Síntesis verde, rápida y en un solo paso de nanopartículas de oro multifuncionales para la obtención de imágenes y la terapia dirigidas a tumores

Resumen

Las nanopartículas de oro (GNP) siempre se han utilizado como vectores de transporte de doxorrubicina (DOX) para el diagnóstico y la terapia de tumores; sin embargo, el proceso de síntesis de estos vectores consiste en preparar los PNB mediante el método de reducción química en primer lugar, seguido de la conjugación con DOX o péptidos específicos, por lo que estos métodos enfrentaron algunos problemas comunes que incluyen pasos múltiples, alto costo, tiempo, preparación complicada y Postprocesamiento. Aquí, presentamos una estrategia de un solo paso para preparar los PNB conjugados con DOX sobre la base de la constitución química de DOX por primera vez. Además, preparamos un GNP multifuncional (DRN-GNP) con un método de un solo paso con la ayuda de los grupos funcionales reductores que poseen DOX, péptidos RGD y péptidos de localización nuclear (NLS), que solo necesita 30 min. Los resultados de las imágenes de dispersión y los estudios de TEM celular indicaron que los DRN-GNP podrían apuntar al núcleo de las células Hela. Las tasas de inhibición tumoral de los DRN-GNP a través de la inyección en la vena del tumor y la cola de los ratones desnudos fueron del 66,7% y el 57,7%, respectivamente, que se mejoraron significativamente en comparación con los grupos de control. La síntesis en un solo paso de los PNB multifuncionales no solo ahorra tiempo y materiales, sino que también está en consonancia con la dirección de desarrollo de la química verde y sentaría las bases para aplicaciones a gran escala en un futuro próximo. Nuestros resultados sugirieron que la estrategia de fabricación es eficiente, y nuestros DRN-GNP preparados poseen una buena estabilidad coloidal en el sistema fisiológico; son un agente de contraste potencial y un vector de transporte de DOX eficaz para el diagnóstico y la terapia del cáncer de cuello uterino.

Introducción

La doxorrubicina (DOX) es un fármaco contra el cáncer de uso común que se ha utilizado ampliamente en una variedad de quimioterapia contra el cáncer, como el tumor maligno de la sangre [1], una variedad de adenocarcinoma [2,3,4,5], sarcoma de tejido blando [6 ], y así. Sin embargo, las dosis elevadas y a largo plazo de DOX producirán resistencia a los fármacos [7], náuseas [8], caída del cabello [9] y toxicidad aguda y crónica [10], que pueden provocar insuficiencia cardíaca congestiva [11]. Por lo tanto, es muy necesario desarrollar un portador de fármacos con buena biocompatibilidad y alta capacidad de carga de fármacos. En los últimos años, muchos nanomateriales, como puntos cuánticos [12, 13], quitosano [14, 15] nanomateriales de silicio [16, 17], nanomateriales poliméricos [18,19,20], nanopartículas fluorescentes [21,22, 23,24], y los nanomateriales metálicos [25,26,27,28,29,30] se desarrollaron como vectores de transporte DOX para el diagnóstico y la terapia de tumores. Los nanomateriales de oro se han utilizado ampliamente debido a sus propiedades químicas y ópticas únicas, baja toxicidad, buena biocompatibilidad y modificación de la superficie de la capacidad de control [31, 32] entre estos nanomateriales. Hasta ahora, hay tres tipos de enfoques para la conjugación de DOX en GNP. El primero es conjugar DOX en la superficie de los GNP con la ayuda de hidracina [25], clorhidrato de 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) [26], agente sensible al pH [27], DCC / Sistema NHS [28]. El segundo es incubar los GNP con DOX durante al menos 24 h [29]. El tercero es reemplazar el citrato conjugado en la superficie de las nanopartículas de oro (GNP) por DOX [30]. Aunque estos GNP conjugados con DOX se han utilizado en la terapia tumoral, la aplicación sigue siendo limitada debido a la falta de suficiente especificidad. Recientemente, el grupo de El-sayed [27] funcionalizó los GNP con péptidos DOX, RGD y péptidos de señal de localización nuclear (NLS). Lo más destacado de su trabajo es que los GNP ingresan a las células tumorales a través de la endocitosis mediada por receptores de péptidos RGD y luego ingresan al núcleo con la ayuda de péptidos NLS, lo que hace que DOX interfiera efectivamente con la síntesis de ADN. Desafortunadamente, necesitó al menos 120 h acoplando péptidos o fármacos capa por capa en los GNP, y cada proceso necesitó al menos 24 h. De manera similar, todos los métodos mencionados anteriormente enfrentaron algunos problemas comunes, como múltiples pasos, alto costo, preparación complicada y posprocesamiento. Por eso es necesario desarrollar un método simple y rápido para la síntesis de nanomateriales de oro multifuncionales.

