Nanorods de oro recubiertos con BSA para la terapia fototérmica NIR-II

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de AuNR @ CTAB

Se encontró que las nanovarillas de oro más pequeñas, mejor farmacocinética y menor citotoxicidad [18]. Sin embargo, el pico de absorción de SPR de las nanovarillas de oro está muy relacionado con la relación de aspecto, cuanto mayor es la relación de aspecto, menor energía del pico de SPR. Para sintetizar AuNR con una relación de aspecto grande, mientras tanto, mantener el tamaño lo más pequeño posible, se optimizaron los parámetros de síntesis, como la concentración de tensioactivo, el pH de la solución de crecimiento y la concentración del agente reductor. El NaBH ₄ (aq) es un tipo de agente reductor fuerte que forma el núcleo de Au a través de la nucleación en ráfaga de LaMer, seguida de una rápida unión aleatoria de iones de Au y una maduración intrapartícula [19]. Como la cantidad molar de NaBH ₄ aumentando, el pico de absorción máximo de nanobarras de oro sufre un cambio azul de 1223 a 865 nm (Fig. 1C). El pH de la solución de crecimiento también es un parámetro clave para controlar el crecimiento de nanobarras de oro, y se ajusta mediante la cantidad de ácido clorhídrico [20]. Se encontró que el pico de absorción máximo de las nanovarillas de oro se desplazaba gradualmente hacia el rojo de 871 a 1070 nm mientras aumentaba la cantidad de ácido clorhídrico (Fig. 1D). Además, Ag ⁺ se considera que puede controlar la dirección de crecimiento de las nanovarillas de oro, y cuanto menor sea el valor de Ag ⁺ concentración, podría obtenerse la longitud de onda de absorción más larga del pico SPR (Fig. 1E). Al final, las nanovarillas de oro sintetizadas son de color rojo vino, como se muestra en la Fig. 1B. Por lo tanto, considerando la eficiencia de síntesis de las nanovarillas de oro y la disponibilidad de una fuente de luz láser, elegimos nanovarillas de oro con un pico de absorción máximo a 1064 nm para el tratamiento fototérmico de tumores.

Las fotopropiedades de AuNR @ CTAB en diferentes condiciones de síntesis. un La preparación de AuNR @ CTAB. b La imagen de nanobarras de oro revestidas con CTAB (AuNR @ CTAB), c Espectros UV-vis de AuNR @ CTAB preparado con NaBH ₄ variable concentración, d Espectros UV – vis de AuNR @ CTAB preparado con concentración variable de HCl e Espectros UV-vis de AuNR @ CTAB preparado con AgNO ₃ variable concentración

Síntesis y caracterización de AuNR @ BSA

El bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) es el compuesto más utilizado para la síntesis de nanobarras de oro con longitudes y proporciones precisas. Sin embargo, CTAB tiene una citotoxicidad significativa cuando la concentración es superior a 1 a 10 μM. La aplicación de las nanovarillas de oro revestidas con CTAB (AuNR @ CTAB) en biomedicina se ha restringido considerablemente [21]. Además, la estabilidad coloidal de las nanovarillas de oro revestidas con CTAB en solución acuosa se ve drásticamente afectada por la temperatura, que es fácil de cristalizar a bajas temperaturas [22]. Dada la reducción de la citotoxicidad de CTAB y la mejora de su estabilidad, se han propuesto varios enfoques para reemplazar CTAB durante el proceso de síntesis de nanobarras de oro o para funcionalizar las nanovarillas de oro recubiertas de CTAB. Utilizando polímeros, péptidos, tensioactivos y lípidos para modificar la superficie de las nanopartículas, la mayoría de estas estrategias utilizan moléculas tioladas o fuerzas de interacción electrostática para unirse a la superficie del oro [23]. Las proteínas son las opciones más prometedoras como las ventajas de la estabilidad coloidal, la biocompatibilidad y una mayor funcionalización. [26]

