Síntesis verde en un paso de nanopartículas de oro multifuncionales para imagen y terapia tumoral dirigida

Resumen

Las nanopartículas de oro (GNP) se han usado siempre como vectores de transporte de doxorrubicina (DOX) para diagnóstico y terapia tumoral; sin embargo, el proceso de síntesis de estos vectores requiere preparar GNP mediante método de reducción química primero, seguido de conjugación con DOX o péptidos específicos, enfrentando problemas comunes: múltiples pasos, alto costo, tiempo prolongado, preparación complicada y post-procesamiento. Aquí presentamos por primera vez una estrategia en un paso para preparar GNP conjugadas con DOX basándose en la constitución química del DOX. Además, preparamos GNP multifuncionales (DRN-GNP) en un paso mediante los grupos funcionales reductores del DOX, péptidos RGD y péptidos de localización nuclear (NLS), en solo 30 min. Resultados de imágenes de dispersión y estudios TEM celulares indicaron que DRN-GNP dirigen al núcleo de células HeLa. Las tasas de inhibición tumoral de DRN-GNP vía inyección tumoral y vena cola en ratones nu fueron 66,7% y 57,7%, respectivamente, significativamente superiores a grupos control. La síntesis en un paso de GNP multifuncionales no solo ahorra tiempo y materiales, sino que se alinea con la química verde, sentando bases para aplicaciones a gran escala en el futuro próximo. Nuestros resultados sugieren que la estrategia es eficiente y las DRN-GNP preparadas poseen buena estabilidad coloidal en sistema fisiológico; son un agente de contraste potencial y vector eficiente de transporte DOX para diagnóstico y terapia de cáncer cervical.

Introducción

La doxorrubicina (DOX) es fármaco anticancerígeno común usado ampliamente en quimioterapia de diversos cánceres: tumores malignos sanguíneos, variedad de adenocarcinomas, sarcomas de tejidos blandos, etc. Sin embargo, uso prolongado y altas dosis de DOX causan resistencia, náuseas, caída cabello, toxicidad aguda y crónica, pudiendo llevar a insuficiencia cardíaca congestiva. Por tanto, es necesario desarrollar portador fármaco con buena biocompatibilidad y alta capacidad carga. En años recientes, muchos nanomateriales (puntos cuánticos, quitosano, nanomateriales silicio, poliméricos, fluorescentes, metálicos) se desarrollaron como vectores transporte DOX para diagnóstico y terapia tumoral. Los nanomateriales de oro se usan ampliamente por sus propiedades químicas y ópticas únicas, baja toxicidad, buena biocompatibilidad y control capacidad modificación superficial. Hasta ahora, tres enfoques para conjugación DOX en GNP: (1) conjugar DOX en superficie GNP con ayuda hidracina, EDC, agente sensible pH, sistema DCC/NHS; (2) incubar GNP con DOX al menos 24 h; (3) reemplazar citrato conjugado en superficie GNP por DOX. Aunque estos GNP conjugados DOX se usaron en terapia tumoral, la aplicación sigue limitada por falta especificidad suficiente. Recientemente, grupo El-Sayed funcionalizó GNP con DOX, péptidos RGD y NLS. Lo destacado: GNP entran células tumorales vía endocitosis mediada por receptor RGD y luego núcleo por NLS, haciendo DOX interferir eficazmente síntesis ADN. Desafortunadamente, necesitaban al menos 120 h acoplando péptidos/fármacos capa por capa en GNP, cada proceso al menos 24 h. Similarmente, todos los métodos mencionados enfrentan problemas comunes: múltiples pasos, alto costo, preparación complicada y post-procesamiento. Por tanto, necesario desarrollar método simple y rápido para síntesis nanomateriales oro multifuncionales.