En este artículo, presentamos una estrategia de un solo paso para preparar los PNB conjugados con DOX sobre la base de la constitución química de DOX por primera vez. Además, presentamos un método sintético conveniente para preparar un vector de transporte DOX multifuncional para que DOX funcione mejor, que se puede utilizar en el diagnóstico y la terapia de tumores. La diferencia clave entre nuestro trabajo y el de otros es que utilizamos los péptidos DOX, RGD y NLS como reactivos reductores y reactivos estabilizadores para fabricar los GNP y hacer que estas tres sustancias se conjugan en la superficie de los GNP para formar DRN-GNP. mientras tanto. Nuestros trabajos anteriores [33,34,35] habían demostrado que el RGD y otros péptidos se pueden utilizar para reducir los iones de oro para fabricar nanomateriales de oro. El N-terminal del NLS se puede modificar utilizando la secuencia de cisteína cisteína tirosina (CCY) para construir CCYNLS, que puede reducir los iones de oro mientras mantiene el efecto de focalización del NLS [36]. También encontramos que DOX posee dos grupos hidroxilo fenólicos con fuerte reducibilidad en condiciones básicas [37, 38], por lo que también puede reducir los iones de oro para formar los PNB. Además, el efecto antitumoral de DOX podría no verse influenciado porque se incrusta en el ADN por el grupo amino del carbono 7 y el grupo hidroxilo del carbono 9 [39]. Mientras tanto, el azufre, el oxígeno y el nitrógeno de los péptidos y DOX se pueden combinar con los GNP para mantener estable el coloidal [33]. Los resultados muestran que los DRN-GNP se fabricaron con éxito y funcionaron bien en la formación de imágenes, el diagnóstico y la terapia de tumores (esquema 1). Hasta donde sabemos, este es el primer informe para la síntesis de péptidos DOX, RGD y NLS conjugados GNP multifuncionales con un método de un solo paso, y su aplicación en el diagnóstico y la terapia de tumores.

Ilustración esquemática de la síntesis de DRN-GNP, la captación por las células Hela y el diagnóstico tumoral de DRN-GNP

Materiales y métodos

Materiales

HAuCl ₄ 4H ₂ O se adquirió de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, los péptidos RGD cíclicos (la secuencia de aminoácidos es arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutámico (c (RGDyE))) y el hidróxido de sodio eran los mismos que los de la ref. [35]. La doxorrubicina se compró a Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Los péptidos CCYNLS (la secuencia de aminoácidos es cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina, CCYPPKKKRKV) fueron suministrados por China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). La línea celular Hela y la línea celular MCF-7 fueron proporcionadas por Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. El suero fetal bovino (FBS) y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se adquirieron de GibcoBRL Life Technologies. El kit de ensayo de proliferación y citotoxicidad (MTT) se adquirió en Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Síntesis de DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP

Para la preparación de los DOX-GNP, se agregó solución de DOX (0.2 mg / mL, 1.0 mL) a la solución de ácido cloroaurico (0.86 mM, 1.0 mL) con agitación magnética, luego se agregó NaOH (2 M, 5 μL) a ajustar el pH. Para la preparación de NLS-GNP, se agregó solución de péptidos CCYNLS (0.5 mM, 1.0 mL) a la solución de ácido cloroaurico (3.44 mM, 1.0 mL) bajo agitación magnética, luego se agregó NaOH (2 M, 20 μL) para ajustar el pH . Para la preparación de DR-GNP, se agregaron solución DOX (0.2 mg / mL, 1.0 mL) y solución de péptidos RGD (1.0 mM, 1.0 mL) a la solución de ácido cloroáurico (1.72 mM, 2.0 mL) con agitación magnética, luego NaOH (2 M, 15 μL) se añadió para ajustar el pH. Para la preparación de DN-GNP, se agregaron solución de DOX (0.2 mg / mL, 1.0 mL) y solución de péptidos CCYNLS (0.5 mM, 1.0 mL) a la solución de ácido cloroáurico (1.72 mM, 2.0 mL) con agitación magnética, luego NaOH (2 M, 20 μL) se añadió para ajustar el pH. Para la preparación de DRN-GNP, se agregaron soluciones de DOX (0.2 mg / mL, 1.0 mL), péptidos CCYNLS (0.5 mM, 1.0 mL) y péptidos RGD (1.0 mM, 1.0 mL) en la solución de ácido cloroaurico (1.72 mM, 3,0 ml) con agitación magnética, luego se añadió NaOH (2 M, 35 μL) para ajustar el pH. Todas las reacciones continuaron durante 30 min a 100 ° C en un sistema de reflujo y el valor de pH fue de 10-12. Todos los GNP se purificaron mediante centrifugación a 55.000 rpm durante 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Después de eliminar el sobrenadante, los PNB se redispersaron en agua ultrapura.

Caracterización

Las caracterizaciones de los espectros de los GNP se implementaron mediante el uso de un Espectrofotómetro UV 3150 (Shimadzu, Japón), un espectrómetro Nicolet Avatar FTIR modelo 330 (Thermo, América) y un ESCALab250 espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) con las mismas condiciones analíticas. como ref. [35]. Las imágenes del microscopio electrónico de transmisión (TEM) de los GNP se obtuvieron de un TEM (JEM-2100F, JEOL, Japón) operado a un voltaje de aceleración de 200 kV.

Dispersión dinámica de luz y mediciones de potencial zeta

Se utilizó un analizador de potencial Zeta PALS Zeta (Brookhaven Instrument Corporation) para medir las dispersiones dinámicas de luz (DLS) de los DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP y DRN-GNP, que funcionaban a 90 ° ángulo con un láser de estado sólido (λ =670 nm) a temperatura ambiente. Cuando estaba equipado con un electrodo AQ-827, el analizador se utilizó para medir los potenciales zeta de los GNP.

Análisis ICP

El análisis cuantitativo de Au en los PNB fue el mismo que el de la ref. [35].

La estabilidad de DR-GNP, DN-GNP y DRN-GNP dispersos en PBS, HCl, NaOH, solución de NaCl

Mezclamos 100 μl de los GNP precipitados y 500 μl de alta concentración de PBS 0,2 M, HCl 0,5 M, NaOH 0,5 M y solución de NaCl 1,0 M, respectivamente. Doce horas después, tomamos sus fotos y probamos sus espectros de absorción UV.

Cultivo celular

Las células Hela y MCF-7 se cultivaron en una incubadora (humidificada con 5% de CO ₂ aire equilibrado) a 37 ° C durante 24 h. El medio de cultivo fue DMEM con FBS al 10%. El número de células vivas se cuenta mediante un tablero de recuento de células.

Ensayo de citotoxicidad de DOX libre y DRN-GNP

Las células Hela y MCF-7 en la fase exponencial se agregaron a los pocillos de placas de 96 pocillos (aproximadamente 5 × 10 ³ células / pocillo) y se incubaron durante 24 h, respectivamente. Luego, los DRN-GNP de concentraciones 0, 20, 40, 60, 80 y 100 μg / mL (la concentración de DOX correspondiente fue 0.0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2 y 39.0 μg / mL) se incubaron con cada pocillo y incubados durante 24 ha 37 ° C, respectivamente. El grupo de control se estableció agregando solo solución tampón PBS, y su viabilidad se estableció en 100%. Se añadió MTT (20 μL, 5 mg / mL) a cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante aproximadamente 4 h. Luego, el medio de cultivo se succionó con cuidado y se agregaron 150 μL de dos dimetilsulfóxido por pocillo durante 10 min hasta que el cristal se disolvió por completo. Se utilizó un lector de microplacas (Thermo Multiskan Mk3) para medir el valor de DO de cada pocillo a 490 nm. Se prepararon tres pocillos para cada grupo y los valores calculados se expresaron como media ± SD

