Síntesis inspirada en la biomineralización de nanopartículas carbonáceas dopadas con cerio para una actividad de eliminación de radicales altamente hidroxilo

Sección experimental

Materiales y reactivos

La albúmina de suero de toro (BSA), el diacetato de fluoresceína (FDA) y el yoduro de propidio (PI) se adquirieron de Sigma (Nueva York, NY, EE. UU.). El suero fetal bovino (FBS) y el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) se adquirieron de Invitrogen China Limited (Shanghai, República Popular de China). Ce (NO ₃ ) ₃ · 6H ₂ O, violeta de metilo (MV) y sulfato ferroso heptahidratado (FeSO ₄ ^. 7H ₂ O) se adquirieron de Aladdin Reagent Corporation (Shanghai, República Popular de China) y el peróxido de hidrógeno (30%) se obtuvo de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, República Popular de China). Todos los productos químicos eran reactivos analíticos y se utilizaron sin purificación adicional. En los experimentos se utilizó agua desionizada.

Síntesis de nanopartículas de óxido de cerio

Los CNP dopados con Ce se prepararon aplicando una ligera modificación del método de biomineralización basado en álbumes, como se describe en el documento [24]. El proceso de síntesis se ilustra a continuación:se disolvieron 1,25 g de BSA en 50,0 ml de agua desionizada y se agitó constantemente para formar la solución transparente. Luego, la solución de precursor de metal 300 mM Ce (NO ₃ ) ₃ · 6H ₂ Se añadieron lentamente O con agitación vigorosa, respectivamente. Simultáneamente, se disolvió NaOH 2,0 M en 50 ml de agua desionizada, que se empleó para ajustar el valor de pH de la mezcla. Vale la pena prestar atención a la solución que incluye NaOH que debe agregarse lentamente. Los CNP dopados con Ce se podrían formar después de agitar enérgicamente a un PH 12 a 55 ° C. Un tiempo de reacción suficiente para la formación de CNP dopados con Ce fue de aproximadamente 8 h; el sistema era el compuesto de marrón, enfriando a temperatura ambiente de forma natural. La suspensión adicional se filtró con una membrana de 0,22 µm (poli-éter sulfona) para reducir esas aglomeraciones a gran escala. La primera solución se dializó finalmente frente a agua durante 3 días en una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 14 kDa. La solución de diálisis recogida se liofilizó usando un liofilizador de vacío. Los polvos de CNP dopados con Ce se obtuvieron finalmente y se guardaron para una caracterización adicional.

Instrumentos y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio

Las morfologías de los CNP dopados con Ce se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) en un microscopio JEM-2100 (JEOL, Tokio, Japón) bajo un voltaje de aceleración de 200 kV. La distribución de tamaño fue estudiada por el software ImagingJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.). Las estructuras químicas de los CNP dopados con Ce se analizaron utilizando un espectrómetro de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) (Nicolet Nexus 470, GMI y Ramsey, MN, EE. UU.). La composición elemental se determinó mediante análisis elemental realizado mediante una espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). El análisis de difracción de rayos X (XRD) se realizó en un difractómetro Rigaku D / MAX-2000 (Japón) operado a 40 kV y 100 mA, con una rendija de 0.5 ° y una velocidad de escaneo de 7 ° min ^-1 , equipado con una fuente de radiación Cu Kα (λ =0.15418 nm). Los espectros de absorbancia UV-Vis se registraron utilizando un espectrofotómetro UV-2550 UV-Vis (Shimadzu, Kyoto, Japón).

Experimentos fotométricos UV-vis

El rendimiento antioxidante de CNP dopado con Ce y la actividad de eliminación de radicales libres se evaluaron mediante experimentos fotométricos UV-vis. Las soluciones de MV se prepararon en agua desionizada a una concentración de 3,0 × 10 ⁻⁴ M. Y FeSO ₄ 0,15 mM ^. 7H ₂ O se disolvió como alternativa. La solución suspendida de CNP dopados con Ce se reservó para su uso en concentraciones de 10 µM mediante la dispersión en tampón Tris-HCl 0,1 M a pH 5,0. Apropiadamente, el procesamiento ultrasónico puede mejorar la solubilidad de los CNP dopados con Ce. Las soluciones de reacción para fotometría abarcaron 3,0 × 10 ⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO ₄ ^. 7H ₂ O, 1,0 M H ₂ O ₂ , Tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 5,0) y CNP dopados con Ce 0,17 mM para alcanzar el volumen requerido de 10 ml (mezcla de solución de MV / FeSO ₄ ^. 7H ₂ O / H ₂ O ₂ / Director ejecutivo ₂ ) En final. La absorbancia de la solución de reacción se pudo medir después de incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Citotoxicidad de nanopartículas de óxido de cerio