En este artículo, presentamos estrategia en un paso para preparar GNP conjugadas DOX basándose en constitución química DOX por primera vez. Además, método sintético conveniente para preparar vector transporte DOX multifuncional para diagnóstico y terapia tumoral. La diferencia clave de nuestro trabajo: usamos DOX, péptidos RGD y NLS como reactivos reductores y estabilizadores para fabricar GNP y conjugar las tres sustancias en superficie GNP formando DRN-GNP simultáneamente. Nuestros trabajos previos probaron que RGD y otros péptidos reducen iones oro para fabricar nanomateriales oro. El N-terminal NLS puede modificarse con secuencia cisteína-cisteína-tirosina (CCY) construyendo CCYNLS, que reduce iones oro manteniendo efecto direccionamiento NLS. También hallamos que DOX posee dos grupos hidroxilo fenólicos con fuerte reducibilidad en condición básica, por lo que puede reducir iones oro formando GNP. Además, efecto antitumoral DOX podría no influenciarse porque se intercala ADN por grupo amino carbono 7 e hidroxilo carbono 9. Simultáneamente, azufre, oxígeno y nitrógeno en péptidos y DOX combinan con GNP manteniendo estabilidad coloidal. Resultados muestran DRN-GNP fabricados exitosamente y funcionan bien en imagen, diagnóstico y terapia tumoral (Esquema 1). A nuestro conocimiento, primer reporte síntesis GNP multifuncionales conjugadas DOX, RGD y NLS en un paso y aplicación en diagnóstico y terapia tumoral.

Ilustración esquemática síntesis DRN-GNP, captación por células HeLa y diagnóstico tumoral DRN-GNP

Materiales y Métodos

Materiales

HAuCl₄·4H₂O de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Péptidos RGD cíclicos (secuencia arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutámico c(RGDyE)) e hidróxido sodio mismos que ref. [35]. Doxorrubicina de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Péptidos CCYNLS (secuencia cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina, CCYPPKKKRKV) de China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). Líneas celulares HeLa y MCF-7 de Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Suero fetal bovino (FBS) y medio DMEM modificado Dulbecco de GibcoBRL Life Technologies. Kit Ensayo Proliferación y Citotoxicidad (MTT) de Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Síntesis DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP

Para DOX-GNP: solución DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) añadida a solución ácido cloroáurico (0,86 mM, 1,0 mL) bajo agitación magnética, luego NaOH (2 M, 5 μL) para ajustar pH. Para NLS-GNP: solución péptidos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) añadida a ácido cloroáurico (3,44 mM, 1,0 mL) bajo agitación, luego NaOH (2 M, 20 μL) ajustar pH. Para DR-GNP: solución DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) y péptidos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) añadidas a ácido cloroáurico (1,72 mM, 2,0 mL) bajo agitación, luego NaOH (2 M, 15 μL) ajustar pH. Para DN-GNP: solución DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) y péptidos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) añadidas a ácido cloroáurico (1,72 mM, 2,0 mL) bajo agitación, luego NaOH (2 M, 20 μL) ajustar pH. Para DRN-GNP: soluciones DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), péptidos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL), péptidos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) añadidas a ácido cloroáurico (1,72 mM, 3,0 mL) bajo agitación, luego NaOH (2 M, 35 μL) ajustar pH. Todas reacciones continuaron 30 min a 100 °C en sistema reflujo, pH 10-12. Todas GNP purificadas por centrifugación 55.000 rpm 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Tras retirar sobrenadante, GNP redispersadas en agua ultrapura.

Caracterización

Espectros GNP implementados con espectrofotómetro UV 3150 (Shimadzu, Japón), espectrómetro FTIR Nicolet Avatar modelo 330 (Thermo, América), y espectroscopía fotoelectrónica rayos X ESCALab250 (XPS) mismas condiciones analíticas ref. [35]. Imágenes TEM GNP obtenidas de TEM (JEM-2100F, JEOL, Japón) operado 200 kV.

Mediciones Dispersión Luz Dinámica y Potencial Zeta

Analizador Potencial Zeta Zeta PALS (Brookhaven Instrument Corporation) usado medir dispersiones luz dinámica (DLS) DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP, trabajando ángulo 90° láser estado sólido (λ = 670 nm) TA. Equipado electrodo AQ-827, analizador usado medir potenciales zeta GNP.

Análisis ICP

Análisis cuantitativo Au en GNP mismo ref. [35].

Estabilidad DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP Dispersos en PBS, HCl, NaOH, NaCl

Mezclamos 100 μL GNP precipitadas y 500 μL alta concentración 0,2 M PBS, 0,5 M HCl, 0,5 M NaOH, 1,0 M NaCl respectivamente. 12 h después, tomamos fotos y probamos espectros absorción UV.

