radiación NIR. GNR-SiO 2 -Ab tiene la capacidad de efectos de terapia fototérmica selectiva en el C. neoformans células. El mecanismo de efecto no se ha informado antes. Especulamos que la alteración de la membrana celular probablemente fue inducida por la muerte celular inducida por irradiación. Norman y col. [18] informó que la viabilidad de Pseudomonas aeruginosa se redujo significativamente cuando esta especie se expuso a la irradiación y se unió con nanobarras de oro, que se conjugaron covalentemente con anticuerpos específicos. Estas células también mostraron áreas de membrana celular muy dañada con daño irreparable, que fue causado por la exposición a la irradiación NIR. Cuando las nanopartículas se expusieron a la radiación NIR, la membrana celular se dañó debido a varios factores, incluida la explosión de las nanopartículas, las ondas de choque, la formación de burbujas y la desintegración térmica [40].
En este estudio, la muerte o actividad reducida de C. neoformans Las células ocurrieron cuando la membrana celular se desintegró y destruyó por la energía térmica. Sin embargo, se deben realizar más estudios para confirmar esta hipótesis. C. neoformans las células se dañan por los siguientes factores:aumentos localizados de temperatura, explosión de nanopartículas, ondas de choque, formación de burbujas y desintegración térmica causada por la radiación NIR. En particular, C. neoformans las células resultaron sustancialmente dañadas cuando se expusieron únicamente a la radiación NIR. Hay dos posibles razones para explicar cómo GNR-SiO 2 -Ab estimula la radiación NIR provocando la destrucción fototérmica de C. neoformans células. Una posibilidad es que en la cápsula de C. neoformans células, el objetivo GNR-SiO 2 -Ab induce un aumento localizado de temperatura. La segunda posibilidad es que debido a una reacción antígeno-anticuerpo entre GNR-SiO 2 -Ab y la cápsula de C. neoformans células, hay cambios estructurales en la pared celular y la cápsula. Debido a estos cambios, las células serían más sensibles al tratamiento fototérmico [41]. Estudios anteriores han confirmado la baja toxicidad de las nanovarillas de oro [22, 42, 43], y se requerirán más estudios para investigar el efecto de la terapia fototérmica in vivo. Lo más lamentable de nuestro estudio es que no discutimos la capacidad de carga de GNR-SiO 2 -Ab. El estudio adicional se concentrará en la relación entre la capacidad de carga de GNR-SiO 2 -Ab y el efecto fototérmico.
Conclusiones
Fabricamos con éxito GNR-SiO 2 -Ab, que estaba dirigido a C. neoformans células. Estas nanovarillas de oro conjugadas con anticuerpos específicos mejoraron la atenuación de rayos X de C. neoformans células en imágenes de TC. Nuestros resultados indicaron que los GNR inmunes, que estaban mediados por anticuerpos, aumentaron los efectos de la terapia fototérmica inducida por NIR en C. neoformans células. Además, GNR-SiO 2 -Ab permitió una fácil manipulación y procedimientos mínimamente invasivos en el diagnóstico y tratamiento de C. neoformans infecciones, centrándose en la posible aplicación clínica de este enfoque.
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