Nanorodas de oro recubiertas con albúmina sérica bovina permiten terapia fototérmica NIR-II de baja dosis

Resumen

La segunda ventana del infrarrojo cercano (NIR-II, 1000–1300 nm) ofrece penetración tisular inigualable, posicionándola como el régimen óptico ideal para imagen y terapia fototérmica. Sin embargo, crear nanorodas de oro que absorban en esta banda manteniendo baja citotoxicidad sigue siendo un desafío. Diseñamos una serie de nanorodas de oro de alto aspecto con resonancia de plasmón de superficie robusta a lo largo de la ventana NIR-II. El recubrimiento de estas nanorodas con albúmina sérica bovina (BSA) mejoró drásticamente su biocompatibilidad sin comprometer el rendimiento óptico. En un modelo murino de cáncer de mama, las nanorodas recubiertas con BSA lograron ablación tumoral completa usando una intensidad láser NIR-II modesta de solo 0,75 W cm⁻². Estos resultados confirman que la terapia fototérmica NIR-II de baja dosis es factible con nanorodas de oro de gran aspecto.

Introducción

Las nanopartículas de oro (AuNPs) han emergido como agentes versátiles en investigación biomédica debido a su excepcional biocompatibilidad y baja citotoxicidad. Su alta atenuación de rayos X las hace atractivas para imagen de tumores por tomografía computarizada (TC) [1, 2], mientras que su pronunciada resonancia de plasmón de superficie (SPR) permite conversión eficiente de fotón a calor para terapia fototérmica (PTT) [3, 4]. AuNPs con tamaño y morfología ajustables —nanorodas, nanocáscaras, nanocajas— se han adaptado para ablación de cáncer, particularmente nanorodas de oro (AuNRs) cuya anisotropía brinda fuerte absorción NIR y estabilidad fototérmica [5–8]. La luz NIR penetra tejidos más profundamente que la luz visible, y longitudes de onda más largas experimentan dispersión reducida [9]. Las partículas en forma de varilla también exhiben permeabilidad tumoral mejorada y circulación prolongada, aumentando la acumulación [10, 11]. Sin embargo, la PTT convencional a menudo requiere láseres de alta potencia, arriesgando daño colateral [12]. La ventana NIR-II ofrece penetración más profunda y menor dispersión que NIR-I, permitiendo terapia efectiva a intensidades láser más bajas [13–17]. Sin embargo, producir AuNRs que absorban en NIR-II manteniendo biocompatibilidad es difícil. Aquí reportamos una síntesis sin semillas de AuNRs con picos de absorción a 1000–1300 nm, seguida de recubrimiento con BSA para reducir citotoxicidad. Evaluamos su rendimiento fototérmico in vitro e in vivo, demostrando ablación tumoral en un modelo murino de cáncer de mama con intensidad láser tan baja como 0,75 W cm⁻².

Materiales y Métodos

Materiales

Cloruro de oro trihidratado (HAuCl₄·3H₂O, 99,9 %), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB, 99 %), ácido nítrico (GR 65–68 %), peróxido de hidrógeno (30 %), borohidruro de sodio (NaBH₄, 97 %), nitrato de plata (AgNO₃, 99,8 %), ácido clorhídrico (38 %), hidroquinona (99 %), albúmina sérica bovina (BSA, 98 %) se obtuvieron de Shanghai Aladdin Biological Technology Co. Ltd. RPMI 1640, Penicilina-Estreptomicina, PBS, suero fetal bovino (FBS), células 4T1 y Kit de Conteo Celular-8 (CCK-8) se obtuvieron de HyClone, Corning, Gibco y Dojindo, respectivamente. Agua ultrapura (Millipore) se usó en todo momento.

Preparación de AuNR@CTAB

Las AuNRs se sintetizaron mediante un protocolo sin semillas. Brevemente, 0,4 mL de 10 mM HAuCl₄ y 10 mL de 0,1 M CTAB se combinaron con 23–33 µL de 100 mM AgNO₃. La adición subsiguiente de 10–30 µL 1,2 M HCl y 525 µL 0,1 M hidroquinona produjo una solución de crecimiento amarillo claro. Tras 15 min de agitación, se inyectaron 10–40 µL de 10 mM NaBH₄ recién preparado en hielo, seguido de 30 s agitación y 18 h envejecimiento a temperatura ambiente. AuNR@CTAB se purificó con dos lavados de PBS.

