Nanopartículas multifuncionales mejoradas por ultrasonido: Nueva plataforma para imagen y terapia sinérgica del cáncer de mama metastásico

Resumen

La metástasis del cáncer de mama afecta negativamente su pronóstico. Gracias a sus notables características de penetración profunda y no invasivas, la terapia sonodinámica (SDT) muestra gran potencial para el tratamiento del cáncer. Para superar las limitaciones de la monoterapia, se ha explorado una nanoplataforma multifuncional para lograr una eficiencia terapéutica sinérgica. Aquí se establece un nuevo nanosistema que encapsula clorina e6 (Ce6, para SDT), perfluoropentano (PFP, para imagen por ultrasonido) y docetaxel (DTX, para quimioterapia) en una estructura núcleo-cáscara de PLGA bien diseñada. Las nanopartículas sinérgicas Ce6/PFP/DTX/PLGA (CPDP NPs), con excelente biocompatibilidad y estabilidad, permiten su aplicación. Bajo irradiación de ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU), se revela una imagen por ultrasonido mejorada tanto in vitro como in vivo. Más importante aún, combinadas con LIFU, las nanopartículas exhiben una notable capacidad antitumoral mediante especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas inducidas por Ce6 y la liberación de DTX, generando una eficiencia terapéutica concertada. Además, esta estrategia activa una fuerte capacidad antimetastásica, reduciendo significativamente los nódulos metastásicos pulmonares. Los resultados indican que la nanoplataforma orientada a SDT combinada con quimioterapia podría ser un enfoque prometedor para elevar la terapia sinérgica efectiva y suprimir la metástasis pulmonar del cáncer de mama.

Introducción

El cáncer de mama ha aquejado a las mujeres durante años como uno de los tumores malignos más amenazantes. Debido a su alta heterogeneidad y capacidad metastásica, se reporta que la metástasis a distancia representa más del 90% de la mortalidad, mientras que la supervivencia a 5 años de pacientes avanzados o metastásicos es solo del 26%, resultando en un mal resultado clínico. La caracterización negativa del cáncer de mama dificulta su curación completa, impulsando estrategias más desafiantes para eliminar el tumor primario y la metástasis a distancia.

Enfoques terapéuticos tradicionales como cirugía y quimioterapia siguen considerándose efectivos. Entre los fármacos quimioterapéuticos, el docetaxel (DTX) juega un papel significativo en el tratamiento del cáncer de mama metastásico (MBC) y avanzado (ABC). Como fármaco antitumoral de primera línea sintetizado a partir de sustancias químicas del tejo, el efecto antitumoral del DTX se logra principalmente destruyendo la mitosis y la proliferación celular. Debido a su amplia eficiencia antitumoral, el DTX se está convirtiendo en uno de los agentes quimioterapéuticos más efectivos para el cáncer de mama. Sin embargo, los agentes quimioterapéuticos suelen inducir efectos indeseables y toxicidad sistémica, lo que restringe enormemente la eficiencia terapéutica. Además, diferentes etapas clínicas y condiciones personales revelan que un solo enfoque terapéutico puede no ser suficiente para cumplir todas las expectativas. Por tanto, existe una necesidad urgente de reducir los efectos tóxicos y mejorar la eficacia del DTX en futuras aplicaciones.

El ultrasonido se exploró primero en diagnóstico clínico por sus extraordinarias ventajas: libre de radiación, no invasivo y rentable. A pesar de estas características, también ha ganado atención en perspectivas terapéuticas basadas en nanoestructuras. La terapia sonodinámica se realizó inicialmente por cavitación y "efecto sonoporación" desencadenados por ultrasonido. La generación de ROS durante este proceso induce citotoxicidad hacia células cancerosas, llevando a daño rápido de ADN y apoptosis. A diferencia del empleo superficial de la terapia fotodinámica (PDT), la SDT logra un resultado terapéutico más agradable en tumores profundos mediante ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU), que evita lesiones térmicas indeseables. Como uno de los elementos esenciales en SDT, los sonosensibilizadores se han explorado en diversas terapias tumorales. La clorina e6 (Ce6) se empleó originalmente como fotosensibilizador común, pero su deseable capacidad terapéutica y excelente afinidad por el tejido tumoral la hacen capaz de actuar también como sonosensibilizador. Como segunda generación de la familia de clorinas, Ce6 ha despertado gran atención en el tratamiento tumoral por su deseable generación de ROS. Sin embargo, la aplicación única de Ce6 ha suscitado inestabilidad y toxicidad cutánea indeseable, limitando la exploración extensiva de SDT.