La viabilidad celular de los CNP dopados con Ce se evaluó en células VSMC y 7721 mediante el ensayo CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) basado en el anillo de tetrazolio escindido y el descenso de la sal de tetrazolio soluble en agua de la cantidad de colorante formazán por deshidrogenasas. en células vivas. Brevemente, VSMC y 7721 celdas (1.5 × 10 ⁴ células por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos con cinco réplicas para cada grupo. Después de la eclosión durante 24 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ y la densidad celular había alcanzado el 80% de confluencia, el medio de crecimiento se reemplazó con DMEM fresco que contenía diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 μg / ml) de solución de CNP dopadas con Ce y se incubó durante 24 h. Luego, las células se lavaron con PBS y se agregaron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo. A continuación, las placas de 96 pocillos se incubaron durante otras 4 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ para permitir el crecimiento celular exponencial. Finalmente, la absorbancia de cada pocillo se detectó a una longitud de onda de emisión de 490 nm utilizando el lector de microplacas multimodo Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT, EE. UU.). Las células (en DMEM) sin tratamiento se utilizaron como control, y la viabilidad celular relativa (media ± error estándar de la media) se calculó utilizando muestra Abs / control Abs × 100%.

Modelo de ensayo de viabilidad de peróxido de hidrógeno en células in vitro

Como una especie de oxígeno activo oxidativo potente, el peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) es fácil de atravesar la membrana celular y reacciona con los iones de hierro intracelulares para formar radicales libres altamente reactivos según la teoría de Fenton, lo que lleva a una cadena de cambios. Al mismo tiempo, las variedades de estrés oxidativo celular inducido por H ₂ O ₂ están directamente involucrados en el proceso de apoptosis. Por lo tanto, 30% H ₂ O ₂ fue elegido para simular la apoptosis de las células en este estudio, que también se puede utilizar para ser un IC ₅₀ modelo para investigar más a fondo el efecto protector de los CNP dopados con Ce sobre el daño oxidativo. Según la discusión anterior, las células VSMC y 7721 se sembraron inicialmente a una densidad de 1,5 × 10 ⁴ células / pocillo en las placas de 96 pocillos. Una vez que las células se adhirieron, continuaron cultivándose durante 24 h más. Y la preparación fresca 30% H ₂ O ₂ se añadió a cada pocillo con diferentes concentraciones (50, 100, 200, 400, 800 umol / ml) para estimular el crecimiento de las células. Después de una eclosión de 4 horas y un lavado posterior con PBS, se agregaron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo durante 4 horas a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora _. Se empleó el lector de microplacas multimodo Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT, EE. UU.) Para determinar el valor absorbente de cada pocillo a 490 nm. El porcentaje de actividad celular se consideró como el índice del efecto de sobre la viabilidad celular, que dependía de la medición de la tasa de supervivencia celular en relación con la del control.

Ensayo de viabilidad celular e inducción de apoptosis in vitro

De la misma manera, se sembraron células VSMC y 7721 en las placas de 96 pocillos y se cultivaron. Al día siguiente, las células se pretrataron con diferentes concentraciones de CNP dopadas con Ce (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 y 400 μg / ml) durante aproximadamente 24 horas y se expusieron a la preparación fresca 30% H ^ {2}. O ₂ con la concentración adecuada para cada pocillo. Por otro lado, debe establecerse un grupo en blanco sin 30% H ₂ O ₂ y CNP dopados con Ce y el grupo de control estaba solo con H ₂ O ₂ soluciones. Cada grupo se estableció en seis paralelos. Después del tratamiento durante 4 hy un lavado posterior con PBS, se utilizó el ensayo CCK-8 para medir las condiciones apoptóticas de las células en cada pocillo a una densidad óptica de 490 nm como se describe anteriormente.