Las nanovarillas de oro envueltas con CTAB y BSA se muestran en la Fig. 2A. El pico de absorción máximo de AuNR @ BSA es de alrededor de 1064 nm, que es aproximadamente 30 nm desplazado al rojo en comparación con el de AuNR @ CTAB (Fig. 2B). El potencial zeta de las nanovarillas de oro cambió de positivo a negativo mediante la sustitución del recubrimiento CTAB por BSA (archivo adicional 1:Fig. S1). A partir de los espectros FTIR de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB (archivo adicional 1:Fig. S2), pudimos encontrar que dos picos característicos de a 1649 cm ⁻¹ y 1539 cm ⁻¹ en el caso de AuNR @ BSA, que se atribuyeron a las bandas vibratorias amida I y amida II de BSA. La dispersión dinámica de luz (DLS) también se aplicó para analizar el tamaño hidrodinámico de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA; Además, la morfología de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM) como se muestra en la Fig.2C, D. Se pudieron encontrar claramente dos picos a partir de la medición de la intensidad de dispersión de DLS, uno con un tamaño hidrodinámico de aproximadamente 3.10 ( ± 0.85) nm y el otro alrededor de 57.45 (± 24.22) nm para AuNR @ CTAB. Sin embargo, en el caso de AuNR @ BSA, los picos se desplazan a 8,64 (± 3,80) nm y 89,24 (± 42,24) nm. Pudimos encontrar que la forma de AuNR permanece similar después del recubrimiento con BSA, excepto que los extremos se vuelven ligeramente redondeados (Fig. 2C, D). Para aplicaciones de terapia in vivo, el tamaño crítico de las nanopartículas se limita a menos de 100 nm [25]. Más allá de este tamaño, la capacidad de las nanopartículas para penetrar en los tumores será limitada; por lo tanto, las nanovarillas de oro presentadas serían un candidato ideal para la terapia tumoral [24]. Como se muestra en el archivo adicional 1:Fig. S3, los picos característicos de Au se pueden observar claramente en el patrón XRD, desde los planos (111), (200), (220) y (311) de nanopartículas de Au.

Caracterización de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB. un Elaboración de AuNR @ BSA. b Espectros UV-Vis de AuNR @ CTAB (L) y AuNR @ BSA (R). c La medición de intensidad DLS de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA. d Las imágenes TEM de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA

In Vitro Efecto fototérmico de nanobarras de oro

El láser de diodo de 1064 nm como la fuente de luz NIR-II más económica se considera la longitud de onda óptima para la terapia fototérmica. Por lo tanto, se considera que la nanoplataforma de oro NIR-II ideal para una terapia fototérmica eficiente se caracteriza por una fuerte absorción de SPR a 1064 nm, alta eficiencia fototérmica y excelente estabilidad fototérmica. Para investigar el efecto fototérmico del AuNR @ BSA preparado, se excitaron PBS y diferentes DO (=0,5, 1, 1,5, 2) de AuNR @ BSA a 1064 nm con una intensidad de luz de 0,35 a 1 W / cm ² durante 30 min. Se utilizó un generador de imágenes de temperatura para registrar los cambios de temperatura cada 5 min, como se muestra en la Fig. 3A. El efecto fototérmico de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB con la misma absorbancia (DO =1) es significativamente mayor que el de PBS. Pudimos encontrar que la temperatura se elevó rápidamente en los primeros 5 minutos y luego se mantuvo en aproximadamente 80 ° C durante el resto del tiempo, como se ilustra en la Fig. 3A. El aumento de temperatura inducido por fototermia para PBS causado principalmente por la absorción de matices de agua a 1064 nm. La temperatura máxima en función de la intensidad de la luz se ilustra en la Fig. 3B. Se encontró que la temperatura térmica fotoinducida de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA a una absorbancia de aproximadamente 1 es proporcional a la intensidad de la luz. El aumento de temperatura es mucho más rápido para AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA que para PBS a medida que aumenta la intensidad del láser. Además, la Fig. 3C muestra que en las mismas condiciones de irradiación (1064 nm, 0,75 W / cm ² ), la temperatura fototérmica máxima aumenta drásticamente a medida que aumenta la absorbancia de ambos AuNR. Las propiedades fototérmicas del AuNR recubierto con BSA son un poco mejores que las del recubierto con CTAB. No hay ningún cambio significativo en la temperatura fototérmica máxima de AuNR @ BSA (OD =1, 61,1 ° C) dentro de tres ciclos de irradiación (0,5 W / cm ² , 10 min), lo que indica la excelente estabilidad fototérmica del AuNR @ BSA preparado (Fig. 3D). La Figura 3E representa la imagen de temperatura fototérmica de AuNR @ CTAB (OD =1), AuNR @ BSA (OD =1) y PBS bajo irradiación láser durante 10 min. La temperatura máxima de PBS es de 44,5 ° C, mientras que la temperatura máxima de AuNR llega a los 85,5 ° C. Los resultados anteriores demostraron que el AuNR @ BSA sintetizado posee características de absorción apropiadas, eficiencia de conversión fototérmica y fotoestabilidad en el rango NIR-II como un excelente agente terapéutico fototérmico.