En años recientes, el desarrollo de la nanotecnología ha jugado un papel muy importante en muchos campos, incluyendo biosensores, contaminación ambiental y degradación de contaminantes. Las nanopartículas basadas en nanotecnología tienen ventajas como diámetro menor, mayor área superficial externa y menor resistencia a la difusión interna. Previamente, las nanopartículas se han involucrado en aplicaciones de diversos materiales como MOF, dióxido de titanio y grafeno. La tendencia creciente de nanotecnología combinada con tratamiento del cáncer también se ha explorado ampliamente, allanando un camino factible para promover una estrategia terapéutica combinada. Para realizar aplicaciones terapéuticas tumorales efectivas, las nanopartículas delicadamente diseñadas se establecen principalmente para mejorar la eficiencia de transporte de agentes quimioterapéuticos tóxicos mediante el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR), permitiendo una mayor acumulación en el sitio tumoral. Además, el efecto secundario no deseado también podría disminuirse mediante encapsulación de la quimioterapia. Se ha reportado que el perfluoropentano (PFP) posee una destacada capacidad de transformación de fase líquida a gaseosa bajo irradiación, lo que podría aplicarse como una novedosa sonda molecular ultrasónica, especialmente en imagen y tratamiento ultrasónico. Más importante, la fase líquida inicial permite que el PFP se encapsule fácilmente en diversos materiales. Además, la encapsulación de PFP puede mejorar enormemente la capacidad de imagen por ultrasonido en el sitio tumoral según el efecto EPR mencionado y evitar la limitación de tamaño provocada por microburbujas de mayor tamaño. Excepto para imagen tumoral, la combinación de múltiples enfoques terapéuticos es de enorme valor en el tratamiento del cáncer orientado a nanosistemas. Específicamente, prácticas que incluyen la integración de terapia sonodinámica y quimioterapia han puesto énfasis en revolucionar las eficiencias terapéuticas tradicionales. Xu et al. demostraron que, debido a SDT, un resultado terapéutico mejorado podría revelarse con fármacos quimioterapéuticos, llevando a la activación de apoptosis de células tumorales dirigida a mitocondrias. Este patrón revela la terapia sinérgica, que es de gran interés para la utilización futura.

Aquí, con las inspiraciones mencionadas, intentamos ejercer las nanopartículas todo-en-uno (CPDP NPs) para establecer un sistema diagnóstico y terapéutico, realizado por la terapia sinérgica orientada a SDT combinada con quimioterapia, así como la imagen por ultrasonido mejorada. Debido a la excelente seguridad y estabilidad metabólica ideal como nanotransportador deseable, PLGA lo hace favorable para explorar diversas capacidades antitumoral. Por tanto, en esta estrategia, usando PLGA como material de capa externa, PFP podría mejorar significativamente la imagen por ultrasonido mediante su capacidad de cambio de fase activada por LIFU, mientras Ce6, un sonosensibilizador deseable de segunda generación, también podría exponerse a LIFU para inducir generación de ROS. Además, acompañada por la liberación de DTX, tanto la quimioterapia como la SDT se realizarán para lograr una terapia sinérgica finalmente. Importante, la estructura núcleo-cáscara de CPDP NPs puede administrarse de forma estable sin dañar tejidos o células normales y también permite a las nanopartículas tener una eficiencia de encapsulación relativamente mayor. Además, los contenidos podrían protegerse bien en esta estructura núcleo-cáscara, especialmente para PFP, que puede transformarse efectivamente de líquido a gas debido a la existencia de la estructura. Usando esta estructura núcleo-cáscara, la estrategia sinérgica podría demostrarse simultáneamente de manera más estable. Primero, la estrategia sinérgica ayuda a reducir significativamente el efecto secundario de DTX mediante encapsulación efectiva, lo cual es de gran importancia para aliviar el sufrimiento en el tratamiento de tumores malignos y agresivos; segundo, comparado con la quimioterapia única, la combinación de SDT y quimioterapia se ha verificado como una estrategia prometedora para fortalecer la eficiencia terapéutica. Tercero, la imagen por ultrasonido mejorada realizada por PFP ha optimizado la estrategia diagnóstica y también ayudado a verificar la efectividad antitumoral. Por último, todo el sistema es seguro y estable con excelente biocompatibilidad. Se destaca que en esta estrategia, la metástasis pulmonar y el crecimiento tumoral han sido notablemente inhibidos tanto in vitro como in vivo. En conclusión, la estrategia sinérgica demostró una eficacia de tratamiento productiva contra el tumor maligno de mama y su metástasis a distancia, y combinada con su capacidad de imagen por ultrasonido, podría convertirse en una estrategia de tratamiento prometedora en futuras aplicaciones clínicas.