Cultivo Celular

Células HeLa y MCF-7 cultivadas en incubadora (humidificada 5% CO₂ aire equilibrado) 37 °C 24 h. Medio DMEM 10% FBS. Células vivas contadas tablero conteo celular.

Ensayo Citotoxicidad DOX Libre y DRN-GNP

Células HeLa y MCF-7 fase exponencial añadidas pozos placas 96 (~5 × 10³ células/pozo) incubadas 24 h. Luego DRN-GNP concentraciones 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL (DOX correspondiente 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 μg/mL) incubadas cada pozo 24 h a 37 °C. Control: solo tampón PBS, viabilidad 100%. MTT (20 μL, 5 mg/mL) añadido cada pozo incubado 37 °C ~4 h. Medio aspirado cuidadosamente, 150 μL dimetilsulfóxido dos añadido por pozo 10 min hasta disolución completa cristales. Lector microplacas (Thermo Multiskan Mk3) midió OD cada pozo 490 nm. Tres pozos cada grupo, valores calculados media ± DE.

Experimento Citometría Flujo

Células HeLa y MCF-7 fase exponencial añadidas cada pozo dos placas 12 pozos (~5 × 10⁴ células/pozo) incubadas 24 h. Luego solución DRN-GNP añadida cada pozo (concentraciones finales 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL) incubadas 37 °C 24 h. Retirando medio y añadiendo solución Tripsina (EDTA) para digerir células. Retirando Tripsina, añadiendo medio, transfiriendo células tubos centrífuga. Centrifugando 1000 g 5 min, sobrenadante removido, células cada tubo recolectadas y contadas en PBS. ~5-10 × 10⁴ células tomadas otros tubos centrifugados 1000 g 5 min otra vez. Retirando sobrenadante, añadiendo 100 μL tampón AnnexinV. Añadiendo 5 μL AnnexinV-FITC y 5 μL yoduro propidio tubos mezclando suavemente con células. Tubos incubados TA (20-25 °C) 15 min oscuridad y analizados citómetro flujo (BD Accuri C6).

Imagen Dispersión Campo Oscuro Óptico y Microscopía Electrónica Transmisión en Cultivo Celular

Células HeLa y MCF-7 implantadas portaobjetos 8 hoyos ~7 × 10³ células cada uno. DRN-GNP añadidos cada hoyo concentración final 35 μg/mL. Tras incubar 24 h, removimos físicamente GNP libres absorbidas enjuagando células PBS tres veces. Fijamos 4% paraformaldehído 20 min, gotas glicerol, sellamos portaobjetos con cubreobjetos. Microscopio campo oscuro (Zeiss Imager Z1) usado evaluar células ×200 aumento modo reflectivo. Tiempo exposición campo claro/oscuro 5 V: 1 ms y 400 ms.

Para estudios TEM, células HeLa y MCF-7 incubadas DRN-GNP (35 μg/mL) 24 h en frasco cultivo. Tras incubar y aspirar solución medio/DRN-GNP, enjuagamos células PBS tres veces, digerimos tripsina. Células transferidas tubo centrífuga poco volumen medio DMEM. Centrifugadas (1500 rpm) 10 min, medio aspirado cuidadosamente, solución glutaraldehído 3% (usualmente 40x volumen materiales) añadida cuidadosamente fijar células fondo tubo >1 h. Fijadas adicionalmente 1% tetróxido osmio 1 h, deshidratadas etanol, embebidas Spurr (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Cortadas secciones, teñidas acetato uranilo acuoso y citrato plomo, montadas rejilla cobre (300 malla). Espécimenes medidos microscopio transmisión FEI TECNAI-12 (voltaje trabajo 120 kV).

Experimentos Animales

Sujetos Animales

Ratonas nu athymic compradas Centro Experimental Animal Universidad Médica Sur (Guangzhou, China) para prueba terapia tumoral in vivo. Todos experimentos animales cumplieron Reglas Gestión Animales Ministerio Salud República Popular China (Doc. NO. 55, 2001) y guías Cuidado Uso Animales Laboratorio Universidad Farmacéutica China.