Ensayo de tinción de vivo-muerto y citometría de flujo

Para evaluar el potencial del efecto antioxidante de los CNP dopados con Ce, se cultivaron 7721 células en placas de seis pocillos con 4,0 × 10 ⁴ células en 100 ul de medio por pocillo y se dejó desarrollar durante 24 h. Luego, se establecieron seis grupos para que fueran de contraste simultáneo; incluía el control, H ₂ O ₂ grupo, 50 μg / ml de CNP dopados con Ce + H ₂ O ₂ , 100 μg / ml de CNP dopados con Ce + H ₂ O ₂ , 200 μg / ml de CNP dopado con Ce + H ₂ O ₂ y 400 μg / ml de CNP dopado con Ce + H ₂ O ₂ . Si bien las células habían crecido al 80% en cada grupo, el primer grupo se expuso a una condición de crecimiento normal sin H ₂ O ₂ y CNP dopados con Ce; el segundo grupo se incubó con el H ₂ seleccionado O ₂ sin CNP dopados con Ce durante 4 h, es decir, sin tratamiento; el tercer grupo al sexto grupo contenía diferentes concentraciones de CNP dopado con Ce (50, 100, 200 y 400 μg / mL) e indicó H ₂ O ₂ incubando durante 4 h, respectivamente. Después de eso, se utilizó tampón de trabajo FDA y PI para la tinción celular (Calcein AM / Ethidium Homodimer, Invitrogen). La fluorescencia de las células teñidas se observó bajo un microscopio de fluorescencia; las células vivas mostraron un color verde y las muertas son de color rojo.

Además, se utilizó el kit de apoptosis de anexina V-FITC / yoduro de propidio (PI) para cuantificar la tasa de apoptosis celular mediante tinción de fluorescencia doble. Brevemente, se cultivaron previamente células 7721 en placas de cultivo de seis pocillos de acuerdo con los pasos anteriores durante 24 h, hasta que las células 7721 se adhirieron al crecimiento. Después de eso, las células con diferentes dosis de medidas de tratamiento se recolectaron y lavaron tres veces con PBS a 4 ° C en cada grupo. Se notó que las células deben digerirse, recolectarse y centrifugarse suavemente, seguido de 2000 rpm durante 5 min. Posteriormente, las células se resuspendieron con 500 μl de tampón de unión y se ajustaron a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml. Y luego, la suspensión celular se llevó a un tubo de flujo que se tiñó con 5 µl de Anexina V-FITC y 5 µl de 20 µg / ml de solución de PI, respectivamente. Antes de que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante 15 min, se deben agregar 500 μl de PBS al tubo de reacción. Por último, los resultados experimentales se detectaron utilizando el método Annexin-V en un sistema de citómetro de flujo Beckman Coulter Epics XL MCL (BD Accuri C6), y el porcentaje de células apoptóticas se aclaró mediante análisis de software (Flowjo 7.6.2).

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se expresaron como la media ± error estándar de la media. Para la comparación de los diferentes grupos, se aplicó la técnica estadística de ANOVA con la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) para analizar los datos que se obtuvieron. A P valor de menos de 0.05 ( P <0,05) se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio

En este estudio, las dispersiones acuosas de CNP dopadas con Ce se obtuvieron usando Ce (NO ₃ ) ₃ ^. 6H ₂ O y BSA como precursores por método sintético inspirado en biomineralización. Durante la preparación, el BSA utilizado como principal fuente de carbono puede integrar los iones metálicos en nanopartículas metálicas debido a su estructura espacial única y la flexibilidad de la cadena molecular. En otras palabras, las nanopartículas dopadas con metal preparadas se componen principalmente de una estructura carbonosa y un elemento metálico cargado, que pueden ser diferentes de las nanopartículas de cerio inorgánico convencionales [25]. El examen morfológico se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y los tamaños de partículas resultantes se analizaron mediante el software ImagingJ. La Fig. 1a mostró imágenes TEM características de los CNP dopados con Ce resultantes. Estas imágenes reflejaban que los CNP dopados con Ce poseían una estructura poligonal, una dispersión uniforme y una forma discreta sin agregación aparente. El análisis estadístico indicó que los CNP dopados con Ce tenían una distribución de tamaño estrecha con un diámetro medio de 14,7 ± 0,8 nm (Fig. 1b), que era coherente con las imágenes TEM. Cuando los CNP dopados con Ce estuvieron en agua durante unos días, se puede encontrar que no hubo precipitación y aún se mantuvo la declaración de soluciones homogéneas, lo que indica su estabilidad a largo plazo en solución acuosa, lo que podría ser beneficioso para las siguientes aplicaciones biomédicas. .

un Imágenes TEM para CNP dopados con Ce. El recuadro mostraba una imagen TEM de alta resolución. b La distribución del diámetro de los CNP dopados con Ce

Ilustración esquemática del diseño de CNP dopados con Ce

La estructura química y la composición de la superficie de los CNP dopados con Ce