Evaluación in vitro del efecto fototérmico de AuNR @ BSA. un La temperatura fototérmica de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB en función del tiempo de irradiación del láser (absorbancia de SPR aproximadamente 1, 1064 nm, 1 W / cm ² ). b Aumento de temperatura provocado por NIR de PBS, AuNR @ CTAB (OD =1) y AuNR @ BSA (OD =1) en función de la intensidad de la irradiación láser (1064 nm, 0,35 a 1 W / cm ² ). c Aumento de temperatura activado por NIR de AuNR @ BSA y AuNR @ CTAB con diferente absorbancia para una irradiación láser de 10 minutos (1064 nm, 1 W / cm ² ). d Conversión fototérmica de AuNR @ BSA (OD =1) bajo tres ciclos de irradiación (1064 nm, 0,5 W / cm ² ). e Imagen térmica de PBS, AuNR @ CTAB (OD =1), AuNR @ BSA (OD =1) bajo irradiación con láser NIR (1064 nm, 1 W / cm ² ) en un intervalo de tiempo de 5 y 10 min. (media ± DE, n =3)

Citotoxicidad y toxicidad fototérmica in vitro de nanovarillas de oro

El análisis CCK-8 se realizó para cuantificar la citotoxicidad de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA en células 4T1 a diferentes concentraciones. Incluso sin irradiación con láser, el AuNR @ CTAB ya exhibe una citotoxicidad significativa a una concentración muy baja (absorbancia de aproximadamente 0,05), por lo que su aplicación biológica está muy restringida. Sin embargo, AuNR @ BSA demuestra excelentes perspectivas de aplicación biológica, por ejemplo, la viabilidad celular todavía está en el rango aceptable cuando la absorbancia de AuNR @ BSA alcanza aproximadamente 1 (Fig. 4A). Alentada por la estabilidad prometedora y la alta eficiencia de conversión fototérmica de AuNR @ BSA, la toxicidad fototérmica se realizó en células tumorales 4T1 in vitro con una intensidad de luz de aproximadamente 0,75 W / cm ² durante 10 min. Se encontró una toxicidad fototérmica significativa a una absorbancia de alrededor de 1 con una tasa de supervivencia celular de alrededor del 20%; sin embargo, se encontró aproximadamente el 100% de supervivencia celular para experimentos sin radiación (Fig. 4B, archivo adicional 1:Fig. S4). Estos resultados in vitro indican que el tratamiento fototérmico AuNR @ BSA en la región NIR-II podría matar eficazmente las células cancerosas a una intensidad de radiación relativamente.

Citotoxicidad in vitro y toxicidad fototérmica de nanobarras de oro. un Viabilidad celular de células 4T1 incubadas con diversas concentraciones de AuNR @ CTAB y AuNR @ BSA. b Viabilidad celular de células 4T1 incubadas con diversas concentraciones de AuNR @ BSA sin y con irradiación láser NIR (1064 nm, 0,75 W / cm ² , 10 minutos). (media ± DE, n =3)

In Vivo Estudios de biodistribución

El tiempo de circulación sanguínea es esencial para la administración satisfactoria de los fármacos basados ​​en nanopartículas [24]. El tiempo de circulación sanguínea de AuNR @ BSA se controló mediante la concentración de Au mediante ICP-OES y se encontró que era de aproximadamente 1,5 h (vida media) (Fig. 5A). La biodistribución in vivo de AuNR @ BSA también se midió mediante la concentración de Au en diferentes órganos (archivo adicional 1:Fig. S5). Como se muestra en la Fig. 5B, AuNR @ BSA se acumularon en gran medida en el hígado y el bazo después de una inyección intravenosa de 24 h debido a su fuerte fagocitosis como un órgano del sistema reticuloendotelial (RES) [27, 28]. Estos resultados muestran que AuNR @ BSA puede acumularse eficazmente en el hígado y el bazo. AuNR @ BSA tiene aplicaciones potenciales en enfermedades relacionadas con el hígado y el bazo.