Eficacia Terapéutica DOX Libre y Conjugados Ratones Portadores Tumor

Brevemente, 36 ratones nu (5-6 semanas, 16-18 g) divididos aleatoriamente seis grupos. Inyectados subcutáneamente células HeLa (5 × 10⁶ células PBS) fosa axilar derecha. 5 días después, grupo control inyectado vena cola solución salina (0,154 mol/L, 0,2 mL). Ratones DOX libre, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP inyectados vena cola también. Para comparar eficacia anti-tumor DRN-GNP entre inyección intravenosa y tumoral, grupo inyectado cantidad igual DRN-GNP en sitio tumor. Cinco grupos mantuvieron dosis 0,3 mg/kg DOX libre o conjugado equivalente cada ratón. Cada ratón inyección vena cola o tumor una vez al día. Peso corporal y volumen tumor monitoreados cada día 14 días. Para investigar efectos terapéuticos DOX, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP, tumores seis grupos extirpados análisis patológico tras 14 días tratamiento. Tumores y órganos internos corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón aislados, fijados formalina neutra 10%, embebidos parafina. Tejidos tumorales cortados teñidos Hematoxilina-Eosina (H&E) examinados microscopio óptico Olympus.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

En síntesis DOX-GNP, al añadir NaOH a mezcla DOX y ácido cloroáurico, color cambió naranja a púrpura claro, luego rojo vino a 100 °C reflujo agitación magnética en un minuto, indicando formación DOX-GNP. Resultado indicó capacidad reducción DOX muy fuerte porque DOX posee dos grupos hidroxilo fenólicos (carbonos 6 y 11) con fuerte reducibilidad condición básica. Reacción continuó 30 min hasta color no cambie.

Para evitar confusión color naranja-rojo DOX y rojo vino GNP, aportamos más evidencia caracterizando espectros absorción UV (Fig. 1a). DOX pico característico absorción cerca 485 nm y pico 530 nm; sin embargo, pico 480 nm desapareció en espectro producto y pico característico 520 nm resonancia plasmón superficial (SPR) GNP apareció. Aun así, formación GNP no completamente determinada entre 520 nm GNP y 530 nm pico DOX. Considerando GNP precipitan centrifugación alta velocidad y moléculas DOX no, vemos precipitado púrpura fondo tubo centrifugadora (rec Fig. 1a(3-4)) y DOX no (rec Fig. 1a(1-2)).

a Espectros absorción UV-Visible DOX y DOX-GNP preparados, recuadro (a) imágenes DOX (1,2) y DOX-GNP (3,4) antes (1,3) y después centrifugación (2,4). b Imagen TEM DOX-GNP. c Espectros FTIR DOX y DOX-GNP preparados. d Espectro XPS DOX-GNP

DOX fluorescencia roja bajo irradiación 365 nm UV; sin embargo, fluorescencia DOX desapareció tras síntesis GNP. Dos razones: (1) coeficiente extinción GNP muy fuerte, tienden apagar fluorescencia moléculas cuando cercanas superficie GNP (<5 nm); si distancia aumenta 20 nm o más, campo plasmónico nanopartícula demasiado lejano apagar señal fluorescencia; (2) grupo fluorescente DOX destruido tras actuar como agente reductor. Fig. 1c, aunque número picos absorción IR DOX-GNP significativamente menor que DOX, muchas características DOX retenidas: picos característicos 2910 cm⁻¹ (C-H estiramiento), 1631 cm⁻¹ (carbonilo estiramiento), 1114 cm⁻¹ (C-O, C-N estiramiento), 867 cm⁻¹ (N-H, C-H flexión fuera plano). Picos representativos DOX también mostrados espectros DOX-GNP, indicando DOX unido exitosamente. Interesantemente, pico 1214 cm⁻¹ característico vibración estiramiento C-O grupo hidroxilo fenólico desapareció en espectros DOX-GNP. Grupo fenólico reduce iones Au a GNP, luego transportado a grupo carbonilo. Especulamos efecto DOX no afectado, porque se intercala ADN por grupo amino carbono 7 e hidroxilo carbono 9.

Observamos tamaño DOX-GNP ~6 nm resultados TEM (Fig. 1b). Proporción Au(I) calculada 31,93% espectro XPS DOX-GNP (Fig. 1d), suficiente mantener estabilidad coloide. Sin embargo, al dispersar depósito DOX-GNP en PBS 0,2 M alta centrifugación tras retirar sobrenadante, color solución púrpura negro, floculento insoluble visible. Indicó estabilidad DOX-GNP no buena en alta concentración sal. Explicable: DOX posee solo grupo amino, no grupo sulfhidrilo, insuficiente para conectar superficie GNP vía enlaces Au-S y Au-N. Más esfuerzos necesarios si DOX-GNP usado agente contraste y material anti-tumor imagen y terapia tumoral.

