Nanopartículas de carbono dopadas con cerio sintetizadas de forma verde ofrecen una captación superior de radicales hidroxilo para terapia antioxidante

Resumen

Los avances recientes en nanomedicina han destacado a las nanopartículas de óxido de cerio como potentes antioxidantes. En este trabajo presentamos un método sencillo y ambientalmente benigno que utiliza albúmina sérica bovina (BSA) para biomineralizar nanopartículas carbonáceas dopadas con cerio (CNPs-Ce). Las partículas resultantes son monodispersas, con un diámetro promedio de 14,7 nm, y presentan abundantes grupos superficiales hidrofílicos que garantizan una dispersión estable a largo plazo en medios acuosos. Los estudios de citotoxicidad in vitro (CCK-8) confirman una toxicidad celular insignificante en un amplio rango de dosis. Al ser desafiadas con especies reactivas del oxígeno inducidas por peróxido de hidrógeno, las CNPs-Ce exhiben una excepcional capacidad de captación de radicales hidroxilo, protegiendo células musculares lisas vasculares y células tumorales 7721 del daño oxidativo de manera dependiente de la dosis. Estos hallazgos establecen a las CNPs-Ce como prometedoros captadores de ROS de baja toxicidad para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo.

Antecedentes

El estrés oxidativo, definido como un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y las defensas antioxidantes, subyace en muchas enfermedades crónicas, como la aterosclerosis, el cáncer y la neurodegeneración. El radical hidroxilo (•OH), altamente reactivo, es particularmente dañino, ya que inicia la peroxidación lipídica, la modificación de proteínas y la rotura de cadenas de ADN que culminan en muerte celular y daño tisular. Por tanto, las estrategias terapéuticas que reducen los niveles de ROS, especialmente el •OH, son de gran interés clínico.

Las nanopartículas de óxido de cerio (CeO₂ NPs) han surgido como potentes nanoenzimas debido al ciclo redox reversible Ce³⁺/Ce⁴⁺. Esto les permite imitar las actividades de la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT), capturando •O₂⁻ y H₂O₂, respectivamente. No obstante, las CeO₂ NPs convencionales a menudo requieren recubrimientos superficiales (p. ej., PVP) para lograr estabilidad acuosa y biocompatibilidad, lo que puede alterar sus propiedades intrínsecas. Nuestro estudio evita esta limitación al incorporar iones de cerio dentro de un marco carbonáceo derivado de la BSA, generando CNPs-Ce con hidrofilicidad intrínseca y un rendimiento antioxidante robusto.

Sección Experimental

Materiales y Reactivos

Albúmina sérica bovina (BSA), diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) se adquirieron de Sigma (Nueva York, EE. UU.). Suero fetal bovino (FBS) y medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) se obtuvieron de Invitrogen China Limited (Shanghái). Nitrato de cerio hexahidratado (Ce(NO₃)₃·6H₂O), violeta de metilo (MV), sulfato ferroso heptahidratado (FeSO₄·7H₂O) y H₂O₂ al 30 % se compraron a Aladdin Reagent Corporation (Shanghái) y Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pekín). Todos los reactivos eran de grado analítico y se usaron sin purificación adicional; se empleó agua desionizada en todo momento.

Síntesis de Nanopartículas Carbonáceas Dopadas con Cerio

Las CNPs-Ce se prepararon mediante una ruta de biomineralización adaptada de la síntesis templada por BSA reportada por Wang et al. En breve, 1,25 g de BSA se disolvieron en 50 mL de agua desionizada bajo agitación continua para formar una solución clara. Una solución de Ce(NO₃)₃·6H₂O a 300 mM se añadió gota a gota manteniendo una agitación vigorosa. Simultáneamente, se introdujo lentamente NaOH 2,0 M para elevar el pH a 12. La mezcla se agitó a 55 °C durante 8 h, obteniéndose una suspensión marrón que se enfrió a temperatura ambiente. El producto se filtró a través de una membrana PES de 0,22 µm para eliminar agregados grandes, se dializó contra agua (corte 14 kDa) durante 3 días y se liofilizó al vacío. El polvo resultante se almacenó para su posterior caracterización.

Técnicas de Caracterización

La microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL JEM-2100) proporcionó datos morfológicos a 200 kV. Las distribuciones de tamaño se calcularon con ImageJ (NIH). La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR, Nicolet Nexus 470) y la espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, PHI 5000) identificaron grupos funcionales superficiales y estados de oxidación. La difracción de rayos X (XRD, Rigaku D/MAX-2000) confirmó las fases cristalinas. Los espectros de absorción UV-Vis (Shimadzu UV-2550) se registraron para estudios en solución.

Ensayo Fotométrico UV-Vis de Captación de Radicales

Las CNPs-Ce (10 µM) se dispersaron en Tris-HCl 0,1 M (pH 5,0) y se sonicaron para mejorar la solubilidad. Se preparó una mezcla de reacción que contenía 3,0 × 10⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄·7H₂O, 1,0 M H₂O₂ y la suspensión de CNPs-Ce (0,17 mM) en un volumen de 10 mL. Tras 5 min a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 582 nm para cuantificar la recuperación de MV, reflejando la captación de radicales hidroxilo.