Preparación de AuNR@BSA

La concentración de CTAB en AuNR@CTAB se ajustó a 1 mM y se sonicó para disolver completamente. 3 mL de AuNR@CTAB se mezclaron con 3 mL de 10 mg mL⁻¹ BSA y se sonicaron 30 min. Tras centrifugación (9500 × g, 40 min), el pellet se resuspendió en 6 mL de 5 mg mL⁻¹ BSA, pH ajustado a 11–12 con 2 M NaOH, y se agitó ≥18 h. El AuNR@BSA final se purificó con dos lavados de PBS y se almacenó en PBS.

Caracterización

Microscopía electrónica de transmisión (TEM, Talos F200X) evaluó morfología; dispersión dinámica de luz (DLS, Zetasizer Nano ZS) midió tamaño y potencial zeta; espectroscopía UV–Vis (Shimadzu UV‑2700) registró absorción. La distribución tumoral in vivo se examinó por TEM de secciones tumorales extirpadas post-inyección. Análisis FT-IR y XRD (Beijing Zhongke Baice Co.) confirmaron recubrimiento de BSA y oro cristalino, respectivamente.

Rendimiento Fototérmico

Soluciones de AuNR (OD = 0,5–2 a 1064 nm) se irradiaron con láser 1064 nm (0,35–1 W cm⁻²) por 30 min, y los cambios de temperatura se monitorizaron por imagen térmica infrarroja (FLUKE TI25). La fotoestabilidad se evaluó por ciclos repetidos de 10 min encendido/apagado a 0,5 W cm⁻².

Citotoxicidad In Vitro

Células 4T1 se sembraron en placas de 96 pozos (5 × 10³ células pozo⁻¹) e incubaron 24 h. AuNR@CTAB o AuNR@BSA (10 µL) se añadieron a concentraciones variables, seguido de 24 h incubación. CCK-8 (10 µL) se añadió, incubó 40 min, y la absorbancia se midió a 450 nm. Ensayos de fototoxicidad involucraron irradiación 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min) antes de la prueba CCK-8.

Estudios en Animales

Ratones BALB/c hembras (6–8 semanas) fueron inoculados subcutáneamente con 2 × 10⁶ células 4T1. Cuando los tumores alcanzaron ~100 mm³, comenzaron los experimentos. Todos los procedimientos siguieron directrices éticas institucionales.

Biodistribución y Circulación In Vivo

AuNR@BSA (200 µL) se inyectó por vena cola. Muestras de sangre se recolectaron a 0,25, 2, 4, 6, 8, 12, 36 y 48 h, digeridas con HNO₃ y H₂O₂, y el contenido de Au se cuantificó por ICP-OES. Órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) se cosecharon 24 h post-inyección, digeridos y concentraciones de Au medidas similarmente.

Eficiencia de Tratamiento Fototérmico

Los ratones se dividieron en cuatro grupos: (1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + láser, (3) solo láser, (4) control. AuNR@BSA (200 µL) se inyectó intratumoralmente, seguido 10 min después por irradiación 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min). Temperatura tumoral, volumen y peso corporal se monitorizaron por 14 días. Los tumores se extirparon al final del estudio.

Análisis de Datos

Análisis estadísticos se realizaron con SPSS 16.0. Los datos se expresan como media ± DE; significancia se estableció en p < 0,05.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización de AuNR@CTAB

La optimización de concentraciones de NaBH₄, HCl y Ag⁺ permitió control sobre relación de aspecto y posición del pico SPR. El aumento de NaBH₄ desplazó el pico al azul de 1223 a 865 nm, mientras que mayor HCl lo desplazó al rojo de 871 a 1070 nm. La reducción de concentración de Ag⁺ extendió el pico SPR aún más. Las AuNRs finales exhibieron color vino tinto y un máximo de absorción a 1064 nm (Fig. 1). Esta longitud de onda se alinea con la ventana NIR-II y coincide con fuentes láser disponibles.

Figura 1. Fotopropiedades de AuNR@CTAB bajo condiciones de síntesis variables: (a) esquema de preparación; (b) imagen TEM; (c) espectros UV–Vis vs NaBH₄; (d) vs HCl; (e) vs AgNO₃.

Síntesis y Caracterización de AuNR@BSA

CTAB, aunque efectivo para crecimiento de nanorodas, es citotóxico above 1–10 µM y puede precipitar a bajas temperaturas. Reemplazar CTAB con BSA mitiga toxicidad y mejora estabilidad coloidal. AuNR@BSA retuvo relación de aspecto similar pero mostró un pico SPR desplazado al rojo ~30 nm a 1064 nm (Fig. 2). El potencial zeta cambió de positivo (CTAB) a negativo (BSA), confirmando intercambio superficial. Espectros FT-IR revelaron bandas amida características de BSA (1649 y 1539 cm⁻¹). DLS mostró diámetros hidrodinámicos de 8,6 nm y 89 nm para las dos poblaciones, indicando leve aumento de tamaño tras recubrimiento con BSA. TEM confirmó morfología varilla con extremos ligeramente redondeados (Fig. 2). Todas las dimensiones permanecieron por debajo de 100 nm, favoreciendo penetración tumoral.