La biodistribución de AuNR @ BSA en sangre y órganos. un La concentración de Au en sangre en función del tiempo mediante inyección intravenosa de AuNR @ BSA. b La biodistribución de AuNR @ BSA en varios órganos

In Vivo Tratamiento fototérmico de infrarrojo cercano de nanobarras de oro

El excelente rendimiento fototérmico de AuNR @ BSA nos anima a seguir la terapia fototérmica in vivo en ratones BALB / c con tumores. AuNR @ BSA se inyectó in situ en el tumor y, a continuación, se introdujo la luz para la terapia fototérmica 10 minutos más tarde (1064 nm, 0,75 W / cm ² ). La variación de temperatura in vivo se controló mediante una cámara termográfica de temperatura. Los cambios de temperatura antes y después del tratamiento se muestran en la Fig. 6D. La temperatura del sitio del tumor fue de aproximadamente 63,9 ° C dentro de los 10 min de la irradiación y mantuvo poca fluctuación a esta temperatura (Fig. 6D). Por el contrario, no hay ningún cambio de temperatura observable para el grupo de control en la misma condición de irradiación (grupo AuNR @ BSA, grupo PBS, grupo láser). Después de la terapia fototérmica, se controló el volumen del tumor y el peso corporal de los ratones cada dos días durante 14 días. Como se presenta en la Fig.6A, B, el tumor del grupo AuNR @ BSA_laser se inhibió por completo y se dejó como costras quemadas en la ubicación del sitio del tumor original, mientras que el de los grupos de control creció relativamente rápido y fuera de control (AuNR @ BSA group, Grupo PBS, grupo láser). Las costras son la piel quemada, lo que demuestra directamente que el proceso de PPT podría provocar un exceso de calor local en el sitio del tumor con AuNR @ BSA inyectado. El efecto fototérmico es muy eficiente, ya que observamos que los tumores sólidos en el grupo láser AuNR @ BSA + disminuyen rápidamente dos días después del tratamiento. Para capturar aún más los cambios tumorales después del tratamiento, al final de la observación de los 14 días, se sacrificaron los ratones y se aislaron los tumores. Como se muestra en la Fig. 6C, el tamaño del tumor del grupo de tratamiento AuNR @ BSA_laser se suprimió totalmente, mientras que se encontró que todos los demás grupos tenían un crecimiento descontrolado. Las imágenes de ratones del grupo (láser AuNR @ BSA +) mostraron que los tumores no continuaron creciendo después del tratamiento de 14 días (Fig. 6E). Por lo tanto, considerando la capacidad terapéutica ideal y la ausencia de citotoxicidad obvia, AuNR @ BSA para la terapia de irradiación con láser de segunda ventana en el infrarrojo cercano es un candidato ideal para el PTT activado por luz in vivo. Esto muestra claramente que la hipertermia simple utilizando la terapia NR-II actual puede inhibir eficazmente el crecimiento tumoral (archivo adicional 1).

Tratamiento fototérmico de ratones portadores de tumores. un Volumen tumoral en función del tiempo en diferentes condiciones de tratamiento. b Cambios en el peso corporal de los ratones portadores de tumores en función del tiempo, después del tratamiento. c Fotografías de tejidos tumorales en diferentes grupos después de un tratamiento de 14 días. d Imágenes termográficas infrarrojas de ratones portadores de tumores expuestos a un láser de 1064 nm (0,75 W / cm ² , 10 min) a los 10 min después de la inyección intratumoral de AuNR @ BSA. e Imágenes de ratones del grupo AuNR @ BSA_laser después del tratamiento. (media ± DE, n =2)

Además, se tomó TEM para el tumor aislado después del tratamiento fototérmico y el tumor no tratado. La AuNR se pudo observar en el tejido tumoral después del tratamiento fototérmico. Proporcionó evidencia adicional de que las nanovarillas de oro todavía tienen una excelente fotoestabilidad en el entorno del tejido tumoral (Fig. 7).

Micrografía electrónica de transmisión de AuNR @ BSA en tejido tumoral a Tumor tratado. b Tumor no tratado

Conclusión

Aquí, sintetizamos el AuNR @ BSA con el máximo de absorción SPR en la segunda ventana del infrarrojo cercano para la terapia fototérmica, como sus excelentes propiedades fototérmicas y biocompatibilidad. La biocompatibilidad del AuNR informado mejoró significativamente al recubrir con albúmina de suero bovino, y las propiedades fototérmicas no se vieron afectadas. The biodistribution of the intravenously injected AuNR@BSA indicates that large amounts of AuNR accumulated in the liver and spleen. The TEM image of AuNR@BSA inside tumor reveals that the high in vivo photostability of the AuNR and suggests that once upon injection, several phototreatment might be applied to reach the desired therapy outcomes. The excellent photothermal conversion of the reported AuNR was able to sufficiently inhibit tumor growth even under low light irradiation. The PTT of AuNR@BSA combined with other treatment strategies, such as immunotherapy and chemotherapy, would be promising for developing a useful tool for personalized, safe, and effective tumor treatment.

Availability of data and materials

The data set used and/or analyzed in this study can be obtained from the corresponding author upon reasonable request. All data generated or analyzed during this study is included in this published article.

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