Ensayo de Viabilidad Celular (CCK-8)

Células VSMC y 7721 (1,5 × 10⁴ células/pozo) se sembraron en placas de 96 pozos y se cultivaron hasta ~80 % de confluencia. Tras 24 h, los medios se reemplazaron por DMEM que contenía 0–400 µg/mL de CNPs-Ce, y las células se incubaron durante 24 h. Se añadió reactivo CCK-8 (10 µL/pozo) e incubó 4 h. La absorbancia a 490 nm se leyó en un lector de microplacas Synergy HT; la viabilidad se expresó como % del control sin tratar.

Modelo de Estrés Oxidativo Inducido por Peróxido de Hidrógeno

Para modelar el daño oxidativo, las células VSMC y 7721 se expusieron a H₂O₂ al 30 % a concentraciones de 50 µmol mL⁻¹ a 800 µmol mL⁻¹ durante 4 h. Posteriormente, la viabilidad celular se evaluó mediante CCK-8 como se describió, determinando la LD₅₀ de H₂O₂ (≈560 µM).

Ensayo de Apoptosis y Viabilidad (Live-Dead)

Células pretratadas con CNPs-Ce (0–400 µg/mL) fueron desafiadas con 560 µM H₂O₂ durante 4 h. Se realizó tinción live-dead (Calceína-AM/PI) en células 7721 cultivadas en placas de 6 pozos, y se capturaron imágenes de fluorescencia bajo microscopio confocal.

Análisis de Apoptosis por Citometría de Flujo

Tras la exposición a H₂O₂, las células 7721 se recolectaron, lavaron y tiñeron con Annexin V-FITC y PI. Las muestras se analizaron en un citómetro Beckman Coulter Epics XL MCL; se calcularon los porcentajes de apoptosis temprana (Annexin V⁺/PI⁻) y tardía (Annexin V⁺/PI⁺) usando FlowJo 7.6.2.

Análisis Estadístico

Los datos representan media ± SEM. Se aplicó ANOVA de un factor seguido de la prueba post-hoc de Tukey; p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y Discusión

Síntesis y Morfología de las Nanopartículas

La estrategia de biomineralización produjo CNPs-Ce altamente monodispersas, como muestra la TEM (Figura 1a). Las partículas presentaron morfología poligonal, no agregada, con diámetro promedio de 14,7 ± 0,8 nm (Figura 1b). La dispersión acuosa permaneció clara durante varios días, indicando excelente estabilidad coloidal, una ventaja clave para la administración biomédica.

Química Superficial y Estado de Oxidación

El análisis XPS confirmó la coexistencia de Ce³⁺ (≈15,99 %) y Ce⁴⁺, sustentando la naturaleza redox-activa de las partículas (Figura 2b). El espectro C 1s (Figura 2c) reveló picos a 285,0, 287,8 y 288,9 eV, correspondientes a C–C, C=O y C–O, mientras que el espectro O 1s (Figura 2d) mostró picos a 530,5 y 531,8 eV, indicativos de enlaces Ce–O e hidroxilos superficiales. Los espectros FT-IR (Figura 3A) mostraron una banda ancha de estiramiento O–H a 3400 cm⁻¹ y picos relacionados con nitrato a 1510 y 1450 cm⁻¹, confirmando la presencia de grupos funcionales hidrofílicos y la incorporación exitosa de iones de cerio.

Los patrones XRD (Figura 3B) revelaron picos característicos de una red híbrida carbono-cerio, con picos de carbono cerca de 24,4° y reflexiones de cerio a 30,3°, 35,23° y 43,2°, confirmando la integración exitosa del Ce en el marco carbonáceo.

Citotoxicidad In Vitro

Los ensayos CCK-8 demostraron que las CNPs-Ce no comprometen la viabilidad celular a concentraciones de hasta 400 µg/mL (Figura 4a). Incluso a la dosis más alta, la viabilidad permaneció por encima del 90 %, subrayando la excelente biocompatibilidad de las partículas.

Eficacia Antioxidante

El peróxido de hidrógeno a 560 µM se identificó como la LD₅₀ para ambas líneas celulares. El pretratamiento con CNPs-Ce mejoró significativamente la supervivencia de manera dependiente de la dosis, con 400 µg/mL restaurando la viabilidad al ~88 % (Figura 4c). La tinción live-dead (Figura 5) mostró una marcada reducción de células rojas (PI-positivas) con el aumento de CNPs-Ce, confirmando la protección contra la apoptosis oxidativa. La citometría de flujo (Figura 6) cuantificó la apoptosis: H₂O₂ solo indujo 46,4 % de apoptosis tardía, que descendió a 24,2, 20,0, 15,1 y 11,2 % con 50, 100, 200 y 400 µg/mL de CNPs-Ce, respectivamente.

Conclusiones

Hemos desarrollado una síntesis verde en un solo paso de nanopartículas carbonáceas dopadas con cerio que son altamente dispersables, biocompatibles y exhiben una potente captación de radicales hidroxilo. Las partículas conservan el ciclo redox intrínseco Ce³⁺/Ce⁴⁺, lo que les permite imitar las actividades SOD y CAT y proteger células vasculares y tumorales del daño oxidativo inducido por H₂O₂. Su eficacia antioxidante dependiente de la dosis y su citotoxicidad mínima posicionan a las CNPs-Ce como candidatos atractivos para la prevención y tratamiento de patologías relacionadas con el estrés oxidativo.