Sintetizamos DRN-GNP con DOX, péptidos RGD y NLS como agentes reductores y estabilizadores. Péptidos RGD dirigen específicamente células tumorales sobreexpresan integrina α_vβ₃, péptidos NLS dirigen específicamente núcleo. Figura 2a muestra espectros UV-Vis DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP fabricados; características pico absorción plasmón superficial 520-530 nm. También se ve en recuadro GNP color rojo vino brillante. Imágenes TEM (Archivo adicional 1: Figura S1) muestran tamaño partícula NLS-GNP y DRN-GNP ~10 nm y 5 nm, GNP distribuidas uniformemente, sin coagulación obvia.

a Espectros UV-Vis e imágenes foto DOX-GNP (a), NLS-GNP (b), DRN-GNP (c). b Espectros UV-Vis DOX básico, péptidos RGD, NLS, sobrenadante DRN-GNP. c Espectros FTIR péptidos NLS, NLS-GNP, DRN-GNP. Distancia entre espectro GNP y péptidos NLS ampliada contraste distinto

Para validar síntesis NLS-GNP y DRN-GNP, caracterizamos espectros FTIR péptidos NLS y GNP Fig. 2c. Algunos picos FTIR péptidos NLS encontrados en espectros NLS-GNP y DRN-GNP: pico absorción vibración estiramiento C-H (2840-2972 cm⁻¹), pico vibración estiramiento C=O (1630-1700 cm⁻¹), pico flexión =C-H en plano (1300-1475 cm⁻¹); indicó péptidos CCYNLS conjugados exitosamente superficie GNP. También hallamos pico vibración esqueleto benceno tirosina terminal péptido NLS 1529 cm⁻¹ y pico vibración estiramiento C-O hidroxilo fenólico 1193 cm⁻¹ desaparecieron en espectros IR NLS-GNP y DRN-GNP, significa esqueleto benceno tirosina terminal transportado estructura quinona tras actuar como agente reductor.

Centrifugamos DRN-GNP alta velocidad, recogimos sobrenadante casi incoloro, probamos reactivos restantes via UV-Vis Fig. 2b. Picos UV absorción RGD y NLS derivados residuos tirosina, pico 275 nm. Sin embargo, grupo hidroxilo fenólico se convirtió iones oxígeno negativos condiciones alcalinas, aumenta densidad electrón anillo benceno, pico desplazado rojo 292 nm. No vimos pico característico en espectro UV-Vis sobrenadante DRN-GNP, significando ambos péptidos participaron reacción. DOX posee tres picos absorción 450-600 nm, pero sobrenadante DRN-GNP no los tiene. Además, no DOX en sobrenadante porque color marrón claro pero DOX condición básica púrpura transparente claro. Concluimos tres materiales reaccionan casi completamente. Similarmente, DR-GNP y DN-GNP explicados así, ver Archivo adicional 1: Figura S2.

Usamos espectroscopía XPS examinar valencia Au NLS-GNP y DRN-GNP. Fig. 3a, b, dos picos energías enlace ~83,6 eV y 87,0 eV consistentes emisión fotoelectrones Au 4f_7/2 y 4f_5/2. Posición energía enlace Au 4f_7/2 ambos GNP casi 84,0 eV. NLS-GNP: desconvolucionado Au(0) (83,5 eV) y Au(I) (84,1 eV), ratio área picos 57% y 43%. DRN-GNP: desconvolucionado Au(0) (83,6 eV) y Au(I) (84,4 eV), ratios 62% y 38%, mayor proporción Au(I). Carga forma complejos Au(I)-S, ayudan mantener estabilidad coloidal GNP. Interesantemente, identificamos tres tipos S en espectros XPS NLS-GNP, DN-GNP, DRN-GNP Archivo adicional 1: Figura S3. Curvas azul y negro representan estados oxidación azufre, curvas moradas enlace S-H, curva verde enlace Au-S. Formación enlace Au-S ilustra péptidos NLS conjugados exitosamente superficie estos tres GNP.