Materiales y métodos

Materiales

PLGA-COOH (Mw 12,000 Da) se compró en Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, China). Perfluoropentano (PFP) y agarosa se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). Clorina e6 (Ce6) se adquirió en Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, China). Kit de ensayo de citotoxicidad Cell Counting Kit-8 (CCK-8) se obtuvo de Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japón). 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA) se compró en MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, EE. UU.). Yoduro de propidio (PI) se obtuvo de Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Annexin V-FITC/PI se obtuvo de BD Biosciences (EE. UU.). Docetaxel (DTX) se compró en MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron productos analíticamente puros sin purificación adicional. Medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), suero fetal bovino y tripsina se compraron en Gibco (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) y espectrofotómetro UV (UV-Vis, Hitachi, Japón).

Síntesis de CPDP NPs

Las nanopartículas Ce6-PFP-DTX/PLGA (CPDP NPs) se prepararon por un método de doble emulsión W/O/W según informe previo. Brevemente, 2 mg de Ce6 se disolvieron primero en 500 µL de metanol. Luego, 50 mg de PLGA-COOH y docetaxel (2 mg) se disolvieron en 4 mL de diclorometano, y la solución anterior se añadió simultáneamente. A continuación, se añadieron 200 µL de PFP a la solución. En consecuencia, la mezcla se sonicó con una sonda ultrasónica (Sonics & Materials Inc., EE. UU.) para obtener una primera emulsión (5 s encendido, 5 s apagado, 3 min). Para adquirir la segunda emulsión, se añadieron 8 mL de una solución de polivinil alcohol (PVA) (p/v = 4%) a la emulsión anterior, usando la misma sonda ultrasónica durante 2 min. Tras añadir 10 mL de alcohol isopropílico al 2% a la emulsión final, la solución se mezcló mecánicamente a temperatura ambiente durante al menos 4 h para volatilizar totalmente el diclorometano. Finalmente, las CPDP NPs se centrifugaron tres veces (12,000 rpm, 5 min) y se recogieron y almacenaron a 4 °C para uso posterior. Las PDP NPs se prepararon de la misma manera pero sin Ce6. Todos los procesos experimentales se operaron sobre hielo y estrictamente en oscuridad.

Caracterización de CPDP NPs

El tamaño de partícula y potencial zeta de CPDP NPs y PDP NPs se midieron con un instrumento Malvern Zetasizer Nano (Malvern, Reino Unido). La morfología se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía óptica. Para evaluar la estabilidad, las CPDP NPs se disolvieron en solución tampón fosfato (PBS) y se midieron los tamaños durante 7 días. Cada muestra se midió por triplicado. La eficiencia de encapsulación se calculó mediante: Eficiencia de encapsulación (%) = (Peso de DTX o Ce6 cargado / Peso total de DTX o Ce6) × 100%. Para verificar la encapsulación de los diversos materiales, se investigaron espectros UV-Vis de varias muestras (UH5300, Hitachi). La encapsulación efectiva también se analizó por TEM.

Tasa de liberación de fármaco de CPDP NPs

Para evaluar la capacidad de liberación de Ce6 y DTX en CPDP NPs, se utilizaron dos soluciones con diferentes pH (solución tampón fosfato, PBS: 7.4, solución tampón acetato, ABS: 5.6) para probar la eficiencia de liberación acumulativa. Brevemente, las CPDP NPs se dispersaron primero con 1 mL de PBS o ABS tras sellar la mezcla en una bolsa de diálisis (Mw: 10,000); la solución completa se transfirió a un frasco de vidrio (volumen total: 150 mL) en el que se añadieron 149 mL de PBS o ABS para mantener el volumen total a 150 mL. El frasco se colocó en un agitador a temperatura constante de 37 °C, y en diferentes periodos (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h), la solución se recogió y se repuso inmediatamente con el mismo volumen de medio. Cada grupo se repitió tres veces. Finalmente, las concentraciones de Ce6 y DTX se midieron con un lector multimodo híbrido Synergy (BioTek, EE. UU.) a 403 y 229 nm, respectivamente, y se calculó la tasa de liberación en cada punto temporal.

Imagen por ultrasonido in vitro

Para investigar la capacidad ultrasónica de CPDP NPs, la emulsión (1 mg/mL) se sonicó primero con un equipo transductor de ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU) (Centro de Investigación de Ingeniería Médica Ultrasónica Ronghai, Chongqing, China), y el patrón de conducción se estableció como ciclo de trabajo 50%, duración de pulso 1 s bajo diferentes intensidades (1-2 W/cm²) por diferentes tiempos. Para imagen por ultrasonido, las CPDP NPs irradiadas se añadieron al modelo de agarosa preparado previamente, usando un instrumento de diagnóstico por ultrasonido Philips EPIQ5 (frecuencia de sonda: 12 MHz, MI: 0.06) para observar tanto imagen 2D como CEUS de CPDP NPs. Mientras tanto, el software ImageJ se aplicó para analizar el valor de escala de grises de cada grupo.