Experimento de citometría de flujo

Las células Hela y MCF-7 en la fase exponencial se agregaron a cada pocillo de dos placas de 12 pocillos (aproximadamente 5 × 10 ⁴ células / pocillo) y se incubaron durante 24 h, respectivamente. Luego, se agregó la solución de DRN-GNPs en cada uno de los pocillos (concentraciones finales con 0, 20, 40, 60, 80 y 100 μg / mL) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h, respectivamente. Retirar el medio de cultivo y agregar solución de tripsina (que contiene EDTA) en los pocillos para digerir las células. Luego, retire la solución de tripsina de los pocillos, agregue el medio de cultivo en los pocillos y transfiera las células a tubos de centrífuga. Después de centrifugar a 1000 g durante 5 min, se eliminó el sobrenadante y se recogieron las células de cada tubo y se contaron en solución de PBS. Aproximadamente 5–10 × 10 ⁴ de las células se tomaron en otros tubos de centrifugación y se centrifugaron a 1000 g durante 5 min de nuevo. Retirar el sobrenadante y añadir 100 μL de solución tampón AnnexinV en los tubos. Añadiendo 5 μl de AnnexinV-FITC y 5 μl de yoduro de propidio en los tubos y mezclándolos con las células suavemente. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante 15 minutos en la oscuridad y luego se analizaron con un citómetro de flujo (BD Accuri C6).

Estudios de microscopía electrónica de transmisión y de imágenes de dispersión de campo oscuro óptico en cultivos celulares

Las células Hela y MCF-7 se implantaron en el portaobjetos de cultivo celular de 8 orificios aproximadamente 7 × 10 ³ células para cada pocillo, respectivamente. Los DRN-GNP se agregaron en cada pocillo con la concentración final de 35 μg / mL. Después de ser incubados durante 24 h, retiramos físicamente y libremente los GNP absorbidos enjuagando estas células con solución de PBS tres veces. Luego, los fijamos con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos, los cubrimos con unas gotas de glicerol y sellamos estos portaobjetos de cultivo celular de 8 orificios con otro cubreobjetos. Se utilizó un microscopio de campo oscuro (Zeiss Imager Z1) para evaluar las células en modo reflectante y de aumento de × 200. El tiempo de exposición para imágenes de campo claro y de campo oscuro a un voltaje de 5 V fue de 1 ms y 400 ms, respectivamente.

Para los estudios TEM, las células Hela y MCF-7 se incubaron con DRN-GNP (35 μg / mL) durante 24 h en un matraz de cultivo celular, respectivamente. Después de incubar y succionar la solución mixta de medio y DRN-GNP, enjuagamos las células con solución de PBS tres veces y luego las digerimos con tripsina. Las células se transfirieron en un tubo centrífugo con un pequeño volumen de medio DMEM. Las células se centrifugaron (1500 rpm) durante 10 min, el medio DMEM se succionó con cuidado y la solución de glutaraldehído al 3% (normalmente 40 veces el volumen de los materiales) se añadió cuidadosamente en el tubo para fijar las células en el fondo del tubo durante más de 1 h. Las células se fijaron adicionalmente mediante la adición de tetróxido de osmio al 1% durante 1 h, se deshidrataron con etanol y luego se incrustaron en Spurr (Sigma-Aldrich Co., EE. UU.). Las células se sacaron del tubo, se cortaron en secciones, se tiñeron con acetato de uranilo acuoso y citrato de plomo y luego se montaron sobre una rejilla de cobre (malla 300). Las muestras se midieron utilizando un microscopio electrónico de transmisión FEI TECNAI-12 (voltaje de trabajo 120 kV).

Experimentos con animales

Temas animales

Se adquirieron ratones desnudos hembra atímicos en el Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica del Sur (Guangzhou, China) para r in vivo prueba de terapia tumoral. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las Reglas de Manejo Animal del Ministerio de Salud de la República Popular de China (Documento NO. 55, 2001) y las pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Farmacéutica de China.