Espectro XPS Au 4f (a) NLS-GNP, (b) DRN-GNP. Energía enlace Au 4f_7/2 espectros originales (negro) y ajustados (rojo) desconvolucionados dos componentes, Au(0)-curva azul y Au(I)-curva morada. Espectros absorción UV-Vis e imágenes DRN-GNP dispersos PBS, NaCl, NaOH, HCl (c).

Además, picos N 1s, C 1s, O 1s XPS demostraron péptidos y DOX unidos GNP (Archivo adicional 1: Figura S4).

Espectros XRD (Archivo adicional 1: Figura S5) mostraron estructura cristalina estos GNP cúbica centrada caras, porque todos espectros XRD contienen cuatro picos 38,2°, 44,5°, 64,7°, 77,8° correspondientes planos (111), (200), (220), (311).

Estabilidad DRN-GNP

Datos dispersión luz dinámica (DLS) y potencial zeta estos cinco GNP mostrados Tabla 1; tamaño hidrodinámico mayor que TEM, atribuible cierta cantidad moléculas hidratadas alrededor núcleo GNP solubles agua. Potenciales zeta negativos por grupo carboxilo conjugado superficie GNP. Solución GNP muestra buena estabilidad coloidal cuando valor absoluto potencial zeta >30 mV; mayor valor absoluto, mejor estabilidad. Tabla 1 muestra todos poseen buena estabilidad. Comparativamente, valor potencial zeta NLS-GNP más alto, quizás porque superficie llena péptidos NLS forman fuerte enlace Au-S vía grupo tiol. Valor absoluto potencial zeta DOX-GNP cercano 30 mV; consistente con mención previa estabilidad DOX-GNP no buena dispersadas PBS. Datos espectros Archivo adicional 1: Figura S6.

Cambios bandas resonancia plasmón superficial (SPR) característico GNP usados determinar agregación GNP utilizando espectrometría UV-Vis. Medimos espectros UV-Vis y fotos DRN-GNP (Fig. 3c) dispersos alta sal (1 M NaCl, 0,2 M PBS), ácido fuerte (0,5 M HCl), base fuerte (0,5 M NaOH). Ni cambio color solución ni desplazamiento UV-Vis observado diversas condiciones duras excepto HCl, donde color cambió púrpura ligero y pico absorción UV desplazado rojo ~20 nm, significando GNP coagulan ligeramente condición ácido fuerte. Razón: estabilidad coloidal GNP cargados negativamente afectada condición fuertemente ácida, pero no influenciada PBS neutro y ambiente alcalino. Concluimos DRN-GNP altamente estables alta sal y alcalino, indicando DRN-GNP sintetizados esperados para imagen celular in vitro y terapia anti-tumor in vivo.

Imagen Dispersión Campo Oscuro Plasmónica Células Tumorales y Microscopía TEM Celular

Para imagen dirigida específica células tumorales DRN-GNP, seleccionamos células HeLa grupo prueba y MCF-7 control. Razón: HeLa sobreexpresan integrina α_vβ₃ pero MCF-7 no, sin unión específica RGD, buen control. Captación DRN-GNP ambas líneas tras incubación 24 h concentración final 35 μg/mL evaluada microscopio fluorescencia vertical modo campo oscuro. Células sin GNP no muestran dispersión plasmónica (Fig. 4 A-HeLa, 5C-MCF-7). Imágenes HeLa tratadas DRN-GNP muestran señales dispersión GNP fuertemente localizadas núcleo (Figs. 4b, 5e). Sin embargo, apenas vimos dispersión luz MCF-7 incubadas DRN-GNP, aunque poca cantidad GNP pudo entrar células tumorales por efecto permeabilidad retención pasivo mejorado (EPR) (Figs. 4d, 5f), efecto EPR fenómeno único tumores sólidos diferencias anatómicas/fisiopatológicas tejidos normales. Ej: angiogénesis alta densidad vascular tumores, grandes huecos entre células endoteliales vasos tumorales, tejidos tumorales muestran extravasación selectiva y retención fármacos macromoleculares. Así, podrían no detectarse claramente mismas condiciones. Resultados demostraron endocitosis HeLa vía endocitosis mediada receptor facilitada por péptidos RGD superficie GNP. Péptidos NLS mantienen actividad dirigir específicamente núcleo. DRN-GNP sintetizados potencial agente contraste imagen tumoral dirigida.