Captura celular y generación de ROS in vitro de CPDP NPs por irradiación LIFU

La línea celular murina de cáncer de mama 4T1 se obtuvo del banco de células de Shanghai de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se incubó en medio RPMI 1640 mezclado con 10% FBS y 1% estreptomicina/penicilina a 37 °C en incubadora humidificada con 5% CO₂.

Las células 4T1 se incubaron primero en las condiciones previas a una densidad de 1×10⁴ células por plato para probar la captación celular usando CLSM en diferentes intervalos de tiempo (1 h, 2 h, 4 h, 8 h). Para verificar la generación de ROS, las células se separaron en 5 grupos: control, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. Tras 24 h de cultivo convencional, el medio se reemplazó por CPDP NPs (200 µL, 0.8 mg/mL) o solución de Ce6 (200 µL), respectivamente, y las células se co-incubaron durante 3 h. Luego, se realizó irradiación LIFU (2 W/cm², 120 s) según los grupos. Tras co-incubación y tratamiento LIFU, se añadieron 100 µL de solución diluida de DCFH-DA, y cada grupo se cultivó en la incubadora previa durante 15 min. Un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) confirmó el resultado de producción de especies reactivas de oxígeno, y las intensidades de fluorescencia correspondientes se midieron con software ImageJ.

Citotoxicidad in vitro y capacidad de tratamiento concertado de CPDP NPs

Se aplicó un ensayo CCK-8 para evaluar la citotoxicidad in vitro de CPDP NPs. Brevemente, células 4T1 se incubaron en placa de 96 pozos, con densidad de 1×10⁴ por pozo durante 24 h. Luego, CPDP NPs se diluyeron con medio RPMI 1640 libre de suero a diversas concentraciones (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mg/mL, n=3), con o sin irradiación LIFU (2 W/cm², 120 s). Tras otras 24 h de co-cultivo, se midió la viabilidad celular de 4T1.

Para evaluar la eficiencia de apoptosis celular del tratamiento concertado, las células 4T1 se co-cultivaron como antes durante 24 h y luego se separaron en cinco grupos: (1) control (sin tratamientos), (2) LIFU (solo exposición LIFU a 2 W/cm²), (3) CPDP NPs (solo solución CPDP NPs a 0.8 mg/mL), (4) PDP NPs + LIFU y (5) CPDP NPs + LIFU. Tras co-incubación con nanopartículas (200 µL) y exposición LIFU, cada grupo se trató con tinción doble de annexin V (5 µL) y yoduro de propidio (5 µL) durante 20 min y se analizó mediante citometría de flujo.

Inhibición in vitro de metástasis celular

Para investigar la inhibición de la capacidad metastásica celular, se diseñaron ensayos de curación de herida y transwell. Para el ensayo de curación de herida, las células 4T1 se cultivaron convencionalmente en placa de 6 pozos. Tras crecimiento al 80% de confluencia, una punta de pipeta (10 µL) realizó un raspado artificial a lo largo del centro. Luego, las células se trataron en los mismos grupos mencionados. Tras co-incubación continua de 24 h, las células se lavaron con PBS 3 veces y observaron bajo microscopía óptica (Olympus, Japón).

Para el ensayo transwell, el compartimento superior de la cámara transwell (Corning, San Diego, EE. UU.) se usó para imitar la matriz extracelular in vivo. Células 4T1 a densidad de 1×10⁵ por pozo se sembraron en la cámara superior en medio RPMI 1640 libre de suero, mientras el compartimento inferior se llenó con medio de cultivo completo con 10% FBS. Luego, las células se separaron como los mismos grupos y trataron durante 24 h. Después, las células en la superficie inferior se fijaron con paraformaldehído y teñieron con violeta de cristal. Los resultados se observaron con microscopía de luz (Olympus, Japón).

Imagen por ultrasonido in vivo

Ratonas BALB/c sanas (4 semanas) y ratones Kunming (4 semanas) se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Ningxia. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo la guía aprobada por el Comité de Ética de Bienestar Animal de la Universidad Médica de Ningxia. Para establecer el modelo de ratones portadores de tumor, ratones BALB/c se inocularon con células 4T1 (1×10⁷/mL) en el flanco derecho. Cuando el tamaño del tumor creció a 60-80 mm³, los ratones se inyectaron con CPDP NPs (200 µL, 1 mg/mL) por vía intravenosa a través de la vena cola. 24 h después, los sitios tumorales se irradiaron con LIFU (2 W/cm², 120 s), y luego se adquirieron imágenes 2D y CEUS mediante el instrumento de diagnóstico por ultrasonido Philips EPIQ5 mencionado. El análisis de escala de grises se midió con software ImageJ.