Eficacia terapéutica de DOX libre y sus conjugados en ratones portadores de tumores

Brevemente, se dividieron al azar 36 ratones desnudos (de 5 a 6 semanas, con un peso de 16 a 18 g) en seis grupos. Se inyectaron por vía subcutánea de células Hela (5 × 10 ⁶ células en PBS) en la fosa axilar derecha. Cinco días después, a los ratones del grupo de control se les inyectó por la vena de la cola una solución salina (0,154 mol / L, 0,2 ml). Los ratones de los grupos DOX, DR-GNP, DN-GNP y DRN-GNP libres también fueron inyectados por la vena de la cola. Con el fin de comparar la eficacia antitumoral de los DRN-GNP entre la inyección intravenosa y la inyección tumoral, establecimos un grupo para inyectar una cantidad igual de DRN-GNP en el sitio del tumor. Estos cinco grupos mantuvieron una dosis equivalente a 0,3 mg / kg de DOX libre o conjugada en cada ratón. Cada ratón se sometió a una inyección en la vena de la cola o en el tumor una vez al día. El peso corporal y el volumen tumoral de cada ratón se controlaron todos los días durante 14 días. Para investigar más a fondo los efectos terapéuticos de DOX, DR-GNP, DN-GNP y DRN-GNP, se extirparon los tumores de los seis grupos para su análisis patológico después de 14 días de tratamiento. Los tumores y los órganos internos del corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón de los ratones se aislaron de los ratones, se fijaron con formalina tamponada neutra al 10% y se embebieron en parafina. Los tejidos tumorales cortados se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron con un microscopio óptico Olympus.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

En la síntesis de los DOX-GNP, cuando se agregó la solución de NaOH a la solución mixta de DOX y solución de ácido cloroáurico, el color de la solución cambió inmediatamente de naranja a púrpura poco profundo, luego se volvió rojo vino a 100 ° C en un sistema de reflujo bajo agitación magnética en un minuto, lo que indica la formación de los DOX-GNP. El resultado indicó que la capacidad de reducción de DOX es muy fuerte porque DOX posee dos grupos hidroxilo fenólicos (el carbono No. 6 y No. 11) con una fuerte reducibilidad en condiciones básicas. La reacción continuó durante 30 minutos hasta que el color no cambia.

Para evitar confundir el color rojo anaranjado del DOX y el color rojo vino de los GNP, presentamos más evidencia caracterizando sus espectros de absorción UV (como se muestra en la Fig. 1a). DOX tiene un pico de absorción característico cerca de 485 nm y un pico a 530 nm; sin embargo, el pico a 480 nm desapareció en el espectro de la solución del producto y surgió un pico característico a 520 nm de absorción de resonancia de plasmón de superficie característica (SPR) de los GNP. Aun así, la formación de GNP todavía no está completamente determinada entre los 520 nm de los GNP y los 530 nm del pico de DOX. Teniendo en cuenta que los GNP se precipitarán con centrifugación a alta velocidad y las moléculas de DOX no, podemos ver un precipitado púrpura en el producto del fondo del tubo de centrífuga (recuadro de la Fig. 1a (3-4)) y DOX no lo hará. tampoco tiene (recuadro de la Fig. 1a (1-2)).

un Los espectros de absorción UV-visible de DOX y los DOX – GNP preparados, el recuadro de ( a ) son las imágenes de DOX (1, 2) y DOX-GNP (3, 4) antes (1, 3) y después de la centrifugación (2, 4). b Imagen TEM de DOX – GNP. c Espectros FTIR de DOX y los DOX – GNP preparados. d Espectro XPS de DOX – GNP

DOX tiene fluorescencia roja bajo la irradiación de luz ultravioleta de 365 nm; sin embargo, la fluorescencia de DOX desapareció después de la síntesis de GNP. Hay dos posibles razones; la primera es que el coeficiente de extinción de los GNP es muy fuerte, tienden a apagar la fluorescencia de las moléculas cuando se encuentran cerca de la superficie de los GNP (<5 nm) [40]. Si la distancia aumenta a 20 nm o más, el campo de plasmón de las nanopartículas está demasiado lejos para apagar su señal de fluorescencia [41]. La otra razón es que el grupo fluorescente de DOX se destruyó después de desempeñar el papel de agente reductor. Como se muestra en la Fig.1c, aunque el número de picos de absorción de infrarrojos de los DOX-GNP es significativamente menor que el de los DOX, muchas de las características de los DOX aún se han conservado, como los picos de absorción de infrarrojos característicos a 2910 cm. ⁻¹ (C-H, vibración de estiramiento) [42], 1631 cm ⁻¹ (vibración por estiramiento de carbonilo) [43], 1114 cm ⁻¹ (Vibración de estiramiento C-O, C-N) [44] y 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, vibración de flexión fuera del plano) [45], respectivamente. Esos picos representativos de DOX también se muestran en los espectros de los DOX-GNP, lo que indica que el DOX se unió con éxito a los DOX-GNP. Curiosamente, el pico a 1214 cm ⁻¹ El pico característico de la vibración por estiramiento C-O del grupo hidroxilo fenólico [46] desapareció en los espectros de DOX-GNP. El grupo fenólico puede reducir los iones Au en GNP, y luego se transportó al grupo carbonilo. Especulamos que el efecto de DOX no se ve afectado, porque se incrusta en el ADN por el grupo amino del carbono 7 y el grupo hidroxilo del carbono 9 [39].