Los grupos funcionales de la superficie y la composición de los CNP dopados con Ce se investigaron utilizando un patrón de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) y un espectro de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR). Se utilizó XPS para caracterizar el estado de oxidación de los iones de cerio en la superficie de las muestras. El espectro XPS de la prospección (Fig. 2a) mostró tres picos predominantes a 902,0, 285,0 y 531,8 eV, lo que indicó la existencia de elementos de cerio, carbono y oxígeno de los CNP dopados con Ce. Las señales de azufre (S 2p) a 164,0 eV sugirieron que BSA se conjugó con éxito con los CNP dopados con Ce. La coexistencia de Ce (III) y Ce (IV) en el catalizador de CNP dopado con Ce podría evidenciarse mediante el espectro de la Fig. 2b. El espectro de alta resolución de Ce3d (Fig. 2b) podría dividirse en Ce3d ₃ y Ce3d ₅ (resultante de una división espín-órbita de 32 eV), exhibió la presencia de picos fuertes e indexados, ubicados en 882.0, 884.0 y 902.0 eV, respectivamente. Las señales Ce3d se dividieron principalmente en O ₂ , 3d _5/2 y 3d _3/2 , los picos entre 875 y 895 eV pertenecían al Ce3d _3/2 nivel, que casi coincidió con el espectro de publicadas anteriormente [26]. Además, el espectro XPS también implicó el 15,99% de Ce3d. Estas observaciones están de acuerdo con los resultados de la literatura para CeO ₂ nanopartículas [25]. El espectro C1s como se muestra en la Fig.2c fue descrito por tres picos principales en 285.0, 287.8 y 288.9 eV, lo que implicaba respectivamente que CeO ₂ Las nanopartículas se funcionalizaron con los niveles de energía 1s, C =O, C − F y COOR de C.La presencia del espectro de O1s como se muestra en la Fig.2d estuvo dominada por dos picos principales en 530.5 y 531.8 eV, que correspondían a la vínculo entre O ₂ ^- y Ce ³⁺ .

un Espectros XPS de los CNP dopados con Ce. Espectro de encuestas. b Espectro ce3d. c Espectro C1s. d Espectro de O1s

El análisis FTIR se llevó a cabo adicionalmente para verificar la formación de CNP dopados con Ce en el proceso de reacción. Como se muestra en la Fig. 3A, para los CNP dopados con Ce, apareció un pico intenso y ancho a 3400 cm ⁻¹ , que fue causado por la vibración de estiramiento de O – H y podría asignarse a la vibración de flexión del agua absorbida. El pico característico a 1510 cm ⁻¹ podría describirse como el tramo antisimétrico –O – C – O, mientras que el pico a 1450 cm ⁻¹ podría asignarse a la vibración de estiramiento simétrico de –O – C – O, los cuales demostraron la presencia de grupos nitrato. Además, una banda de absorción en 451 cm ⁻¹ fue asignado al tramo asimétrico Ce-O, lo que indica la formación de CNP dopados con Ce. Estos resultados mostraron que los grupos funcionales de los CNP dopados con Ce contenían principalmente ciertos −OH y –COO ^- grupos.

Espectros FTIR de BSA y CNP dopados con Ce. B Patrón XRD de los CNP dopados con Ce. C Espectros de absorción UV-Vis de CNP dopados con Ce. D Espectros de absorción UV-Vis del violeta de metilo (MV) después de varios tratamientos. un MV, b MV tratado con H ₂ O ₂ y CNP dopados con Ce, c MV tratado con FeSO ₄ y H ₂ O ₂ y d MV tratado con FeSO ₄ , H ₂ O ₂ y soluciones de CNP dopadas con Ce en un tiempo de incubación de 5 min