Contenido filas: "PBS buffer" células incubadas PBS, "DRN-GNP" células incubadas DRN-GNP. Subíndice "1" imágenes campo claro, "2" campo oscuro, "3" superposición (claro-oscuro). Barras escala 20 μm. Imagen E región pequeña elegida B₃ Fig. 4, F región pequeña D₃ Fig. 4, barras 10 μm

Imágenes TEM DRN-GNP incubadas HeLa y MCF-7 24 h. A₁, A₂, A₃ corresponden HeLa; B₁, B₂ MCF-7

Tabla 2 muestra valores ratio entre media gris densitométrica células y fondo misma imagen, correlación positiva con cantidades DRN-GNP captadas ambas líneas. Ratios células incubadas PBS y MCF-7 casi 1,0, brillo células cercano fondo. Ratio HeLa incubadas DRN-GNP 4,80, significa DRN-GNP sintetizados dirigidos específicamente entraron células tumorales sobreexpresan integrina α_vβ₃.

Para confirmar internalización específica receptor DRN-GNP, investigamos captación celular DRN-GNP HeLa y MCF-7 usando TEM (Fig. 5). Gran cantidad DRN-GNP localizada regiones núcleo y citoplasma células HeLa α_vβ₃-positivas (Fig. 5(A₁-A₃)). Por otro lado, cantidad insignificante partículas citoplasma células MCF-7 α_vβ₃-negativas (Fig. 5(B₁-B₂)), podrían acumularse por direccionamiento pasivo EPR. Encontramos regiones negras continuas alto contraste núcleo MCF-7; eran acetato uranilo teñía núcleo, diferentes partículas granulares núcleo HeLa. Imágenes TEM consistentes resultados imagen campo oscuro, indicando péptidos RGD y NLS superficie GNP facilitan DRN-GNP dirigir núcleo HeLa. DRN-GNP sintetizados perfecto agente contraste imagen y diagnóstico tumoral dirigida.

Evaluación Eficacia Terapéutica Celular

Para evaluar eficacia terapéutica DOX y DRN-GNP nivel celular, ensayo MTT primero estudiar viabilidad HeLa y MCF-7 tratamiento ambas muestras 24 h. DRN-GNP demostraron casi mismo efecto inhibición matando ~70% células misma concentración DOX (39,0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). Según MTT, concentración DRN-GNP 40 μg/mL número/estado células relativamente bueno, 35 μg/mL concentración adecuada imagen. Observamos concentración DRN-GNP 60 μg/mL (Fig. 6(C₃)) células HeLa necrosis obvia. Concentración 100 μg/mL, reducción saliente número células y cambio morfológico claro característico necrosis. Misma concentración DOX conjugado exhibió casi misma eficacia anti-tumor vs DOX libre. Resultados indican DRN-GNP sintetizados usable no solo agente contraste sino buen sistema liberación fármaco.

Ensayo MTT mostrar cualitativamente actividad anti-tumor in vitro DOX y DRN-GNP HeLa (a) y MCF-7 (b) 24 h (100%). Concentraciones C₀-C₅ 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL DRN-GNP; DOX correspondiente 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 μg/mL. Datos media ± DE triplicados (n=3). Imágenes HeLa incubadas diferentes concentraciones DRN-GNP (c)

Resultado citometría flujo Fig. 7 también demuestra eficacia anti-tumor DRN-GNP. Viabilidad HeLa expuestas DRN-GNP diferentes concentraciones medida citometría flujo. Dos modos muerte celular, apoptosis y necrosis, medidos tintes AnnexinV-FITC e yoduro propidio (PI) (Fig. 7). Similar resultados MTT, datos mostraron necrosis inducida DRN-GNP dependiente dosis. Proporción células necróticas 8% sin incubar DRN-GNP; concentración 100 μg/mL, proporción 23,84%; DRN-GNP sintetizados matan HeLa eficientemente. Diferencia resultados MTT y citometría explicable diferencia número células y métodos.