Podemos observar que el tamaño de partícula de DOX-GNPs es de aproximadamente 6 nm de los resultados de TEM (Fig. 1b). La proporción calculada de Au (I) fue del 31,93% del espectro XPS de los DOX-GNP (Fig. 1d), que es lo suficientemente alta para mantener la estabilidad del coloide. Sin embargo, cuando el depósito de DOX-GNP se dispersó en solución tampón PBS 0,2 M con centrifugación a alta velocidad después de eliminar el sobrenadante, el color de esta solución se volvió negro púrpura y había flóculos insolubles visibles. Indicó que la estabilidad de los DOX-GNP no era muy buena en el entorno de alta concentración de sal. Se puede explicar que DOX posee solo un grupo amino pero no posee un grupo sulfhidrilo, que no es suficiente para que DOX conecte la superficie de los GNP a través del enlace Au-S y Au-N. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos si los DOX-GNP se utilizan como agente de contraste y material antitumoral para la obtención de imágenes y la terapia de tumores.

Sintetizamos DRN-GNP con DOX, péptidos RGD y péptidos NLS como agentes reductores y estabilizadores. Los péptidos RGD pueden apuntar específicamente a algunas células tumorales sobreexpresadas en α _v β ₃ integraína, y los péptidos NLS pueden dirigirse específicamente al núcleo. La Figura 2a muestra los espectros UV-Vis de los DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP fabricados; las características de su pico de absorción de plasmón superficial fue de 520-530 nm [33]. También se puede ver en el recuadro que los PNB mostraban un color rojo vino brillante. Las imágenes TEM (archivo adicional 1:Figura S1) muestran que el tamaño de partícula de NLS-GNP y DRN-GNP fue de aproximadamente 10 nm y 5 nm, y los GNP se distribuyen uniformemente, no se encontró coagulación obvia.

un Los espectros de absorción UV-Visible y las imágenes fotográficas de DOX – GNP ( a ), NLS-GNP ( b ) y DRN-GNP ( c ). b Espectros de absorción UV-visible de DOX básico, péptidos RGD, péptidos NLS y el sobrenadante de DRN-GNP. c Espectros FTIR de péptidos NLS, NLS-GNP y DRN-GNP. La distancia entre el espectro de los GNP y el espectro de los péptidos NLS se amplía para el contraste claramente

Para validar la síntesis de NLS-GNP y DRN-GNP, caracterizamos los espectros FTIR de péptidos NLS y los GNP en la Fig. 2c. Se encontraron algunos picos FTIR de péptidos NLS en los espectros de NLS-GNP y DRN-GNP, como el pico de absorción de vibración de estiramiento C-H (2840-2972 cm ⁻¹ ) [47], C =O estiramiento pico de absorción de vibración (1630-1700 cm ⁻¹ ) [48], y =C-H pico de vibración de flexión en el plano (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; indicó que los péptidos CCYNLS se conjugaron con éxito en la superficie de los GNP. También encontramos que el pico de vibración del esqueleto de benceno del terminal de tirosina en el péptido NLS a 1529 cm ⁻¹ y el pico de vibración de estiramiento de C-O de hidroxilo fenólico a 1193 cm ⁻¹ [49] desapareció en los espectros infrarrojos de NLS-GNP y DRN-GNP, lo que significa que el esqueleto de benceno del terminal de tirosina se transportó a una estructura de quinona después de desempeñar su función de agente reductor.