Según el análisis de difracción de rayos X (XRD), se investigó la estructura cristalina de los CNP dopados con Ce. Como se muestra en la Fig. 3B, hay cuatro picos de difracción principales a 24,4 °, 30,3 °, 35,23 ° y 43,2 °. Uno de estos picos a 24,4 ° puede atribuirse a la estructura carbonosa inorgánica producida, que es similar a los puntos cuánticos de carbono y los picos característicos del grafito informados [27,28,29]. En comparación con la estructura cristalina ordenada del grafito (002 planos, 2 θ =26,5 °), el pico de difracción de los CNP dopados con Ce alrededor de 24,4 ° con un desplazamiento más bajo se debilita, lo que puede atribuirse a un carbono altamente desordenado y al aumento de la sp ² (C – C) espaciamiento de capas en el proceso de carbonización [30]. Los picos de difracción en ángulos de 30,3 °, 35,23 ° y 47,42 ° coincidían principalmente con los planos (111), (200) y (220), respectivamente, de las nanopartículas de ceria convencionales. Además, otros picos en ángulos de 56,30 °, 69,00 °, 75,57 ° y 78,99 ° correspondían a (311), (400), (331) y (402) del óxido de cerio referenciado (JCPDS 2004 36-1253). El espaciado correspondiente \ (\ left (\ mathrm {Fm} 3 \ overline {\ mathrm {m}} \ right) \) se calculó de acuerdo con la ley de Bragg (la longitud de onda de la ley de Cu-Kα es 0.154 nm). Estos resultados podrían confirmar preliminarmente los CNP dopados con Ce con la estructura cristalina híbrida.

Era bien sabido que Fe ²⁺ puede catalizar alternativamente la dismutación del peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) en otro radical hidroxilo reactivo según la reacción de Fenton [31]. Como reactivo cromogénico, la solución de violeta de metilo muestra principalmente púrpura. Dirigido con –C =C–, el radical hidroxilo puede reaccionar con el violeta de metilo, dando como resultado MV un color poco profundo incluso incoloro, y su absorbancia máxima de UV-Vis a 582 nm disminuye [32]. De acuerdo con nuestro diseño, los CNP dopados con Ce ciertamente pueden eliminar el radical hidroxilo y finalmente aumentar la absorbancia del MV a 582 nm.

Para confirmar la capacidad de captación de radicales libres subyacente para los CNP dopados con Ce, se emplearon espectros de absorción UV-Vis de MV para proporcionar algunos conocimientos. No hubo absorbancia significativa de 500 a 700 nm en la solución acuosa de CNP dopados con Ce en la Fig. 3C. Sin embargo, pudimos observar la absorbancia máxima del violeta de metilo a aproximadamente 582 nm y la absorbancia se inhibió bajo H ₂ O ₂ tratamiento (Fig. 3D). Al agregar CNP dopados con Ce en la solución de mezcla, obviamente se recuperó la absorbancia, lo que demostró que los CNP dopados con Ce tenían la capacidad de eliminar el radical hidroxilo y proteger el MV contra el ataque en esta condición experimental. Estos resultados tendrán una aplicación biomédica adicional en el tratamiento de enfermedades causadas por radicales libres.

Ensayo de citotoxicidad de nanopartículas de óxido de cerio in vitro

Antes de aplicar CNP sintetizados dopados con Ce para el tratamiento de enfermedades asociadas al estrés oxidativo, es fundamental evaluar su biocompatibilidad. En este estudio, el efecto de los CNP dopados con Ce sobre la viabilidad celular se evaluó mediante la incubación de células VSMC y 7721 con CNP dopados con Ce utilizando pruebas de viabilidad celular del ensayo CCK-8. Puede verse que la viabilidad celular no mostró cambios significativos después de diferentes concentraciones de tratamiento con CNP dopados con Ce durante un tiempo de exposición de 24 h (Fig. 4a). Incluso a la dosis más alta de 400 μg / ml, la viabilidad celular en todos los grupos de tratamiento fue aproximadamente del 90%, lo que demuestra que los CNP dopados con Ce tenían una citotoxicidad muy leve en las células. Estos hallazgos destacaron la citocompatibilidad favorable de los CNP dopados con Ce y los permitieron adecuados para aplicaciones biomédicas.

un El efecto de diversas concentraciones de CNP dopados con Ce sobre la viabilidad celular de VSMC y células 7721 por CCK-8. Las células fueron pretratadas con CNP dopadas con Ce a diferentes concentraciones durante 24 horas y luego fueron administradas por H ₂ O ₂ en diferentes dosis. b Viabilidad celular de VSMC y c 7721 células cultivadas con diferentes concentraciones de CNP dopado con Ce por debajo de 560 μM H ₂ O ₂ -estrés oxidativo inducido por ensayo CCK-8

Propiedades antioxidantes y actividad de eliminación de radicales libres de los CNP dopados con Ce in vitro