Eficiencia terapéutica sinérgica in vivo de CPDP NPs

Tras la inoculación de células 4T1, el tamaño del tumor se registró cada dos días, y el volumen se calculó: Volumen = 1/2 × Largo × Ancho². Tamaño tumoral y peso corporal se registraron cada 2 días, mientras que fotos del crecimiento tumoral se registraron cada 3 días. Cuando el volumen tumoral alcanzó 60-80 mm³, ratones con tamaño similar se dividieron aleatoriamente en los mismos cinco grupos: control, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU, y CPDP NPs + LIFU (n=3). Cada grupo se inyectó intravenosamente con diversas NPs (200 µL) vía vena cola excepto control (200 µL PBS). Veinticuatro horas después, el sitio tumoral se expuso a irradiación LIFU (2 W/cm²) durante 120 s. La administración SDT se repitió cada 3 días por 18 días. Se midieron y calcularon peso corporal y volumen tumoral. Tras el tratamiento, los ratones fueron sacrificados y tejidos tumorales enviados a H&E, TUNEL y PCNA para análisis histológico.

Bioseguridad de CPDP NPs in vivo

Para investigar la bioseguridad de nanopartículas CPDP in vivo, ratonas Kunming sanas (n=3) se separaron en 4 grupos: control, 5 mg/mL, 10 mg/mL, y 20 mg/mL. Las CPDP NPs (200 µL) se inyectaron por vena cola; luego, los ratones tuvieron acceso libre a comida y agua sin más administración. El peso corporal se midió cada 2 días. Tras 30 días, los ratones fueron sacrificados y se recogieron muestras de sangre para análisis de células sanguíneas y bioquímica. Los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) se recogieron e investigaron para tinción H&E.

Inhibición in vivo de metástasis pulmonar

Para evaluar la inhibición de metástasis pulmonar de cada grupo, el proceso se realizó observando el número de nódulos metastásicos en pulmón y evaluación histológica H&E. Tras eutanasia, los tejidos pulmonares se extrajeron y fijaron; luego, se fotografiaron nódulos cancerosos y tejidos se analizaron con tinción H&E.

Análisis estadístico

Los datos de medición se realizaron 3 veces y expresaron como media ± desviación estándar (SD) y analizaron por ANOVA unidireccional o prueba t de Student estándar mediante software SPSS (versión 19.0), considerando p < 0.05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de CPDP NPs y eficiencia de liberación de fármaco

Se aplicó un método de doble emulsión para fabricar CPDP NPs, que encapsulan simultáneamente material de cambio de fase PFP, sonosensibilizador Ce6 y fármaco quimioterapéutico DTX. Al dispersarse en PBS o agua desionizada, la solución presentó apariencia gris claro. Las CPDP NPs mostraron forma esférica homogénea y clara estructura núcleo-cáscara, ya sea observada por microscopía óptica o TEM (Fig. 1a, b). Los diámetros medios de CPDP NPs y PDP NPs fueron 249.5 ± 77.46 nm y 246.6 ± 81.01 nm, y los potenciales zeta superficiales promedio fueron -18.47 ± 0.55 mV y -3.987 ± 0.66 mV, respectivamente (Fig. 1c, d). El tamaño de CPDP NPs garantiza acumulación pasiva en el sitio tumoral mediante efecto EPR. La diferente carga entre CPDP NPs y PDP NPs se debe principalmente a Ce6 cargado negativamente. Además, el potencial zeta negativo de CPDP NPs indica menor adsorción de proteínas plasmáticas, verificando la estabilidad relativa. Las distribuciones de tamaño se mantuvieron entre 249.5 y 385.1 nm en 7 días (Fig. 1e), demostrando estabilidad relativa. Según curva estándar, la eficiencia de encapsulación de DTX y Ce6 fue 83.84 ± 1.39% y 60.54 ± 3.79%, respectivamente.

La eficiencia de liberación de Ce6 y DTX (Fig. 1f, g) mostró un aumento casi doble del índice de liberación de DTX a pH 5.5 comparado con pH 7.4, indicando una tasa de liberación razonable de DTX en microambiente tumoral ácido. Los resultados exhibieron que las CPDP NPs delicadamente diseñadas pueden ejercer una liberación quimioterapéutica estable y oportuna en ambiente tumoral ácido, y son fundamentalmente deseables para SDT.