Centrifugamos los DRN-GNP a alta velocidad, recolectamos el líquido sobrenadante, que era casi incoloro, y luego probamos si quedaban reactivos a través de los espectros UV-Vis en la Fig. 2b. Los picos de absorción de UV de los péptidos RGD y NLS se derivan de residuos de tirosina, el pico de absorción se ubicó a 275 nm. Sin embargo, el grupo hidroxilo fenólico se convirtió en iones de oxígeno negativos en condiciones alcalinas, lo que aumenta la densidad electrónica del anillo de benceno, el pico se desplazó al rojo a 292 nm. No vimos el pico característico en el espectro UV-Vis del sobrenadante de los DRN-GNP, lo que significa que ambos péptidos participaron en la reacción. DOX posee tres picos de absorción en el rango de 450 a 600 nm, pero el sobrenadante de DRN-GNP no tiene esos picos. Además de eso, no se encontró DOX en el sobrenadante de los DRN-GNP porque su color era marrón claro, pero el color de DOX en condiciones básicas era violeta claro transparente. Se puede concluir que los tres materiales reaccionan casi por completo. De manera similar, los DR-GNP y DN-GNP también se explican de esta manera, consulte el archivo adicional 1:Figura S2.

Usamos espectroscopia XPS para examinar la valencia de Au para los NLS-GNP y DRN-GNP. Como se muestra en la Fig. 3a, b, dos picos con energías de enlace de alrededor de 83,6 eV y 87,0 eV son consistentes con la emisión de fotoelectrones Au 4f7 / 2 y 4f 5/2 [33]. Su posición de energía de enlace Au 4f7 / 2 de ambos PNB es de casi 84,0 eV. Para los NLS-GNP, se puede deconvolucionar en Au (0) (83,5 eV) y Au (I) (84,1 eV), su relación de área de pico es 57% y 43%, respectivamente. De manera similar, para los DRN-GNP, se puede deconvolucionar en Au (0) (83.6 eV) y Au (I) (84.4 eV), las relaciones de área de pico son 62% y 38%, respectivamente, por lo que tienen una proporción más alta. de Au (I). La carga puede formar complejos de Au (I) -S, que ayudan a mantener la estabilidad coloidal de los PNB. Curiosamente, identificamos tres tipos de S en los espectros XPS de NLS-GNP, DN-GNP y DRN-GNP en el archivo adicional 1:Figura S3. Las curvas azul y negra representan los estados de oxidación del azufre, las curvas violetas representan el enlace S-H y la curva verde representa el enlace Au-S. La formación del enlace Au-S ilustró que los péptidos NLS se conjugaron con éxito en la superficie de estos tres GNP.

Espectro XPS del Au 4f del ( a ) NLS-GNP, ( b ) DRN-GNP. La energía de enlace de Au 4f7 / 2 de los espectros originales (negro) y los resultados ajustados (rojo) podrían descomponerse en dos componentes, la curva de Au (0) -azul y la curva de Au (I) -púrpura. Espectros de absorción UV-visible e imágenes de DRN-GNP dispersos en PBS, NaCl, NaOH y HCl, respectivamente ( c ).

Además, los picos de N 1s, C 1s y O 1s de los espectros XPS demostraron que los péptidos y DOX estaban unidos a los PNB (archivo adicional 1:Figura S4).

Los espectros XRD (archivo adicional 1:Figura S5) muestran que la estructura cristalina de estos PNB son una estructura cristalina cúbica centrada en la cara, porque todos sus espectros XRD contenían cuatro picos a 38,2 °, 44,5 °, 64,7 ° y 77,8 ° correspondiente a los planos (111), (200), (220) y (311) [33].

Estabilidad de DRN-GNPs

La dispersión dinámica de la luz (DLS) y los datos de potencial zeta de estos cinco PNB se muestran en la Tabla 1; su tamaño hidrodinámico es mayor que el caracterizado por TEM, que se puede atribuir a una cierta cantidad de moléculas hidratadas alrededor del núcleo de los GNP solubles en agua. Sus potenciales zeta eran negativos debido al grupo carboxilo conjugado en la superficie de los GNP. La solución de GNP muestra una buena estabilidad coloidal cuando el valor absoluto del potencial zeta es superior a 30 mV; cuanto mayor sea el valor absoluto, mejor será la estabilidad. Se puede ver que todos poseen una buena estabilidad coloidal en la Tabla 1. En comparación, el valor del potencial zeta de los NLS-GNPs fue el más alto, eso puede deberse a que su superficie está llena de péptidos NLS que pueden formar un fuerte enlace Au-S a través de el grupo tiol. El valor absoluto del potencial zeta de DOX-GNP se acercó a 30 mV; fue consistente con lo mencionado anteriormente que los DOX-GNP no eran muy estables cuando se dispersaban en solución tampón PBS. Los datos de los espectros se muestran en el archivo adicional 1:Figura S6.