La propiedad de la enzima mimética de los nanomateriales de óxido de cerio favorece sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se examinó si los CNP dopados con Ce en solución protegerían suficientemente las células VSMC y 7721 contra los radicales libres. Para estos estudios, H ₂ O ₂ se utilizó para inducir la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que conducen al deterioro celular o la muerte. En primer lugar, el IC ₅₀ Se determinó el valor de la viabilidad celular para explorar el efecto protector de los CNP dopados con Ce. La viabilidad de las células VSMC y 7721 exhibió el valor bajo después de la adición de H ₂ O ₂ . Se observó una tendencia de mayor actividad apoptótica para VSMC y células 7721 con el aumento de H ₂ O ₂ concentración en solución (Fig. 4b). En otras palabras, la elevación de ROS dependía de la dosis, lo que también reveló la dosis letal mediana (LD ₅₀ ) de células VSMC y 7721 fue de aproximadamente 549 y 556 umol / ml, respectivamente. Como resultado, el LD ₅₀ H ₂ O ₂ vía estrés oxidativo fue de 560 μM, que se acerca a los resultados de la literatura [33].

A continuación, el efecto antioxidante de los CNP dopados con Ce bajo LD ₅₀ de H ₂ O ₂ se probó usando un ensayo de kit de recuento de células-6 (CCK-8). Debido a sus propiedades electrónicas únicas, los CNP dopados con Ce tienen una tendencia inherente a existir en estados de oxidación dual (Ce ³⁺ y Ce ⁴⁺ ) y se les confiere actividad antioxidante a través del comportamiento de oxidación-reducción. Cuando existe ROS, Ce ⁴⁺ se puede cambiar continuamente a Ce ³⁺ junto con la persistente actividad de eliminación de radicales libres [34, 35]. Como se muestra en la Fig. 4c, estos resultados implicaron que la viabilidad celular de las células VSMC y 7721 se había mejorado gradualmente con el aumento de la concentración de CNP dopados con Ce bajo el mismo estrés oxidativo. Especialmente, la viabilidad celular se recuperó aproximadamente en un 88,0% a la concentración de CNP dopado con Ce de 400 µg / ml. En consecuencia, los CNP dopados con Ce exhibieron un efecto antioxidante sobresaliente de una manera dependiente de la dosis a través de una capacidad eficaz de eliminación de radicales libres.

Se empleó un ensayo de citometría de flujo y tinción en vivo-muerto para descubrir aún más el efecto cito-antioxidante de los CNP dopados con Ce. Como se muestra en la Fig. 5, se observó una fluorescencia verde intensa sin rojo en las células 7721 tratadas con CNP único dopado con Ce, pero se pudo ver mucha fluorescencia roja en el H ₂ O ₂ tratamiento de 556 uM, que demostró H ₂ O ₂ podría inducir dramáticamente la apoptosis celular. Pero H ₂ O ₂ -la apoptosis inducida por el ácido se había aliviado gradualmente con el aumento de las concentraciones de CNP dopado con Ce. En particular, solo se pudo ver una pequeña cantidad de fluorescencia roja después del tratamiento con CNP dopado con Ce de 400 μg / ml bajo H ₂ O ₂ -estrés oxidativo inducido que indicó una mayor viabilidad celular. Además, se llevó a cabo un ensayo de citometría de flujo para investigar el efecto antioxidante de los CNP dopados con Ce. En el gráfico de dispersión de la citometría de flujo variable doble, la señal de emisión de Anexina-V-FITC se representó en la x -eje, mientras que la señal de emisión de PI se trazó en el y -eje. Varias regiones de células se definieron de la siguiente manera:Anexina V- / PI –– se consideran células vivas, Anexina V + / PI –– significa células de apoptosis temprana y Anexina V + / PI + –– representa células de apoptosis / necrosis tardía. Como se muestra en la Fig.6, el grupo de control exhibió una fracción pequeña y normal de apoptosis tardía celular del 1.45%, pero H ₂ O ₂ El tratamiento mostró una tasa extremadamente alta de apoptosis tardía celular del 46,4%. Como esperábamos, la proporción de células apoptóticas tratadas con diferentes concentraciones de CNP dopadas con Ce tiene una tendencia descendente gradual. En comparación con el 46,4% de la apoptosis tardía celular bajo H ₂ O ₂ tratamiento, el porcentaje de apoptosis disminuyó notablemente a 24,2, 20,0, 15,1 y 11,2% después del tratamiento con CNP dopado con Ce de 50, 100, 200 y 400 μg / ml. Basándose en los resultados de la tinción de muertos vivos y la citometría de flujo, reveló que los CNP dopados con Ce ejercen efectos antioxidantes favorables contra la apoptosis inducida por estrés oxidativo de una manera dependiente de la dosis.

Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H₂ O ₂ -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)

Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments

Conclusions

In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H₂ O ₂ , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.

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