Gráficos contorno densidad 2D representativos determinar fracciones células vivas, apoptóticas, necróticas expuestas DRN-GNP diferentes concentraciones (0-100 μg/mL) 24 h. Necrosis y apoptosis medidas PI y AnnexinV-FITC

Evaluación Terapia DRN-GNP Ratones Portadores Tumor

Para determinar si DRN-GNP inducen efecto terapéutico combinado células tumorales in vivo, evaluamos efecto anti-tumor DRN-GNP ratones portadores tumor inyección intravenosa prolongada fármacos. Grupo salino y fármacos DOX libre, DR-GNP, DN-GNP intravenosos grupos control, concentración DOX conjugado igual DOX libre. Observamos tamaños tumor grupos DRN-GNP tratados obviamente menores que salino, DOX, DN-GNP, DR-GNP (Fig. 8a). Volumen tumor y peso corporal ratones monitoreados cada 2 días. Variación significativa volumen y peso tumor entre grupos Fig. 8d, f; volúmenes y pesos tumor DN-GNP y DR-GNP menores que DOX libre, pero mayores que DRN-GNP por menor actividad dirigida. Porque moléculas DOX pequeñas, carecen direccionamiento, vida media corta in vivo; eliminadas rápido. DRN-GNP poseen fuerte estabilidad sistema sanguíneo, vida media larga, alta capacidad direccionamiento, dirigiéndose sitio tumoral y ejerciendo efecto anti-tumor DOX. Entre grupos DRN-GNP inyectados vena cola y tumor, eficacia anti-tumor este último mejor que anterior porque fármacos no necesitan circulación sanguínea compleja al foco. Tasa inhibición tumor DOX <50%, tasas todos DOX-GNP conjugados >50%, hasta 66,7% y 57,7% respectivamente. Tinción HE mostró cierto daño órganos hígado grupo DRN-GNP intravenoso (Fig. 9). Además, bio-toxicidad DOX, DR-GNP, DN-GNP ratones portadores tumor evaluada análisis histológico. Fig. 8b, volumen células tumoral salino comparativamente mayor grupos tratamiento, células tumoral más figuras mitosis. Todos resultados mostraron efecto inhibición tumor DRN-GNP mejor entre GNP. DRN-GNP sintetizados usable perfecto sistema liberación DOX terapia tumoral.

a Imágenes tumores aislados ratones portadores tumor tras tratamiento salino, DOX libre, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP (inyección tumoral e intravenosa). b Imágenes histológicas tumores ratones tratados salino, DOX libre, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP (inyección tumoral e intravenosa). c Peso corporal, volumen tumor (d), tasa inhibición tumor (e), peso tumor (f) ratones portadores tumor 14 días tratamiento; datos media ± DE (n=6)

Imágenes histológicas órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) ratones tratados salino, DOX libre, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP (inyección tumoral e intravenosa)

Conclusión

En este estudio, desarrollamos exitosamente método un paso preparar DRN-GNP multifuncionales ~media hora. GNP aplicados exitosamente imagen dirigida tumoral y terapia tumoral in vitro e in vivo. Éxito muestra posible aprovechar totalmente capacidad reductora y estabilizadora DOX, péptidos RGD y CCYNLS, simplificando y eficientizando síntesis GNP. Más importante, DRN-GNP sintetizados un paso poseen buena estabilidad coloidal sistema fisiológico, péptidos conjugados superficie mantienen capacidad direccionamiento y DOX conserva capacidad anti-tumor. A nuestro conocimiento, primer reporte síntesis GNP multifuncionales conjugadas DOX, RGD y CCYNLS un paso y aplicación imagen, diagnóstico y terapia tumoral. Estrategia alineada dirección química verde, sentaría bases aplicaciones gran escala futuro próximo. Esperamos nuestro reporte proporcione nueva vía síntesis un paso nanomateriales multifuncionales imagen y terapia tumoral.

Disponibilidad Datos y Materiales

Todos conjuntos datos presentados artículo principal o archivos soporte adicionales.

Abreviaturas

Péptidos CCYNLS:

Secuencia aminoácido cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina

Péptidos RGD cíclicos:

Secuencia aminoácido arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutámico

DOX:

Doxorrubicina

DR-GNP:

DOX-RGD-GNP, DN-GNP: DOX-NLS-GNP, DRN-GNP: DOX-RGD-NLS GNP

GNP:

Nanopartículas oro