Los cambios de las bandas de resonancia de plasmón superficial (SPR) características de los GNP se pueden utilizar para determinar la agregación de los GNP mediante espectrometría UV-Vis [49]. Medimos sus espectros UV-Vis y tomamos fotografías de los DRN-GNP (Fig.3c) cuando estaban dispersos en sal (NaCl 1 M y PBS 0.2 M), ácido fuerte (HCl 0.5 M) y base fuerte ( Soluciones de NaOH 0,5 M). No se observaron cambios en el color de la solución ni en los espectros UV-vis en diversas condiciones adversas, excepto en la solución de HCl, en la que su color cambió a un ligero púrpura y el pico de absorción ultravioleta se desplazó hacia el rojo alrededor de 20 nm, lo que significa que los GNP se coagularon ligeramente en condiciones de ácido fuerte. . La razón podría ser que la estabilidad coloidal de los GNP cargados negativamente se vio afectada en condiciones ácidas fuertes, pero no se vio afectada en el ambiente de tampón de PBS neutro y álcali. Podemos concluir que los DRN-GNP son muy estables en condiciones de alto contenido de sal y álcalis, lo que indica que se esperaba que nuestros DRN-GNP sintetizados se usaran para imágenes de células in vitro y terapia antitumoral in vivo.

Proyección de imágenes plasmónicas de dispersión de campo oscuro de células tumorales y microscopía TEM de células

Para la obtención de imágenes dirigidas específicas de células tumorales con DRN-GNP, seleccionamos las células Hela como grupo de prueba y las células MCF-7 como grupo de control. La razón es que las células Hela sobreexpresan la integrina α _v β ₃ [50] pero las células MCF-7 no, por lo que no tiene unión específica de RGD; es un buen grupo de control [51]. La captación de DRN-GNP por estas dos líneas celulares después de la incubación durante 24 h con una concentración final de 35 μg / mL se evaluó mediante un microscopio de fluorescencia vertical en el modelo de campo oscuro. Las células que se tratan sin GNP no muestran dispersión de luz plasmónica (Fig. 4 células A-Hela, células 5C-MCF-7). Las imágenes de células Hela tratadas con DRN-GNP muestran que las señales de dispersión de los GNP están muy localizadas en el núcleo (Figs. 4b y 5e). Sin embargo, apenas pudimos ver la luz de dispersión de las células MCF-7 después de que se incubaron con los DRN-GNP, a pesar de que una pequeña cantidad de GNP podría haber entrado en las células tumorales a través del efecto de retención y permeación mejorada pasiva de las células tumorales (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A ₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

un Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)

Conclusion

In this study, we have successfully developed a one-step method to prepare the multifunctional DRN-GNPs in about half an hour. The GNPs have also been successfully applied to the tumor targeted imaging and tumor therapy both in vitro and in vivo. The success shows that it is possible to make a fully use of the reducing and stabilizing ability of the DOX, RGD peptides, and CCYNLS peptides, which will make the GNPs’ synthesis process simple and efficient. More importantly, the one-step synthesized DRN-GNPs still possess good colloidal stability in the physiological system, and the peptides conjugated on the surface remained the targeted ability and DOX still possesses its anti-tumor ability. To our knowledge, this is the first report for synthesis of DOX, RGD and CCYNLS peptides conjugated multifunctional GNPs with a one-step method, and their application in tumor imaging, diagnosis, and therapy. This strategy is in line with the development direction of green chemistry, and it would lay the foundation for large-scale applications within the near future. We expect that our report will provide a new way for the one-step synthesis of multifunctional nanomaterials used for tumor imaging and therapy.

Disponibilidad de datos y materiales

All datasets are presented in the main paper or in the additional supporting files.

Abreviaturas

CCYNLS peptides:: The sequence of amino acid is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine
Cyclic RGD peptides:: The sequence of amino acid is arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid
DOX:: Doxorrubicina
DR-GNPs:: DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs:DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs:DOX-RGD-NLS GNPs
GNPs:: Nanopartículas de oro

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