Como muestra UV-Vis, DTX y Ce6 revelaron picos de absorción únicos en 229 nm y 403 nm, mientras PFP/PLGA no mostró picos. El espectro de CPDP NPs mostró picos similares cerca de ambas longitudes de onda, mientras el resto mostró la misma tendencia de PFP/PLGA, indicando encapsulación exitosa (Fig. 1h). Para verificar encapsulación efectiva, Fig. 1i muestra que nanopartícula PFP/PLGA tiene cáscara delgada y núcleo redondo, mientras nanopartícula CPDP encapsulada con DTX y Ce6 revela cáscara más gruesa y núcleo ovalado.

Imagen por ultrasonido in vitro

Se destaca que PFP posee excelente capacidad de cambio de fase. La transformación líquido-gas no solo ayuda a las nanopartículas a agregarse en el sitio tumoral, sino que también habilita su capacidad para mejorar la eficiencia de imagen por ultrasonido. Para demostrarlo, se aplicó irradiación LIFU como disparador para inducir la transformación de fase de PFP, es decir, el efecto de vaporización de gota acústica (ADV). Los resultados mostraron que las intensidades de escala de grises se mantuvieron en nivel bajo antes de irradiación LIFU, mientras que al aumentar intensidad y tiempo de irradiación, se reveló tendencia de imagen por ultrasonido mejorada tanto en 2D como en CEUS (Fig. 2a). El análisis acústico de ImageJ confirmó el resultado con valores de escala de grises elevados (Fig. 2b, c), consistente con hallazgos de imagen. Cabe notar que el resultado más significativo de 2D y CEUS se obtuvo cuando intensidad LIFU alcanzó 2 W/cm² y duró 120 s. Los resultados demostraron que PFP se encapsuló exitosamente en CPDP NPs, y la capacidad de imagen por ultrasonido se promovió significativamente bajo mayor intensidad y mayor tiempo de administración LIFU.

Captura celular y generación de ROS in vitro de CPDP NPs por irradiación LIFU

Como muestra resultado CLSM (Fig. 3), la captación celular de CPDP NPs exhibió tendencia creciente en diferentes intervalos, alcanzando agregación más significativa a las 8 h de co-incubación.

La estrategia principal de SDT es generación de ROS -serie de productos de reducción de un solo electrón- para inducir apoptosis de células cancerosas e inhibir proliferación. Se destaca que al exponerse a ultrasonido, el sonosensibilizador tiende a desencadenar producción de ROS; mientras tanto, cantidad considerable de energía se libera. Dado que tanto ultrasonido como sonosensibilizador son elementos indispensables para promover SDT, la generación intracelular de ROS se diseñó y analizó para investigar diferencias entre grupos. Según Fig. 4a, la cantidad de ROS generada por grupo Ce6 libre + LIFU fue despreciable, quizás porque el metabolismo rápido de Ce6 libre conduce a producción insatisfactoria de ROS. Por el contrario, la intensidad fluorescente más fuerte fue revelada por grupo CPDP NPs + LIFU. Se asumió que Ce6 encapsulado fue bien protegido y evitó metabolismo. Como consecuencia, tras estimulación LIFU, Ce6 se liberó para producir abundantes ROS. Comparativamente, no se encontraron señales fluorescentes significativas en otros grupos (Fig. 4b).

Citotoxicidad in vitro y capacidad de tratamiento concertado de CPDP NPs

Se introdujo ensayo CCK-8 para probar citotoxicidad in vitro de CPDP NPs. Se diseñaron grupos con o sin irradiación LIFU a diferentes concentraciones. Los resultados indicaron que tras 24 h de co-incubación sin exposición LIFU, no hubo efecto obvio en la tasa de supervivencia de CPDP NPs incluso a la concentración más alta (0.8 mg/mL), demostrando la deseable bioseguridad (Fig. 5a). Por el contrario, mostró una disminución notable de viabilidad celular tras irradiación LIFU, mostrando que la combinación de CPDP NPs y LIFU ha desencadenado notablemente muerte de células 4T1, consistente con generación de ROS in vitro.

Para evaluar eficacia SDT, se introdujo ensayo de citometría de flujo. Como muestran resultados (Fig. 5b, c), el índice de necrosis y apoptosis celular fue más alto en grupo CPDP NPs + LIFU, mientras otros grupos mostraron necrosis y apoptosis no obvias. Notablemente, la tasa de necrosis y apoptosis de grupo CPDP NPs + LIFU fue tres veces mayor que grupo solo CPDP NPs, asegurando la significativa eficiencia de muerte celular tumoral por SDT. Intrigantemente, comparado con grupo PDP NPs + LIFU, la tasa en grupo CPDP NPs + LIFU aumentó significativamente, exhibiendo eficiencia de terapia sinérgica de SDT y quimioterapia.

Inhibición in vitro de metástasis celular

La capacidad invasiva y migratoria de células tumorales son indispensables en progresión tumoral. Como muestra Fig. 6a, el cierre entre el espacio físico del grupo CPDP NPs + LIFU fue significativamente mayor que otros grupos, indicando velocidad migratoria más lenta. Según análisis ImageJ (Fig. 6c), la tasa de migración de grupo CPDP NPs + LIFU también se redujo notablemente comparado con otros grupos.

Similarmente en ensayo transwell, comparado con la rápida migración de otros grupos, grupo CPDP NPs + LIFU reveló reducción significativa de número celular (Fig. 6b), demostrando excelente capacidad anti-migratoria de la terapia sinérgica. Específicamente, con ausencia de SDT (grupos solo CPDP NPs y solo LIFU), el número de células tumorales disminuyó levemente (Fig. 6d). En conjunto, debido a la combinación de SDT y quimioterapia, la metástasis de células 4T1 ha sido notablemente inhibida in vitro.

Imagen por ultrasonido in vivo

Dado que PFP se encapsuló en CPDP NPs, también es necesario evaluar la capacidad característica de imagen por ultrasonido in vivo. Tras inyección vía vena cola de CPDP NPs, se aplicó LIFU al sitio tumoral para adquirir imágenes 2D y CEUS (Fig. 7a). La clara diferencia gráfica entre los dos grupos indicó que tras irradiación LIFU, la intensidad correspondiente de CPDP NPs se elevó obviamente comparado con grupo pre-irradiación. El análisis de intensidad de eco promedio confirmó este resultado, consistente con resultado in vitro previo (Fig. 7b, c).

Eficiencia terapéutica sinérgica in vivo de CPDP NPs

Según Fig. 8a, b, el volumen tumoral de grupo CPDP NPs + LIFU fue significativamente menor tras 18 días de tratamiento que otros grupos, lo que puede atribuirse a la efectividad de ROS originados de SDT y quimioterapia para ejercer una válida eficiencia terapéutica sinérgica. Similarmente, fotografías de ratones con tumores (Fig. 8a) mostraron misma tendencia, verificando la eficacia cooperativa de CPDP NPs activadas por exposición LIFU. Además, no hubo reducción obvia de peso entre grupos (Fig. 8c). Los resultados indicaron una tasa de inhibición mucho mayor de grupo CPDP NPs + LIFU, revelando que la terapia sinérgica podría prevenir significativamente el crecimiento tumoral.

Para testificar resultados terapéuticos, se utilizaron tinciones H&E, PCNA y TUNEL (Fig. 8d). La tasa de proliferación PCNA en grupo CPDP NPs + LIFU fue solo 20.50%, cuatro veces menor que control, tres veces menor que grupos LIFU y solo CPDP NPs, y dos veces menor que PDP + LIFU, demostrando tasa antiproliferativa significativa (Fig. 8e). Como muestra Fig. 8d, f, resultados TUNEL indicaron que grupo CPDP NPs + LIFU exhibió índice de apoptosis obvio de 72.86%, mucho mayor que control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), y PDP NPs + LIFU (37.06%). Todos los resultados demostraron efectividad de terapia sinérgica in vivo, consistente con resultados in vitro previos.

Bioseguridad de CPDP NPs in vivo

A pesar del resultado terapéutico efectivo, es de gran importancia explorar la bioseguridad de las nuevas nanopartículas establecidas. En representación de la distribución segura de CPDP NPs in vivo, se realizó seguridad metabólica. Los resultados mostraron que, en lugar de pérdida aparente de peso corporal, el peso de los ratones aumentó gradualmente en todos los grupos (Fig. 9a), indicando influencia negativa insignificante de CPDP NPs. Además, como muestran diversos órganos y muestras de sangre (Fig. 9b), no se observaron cambios significativos en células sanguíneas, índices de bioquímica y tinción H&E (Fig. 9c) entre grupos de tratamiento, indicando excelente bioseguridad in vivo.

Inhibición in vivo de metástasis pulmonar

Está bien establecido que el pulmón es el órgano diana principal para metástasis a distancia de cáncer de mama. Para evaluar la eficiencia supresora de metástasis, se utilizaron tejidos pulmonares de ratones para investigación antimetastásica. Como se ve en Fig. 10a, b, comparado con control, LIFU, CPDP NPs, y PDP + LIFU, el grupo CPDP NPs + LIFU exhibió la disminución más notable de nódulos pulmonares, sugiriendo su deseable eficiencia de inhibición metastásica pulmonar. Una tendencia similar de disminución se indicó por tinción H&E (Fig. 10c), demostrando que esta estrategia terapéutica sinérgica podría ejercer esfuerzo efectivo en eliminar metástasis pulmonar en ratones.

Discusión

Se ha reconocido ampliamente que la metástasis de cáncer de mama influye extensamente en su mal pronóstico. Como enfoque terapéutico deseable, SDT puede servir por su alta eficiencia y capacidad de penetración profunda. Admitidamente, dado que existen ciertas limitaciones en la aplicación única de sonosensibilizadores, usar SDT sola puede ser aún insuficiente en exploración oncológica futura. El desarrollo de nanotecnología combinada con medicina clínica se ha promovido significativamente en años recientes, debido a méritos inspiradores como toxicidad insignificante, no invasividad y excelente biocompatibilidad. Usando este enfoque novedoso, investigadores han hecho muchos esfuerzos en explorar estrategias terapéuticas multifuncionales para mejorar la eficiencia antitumoral.

La bioseguridad es prioridad de nano-agentes. Como material ampliamente aceptado aprobado por certificación FDA, se destaca que PLGA puede actuar como transportador deseable. Basado en sus ventajas, establecimos un nanosistema para realizar eficiencia terapéutica multifuncional, explotando PLGA como estructura externa para encapsular sonosensibilizador Ce6, material de cambio de fase PFP y agente quimioterapéutico DTX. Las nanopartículas CPDP (CPDP NPs) se observaron principalmente por estructura núcleo-cáscara y tamaño apropiado para lograr agregación deseable mediante efecto EPR. La viabilidad celular de CPDP NPs ha sido probada por encima del 80% tras 24 h de co-incubación, indicando seguridad de esta nanoplataforma. Además, la transformación de fase de PFP encapsulado también garantiza CPDP NPs como agente de contraste mejorado cuando activado por LIFU. La capacidad de imagen por ultrasonido mejorada no solo asegurará ventana terapéutica ideal, sino que también promoverá futuro prometedor para CPDP NPs para realizar integración de diagnóstico preciso y tratamiento preciso.

La estrategia clave en SDT es generación de ROS. Comparado con empleo único de Ce6, el Ce6 encapsulado en PLGA ejerció protección deseable, verificada por resultado ROS. En nuestro estudio, solo cantidad despreciable de ROS generada por uso único de Ce6, mientras Ce6 encapsulado en nanopartículas produjo cantidad considerable de ROS, probado por eficiencia SDT. El resultado indicó que generación de ROS fue preservada por Ce6 encapsulado en CPDP NPs, sentando base firme para posterior inhibición tumoral. Además, la tasa de liberación de fármaco mostró que incluso a pH 5.5, poco Ce6 se liberó de nanopartículas, demostrando buena protección de sonosensibilizador por PLGA, probado por producción ROS y resultado SDT con alta eficiencia. Interesantemente, la eficiencia de liberación de DTX y Ce6 a pH 5.5 fue bastante diferente (más del 40% y alrededor del 20%, respectivamente), lo que posiblemente se deba a diversa eficiencia de encapsulación de los dos fármacos. La tasa de liberación menor de Ce6 demostró que puede protegerse efectivamente en PLGA para que generación sustancial de ROS mediante estimulación LIFU alcance eficiencia SDT más convincente. Otra razón puede ser los diferentes solventes de los dos fármacos durante preparación. Específicamente, DTX y PLGA se disolvieron directamente en diclorometano, mientras Ce6 necesitó disolverse primero en metanol y luego añadirse gota a gota a diclorometano, por su pobre solubilidad en este. Dado que liberación de fármaco en nanopartículas está directamente relacionada con efectividad de terapia combinada posterior, la evaluación de tasa de liberación y resultado de generación ROS han probado mutuamente este punto. Investigaciones actuales sugieren que usar quimioterapia sola puede no revertir significativamente progresión tumoral. En este estudio, la nanoplataforma diseñada demostró fuerte evidencia que, comparado con empleo único de quimioterapia, el tratamiento sinérgico elevó notablemente eficiencia terapéutica tanto in vitro como in vivo. Dado que estimulación LIFU optimizó la estrategia terapéutica, la tasa de apoptosis celular aumentó notablemente. Vale notar que debido a esta estrategia sinérgica, la metástasis pulmonar pudo inhibirse significativamente tanto a nivel de células tumorales como en modelo de ratones inoculados, consistente con reportes previos.

Conclusión

En conclusión, las CPDP NPs seguras y estables que diseñamos y preparamos más irradiación LIFU podrían eliminar notablemente la progresión del tumor de mama y su metástasis pulmonar. Con capacidad de imagen mejorada, esta nanoplataforma también se consideró un agente de contraste prometedor en clínica. Por tanto, la nueva estrategia sinérgica combinada con LIFU podría considerarse como una aplicación de tratamiento efectiva para revertir el mal resultado del cáncer de mama metastásico.