Figura 2. Caracterización de AuNR@BSA y AuNR@CTAB: (a) síntesis; (b) espectros UV–Vis; (c) distribución de tamaño DLS; (d) imágenes TEM.

Efecto Fototérmico In Vitro

AuNR@BSA (OD ≈ 1) logró aumento de temperatura de ~25 °C a 80 °C en 5 min bajo 0,35 W cm⁻², mesetando después (Fig. 3A). La temperatura escaló linealmente con potencia láser (Fig. 3B). Aumentar OD elevó aún más temperaturas pico. La fotoestabilidad se confirmó en tres ciclos de irradiación de 10 min a 0,5 W cm⁻² (Fig. 3D). Imágenes térmicas mostraron temperaturas pico de 85,5 °C para AuNRs vs 44,5 °C para PBS (Fig. 3E). Estos resultados subrayan la conversión fototérmica superior y estabilidad de nanorodas recubiertas con BSA en el rango NIR-II.

Figura 3. Rendimiento fototérmico in vitro: (a) temperatura vs tiempo; (b) temperatura vs potencia láser; (c) temperatura vs absorbancia; (d) estabilidad de tres ciclos; (e) imágenes térmicas.

Citotoxicidad y Fototoxicidad In Vitro

AuNR@CTAB mostró citotoxicidad significativa incluso a bajas concentraciones (OD ≈ 0,05), mientras que AuNR@BSA mantuvo >80 % viabilidad celular hasta OD ≈ 1 (Fig. 4A). Tratamiento fototérmico (0,75 W cm⁻², 10 min) redujo viabilidad de células 4T1 a ~20 % a OD ≈ 1, mientras que células control permanecieron ~100 % viables (Fig. 4B). Así, el recubrimiento con BSA preserva biocompatibilidad mientras permite muerte fototérmica efectiva.

Figura 4. Citotoxicidad y fototoxicidad: (a) viabilidad celular vs concentración; (b) viabilidad con/sin láser.

Biodistribución y Circulación In Vivo

AuNR@BSA exhibió vida media de ~1,5 h en circulación (Fig. 5A). Tras 24 h, predominó acumulación en hígado y bazo, consistente con captación por sistema reticuloendotelial (Fig. 5B). Estos hallazgos sugieren potencial para aplicaciones dirigidas a hígado-bazo.

Figura 5. Biodistribución: (a) concentración de Au en sangre en el tiempo; (b) distribución en órganos a 24 h.

Tratamiento Fototérmico In Vivo

Inyección intratumoral de AuNR@BSA seguida de irradiación 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min) elevó temperatura tumoral a ~64 °C, mientras grupos control permanecieron cerca de temperatura corporal (Fig. 6D). En 14 días, el grupo AuNR@BSA + láser mostró ablación tumoral completa sin recaída; tumores en grupos control progresaron rápidamente (Fig. 6A, B). Análisis post-mortem confirmó ausencia de tejido tumoral residual (Fig. 6C). TEM de tumores tratados reveló AuNRs intactos, atestiguando fotoestabilidad in vivo (Fig. 7).

Figura 6. Resultados de tratamiento in vivo: (a) volumen tumoral; (b) peso corporal; (c) fotografías tumorales; (d) termografía infrarroja; (e) imágenes post-tratamiento.

Figura 7. TEM de AuNR@BSA en tejido tumoral: (a) tratado; (b) no tratado.

Conclusión

Hemos sintetizado nanorodas de oro recubiertas con BSA con pico SPR a 1064 nm, combinando alta eficiencia fototérmica con biocompatibilidad mejorada. Estudios in vivo demostraron ablación tumoral rápida en modelo murino de cáncer de mama usando irradiación láser NIR-II de baja dosis. Las nanorodas exhiben biodistribución favorable, con captación significativa en hígado y bazo, y mantienen fotoestabilidad en el microambiente tumoral. Estos atributos posicionan a AuNR@BSA como plataforma prometedora para terapia fototérmica NIR-II, potencialmente en combinación con inmunoterapia o quimioterapia para tratamiento de cáncer personalizado, seguro y efectivo.

Disponibilidad de datos y materiales

El conjunto de datos subyacente a este estudio está disponible del autor correspondiente bajo solicitud razonable. Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado.