Nanopartículas multifuncionales mejoradas con ultrasonido enfocado de baja intensidad para la integración de imágenes de ultrasonido y terapia sinérgica del cáncer de mama metastásico

Resultados

Caracterización de NP de CPDP y eficiencia de liberación de fármacos

Se aplicó un método de doble emulsión en la fabricación de NP de CPDP, que encapsulaban tanto el material de cambio de fase PFP, el sonosensibilizador Ce6 y el quimio-fármaco DTX simultáneamente. Cuando se dispersó en PBS o agua desionizada, la solución presentó un aspecto gris claro. Los NP de CPDP exhibieron una forma esférica homogénea y una estructura núcleo-capa clara, ya sea que se observen mediante microscopía óptica o microscopía electrónica de transmisión (Fig. 1a, b). Los diámetros medios de CPDP NP y PDP NP fueron 249,5 ± 77,46 nm y 246,6 ± 81,01 nm, y los potenciales zeta superficiales promedio fueron - 18,47 ± 0,55 mV y - 3,987 ± 0,66 mV, respectivamente (Fig. 1c, d). El tamaño de las NP de CPDP garantizaba que podría acumularse en el sitio del tumor de forma pasiva a través del efecto EPR [40]. La diferencia de cargo entre CPDP NP y PDP NP se debe principalmente al Ce6 cargado negativamente [41]. Además, el potencial zeta negativo de los NP de CPDP indicó una menor adsorción de proteínas plasmáticas, verificando la estabilidad relativa de las nanopartículas. Las distribuciones de tamaño de partícula se mantuvieron entre un rango de 249,5 y 385,1 nm en 7 días (Fig. 1e), lo que demuestra la relativa estabilidad de las NP de CPDP. Según la curva estándar, la eficiencia de encapsulación de DTX y Ce6 fue 83,84 ± 1,39% y 60,54 ± 3,79%, respectivamente.

un TEM (barra de escala:500 nm) y b Imagen de microscopio óptico de CPDP NP (barra de escala:20 μm). c Distribución de tamaño y d potencial zeta de PDP NP y CPDP NP. e La distribución de tamaño de CPDP NP dentro de los 7 días. f La tasa de liberación de Ce6 y g la tasa de liberación de DTX en diferentes condiciones (pH 7,4 y pH 5,6, n =3). h El espectro UV-Vis de los NP Ce6, DTX, PFP / PLGA y CPDP, respectivamente. Las flechas de CPDP NPs muestran los picos característicos de Ce6 y DTX, lo que indica la encapsulación efectiva de ambos materiales. yo El resultado TEM de dos nanopartículas. La nanopartícula de PFP / PLGA exhibe la capa delgada y el núcleo redondo (izquierda). La nanopartícula de CPDP encapsulada tanto en Ce6 como en DTX muestra la capa mucho más gruesa y el núcleo de forma ovalada (derecha)

Como indica la eficacia de liberación de fármaco de Ce6 y DTX de CPDP NPs en la Fig.1f, g, se registró un aumento de casi el doble del índice de liberación de DTX a pH 5,5 en comparación con las nanopartículas disueltas en pH 7,4, lo que indicó la liberación razonable de fármaco La tasa de DTX podría lograrse eficazmente en un microambiente tumoral ácido. Los resultados anteriores en todos los exhibidos, los NP de CPDP de delicado diseño pueden ejercer una liberación de fármaco quimioterapéutico constante y oportuna en el ambiente ácido del tumor, y también es fundamentalmente deseable estar preparado para SDT.

Como mostró el UV-Vis, DTX y Ce6 revelaron picos de absorción únicos en 229 nm y 403 nm, respectivamente, y por el contrario, PFP / PLGA no mostró ninguno de los picos. Cabe señalar que el espectro de CPDP NP exhibió picos similares cerca de las dos longitudes de onda anteriores, mientras que el resto mostró la misma tendencia del espectro PFP / PLGA, lo que indica la encapsulación exitosa de los diversos materiales (Fig. 1h). Para verificar aún más la encapsulación efectiva, la Fig.1i indicó que la nanopartícula de PFP / PLGA posee una capa mucho más delgada y un núcleo redondo, mientras que la nanopartícula de CPDP revela una capa relativamente más gruesa y un núcleo de forma ovalada debido a la encapsulación de DTX y Ce6.

Imágenes por ultrasonido in vitro

Se destaca que PFP posee una excelente capacidad de cambio de fase. La transformación de líquido a gas no solo ayuda a que las nanopartículas se agreguen dentro del sitio del tumor, sino que también da derecho a su capacidad para mejorar la eficiencia de las imágenes por ultrasonido [42]. Para demostrar eso, la irradiación LIFU se aplicó como un disparador para inducir la transformación de fase de PFP, es decir, el efecto de vaporización de gotas acústicas (ADV) [43]. Los resultados mostraron que las intensidades de la escala de grises se mantuvieron a un nivel relativamente bajo antes de la irradiación LIFU, mientras que después de que aumentaron la intensidad y el tiempo de irradiación de LIFU, se reveló la tendencia a la obtención de imágenes de ultrasonido mejoradas tanto en 2D como en CEUS (Fig. 2a). El análisis acústico de ImageJ convenció aún más el resultado por un valor de escala de grises elevado (Fig. 2b, c), que era consistente con los hallazgos de la imagen. Cabe señalar que el resultado más significativo de 2D y CEUS se obtuvo cuando la intensidad de LIFU alcanzó 2 W / cm ² y duró 120 s. Los resultados anteriores demostraron que la PFP se encapsuló con éxito en las NP de CPDP y que la capacidad de obtención de imágenes por ultrasonido se había promovido significativamente con una mayor intensidad y un mayor tiempo de administración de LIFU.

un Imágenes de ultrasonido de 2D y CEUS bajo diferentes intensidades LIFU y tiempos de duración. b La intensidad de escala de grises correspondiente a diferentes intensidades y tiempos de imágenes 2D y c Imágenes CEUS (** p <0.01, n =3)

Captación celular y generación de ROS in vitro de NP de CPDP mediante irradiación LIFU

Como se muestra en el resultado de CLSM en la Fig. 3, la captación celular de CPDP NP exhibió una tendencia mejorada en diferentes intervalos de tiempo, alcanzando la agregación más significativa en la coincubación de 8 h.

La captación celular 4T1 de NP de CPDP durante diferentes intervalos de tiempo (azul:células 4T1 teñidas con DAPI. Rojo:NP de CPDP marcadas con DiR, la barra de escala es de 50 μm)

La principal estrategia de la terapia sonodinámica (SDT) es la generación de ROS, una serie de productos de reducción de un solo electrón, para inducir la apoptosis de las células cancerosas e inhibir la proliferación celular [44]. Se destaca que cuando se expone a ultrasonido, el sonosensibilizador es propenso a desencadenar la producción de ROS; mientras tanto, se liberará una cantidad considerable de energía durante todo el proceso [45]. Dado que tanto el ultrasonido como el sonosensibilizador son elementos prescindibles para promover la SDT, la generación de ROS intracelulares se diseñó y analizó para investigar las diferencias entre los grupos divididos. Según la Fig. 4a, la cantidad de ROS generada por el grupo de irradiación de Ce6 libre más LIFU fue insignificante, lo que puede deberse a que el rápido metabolismo del Ce6 libre conduce a una producción de ROS insatisfactoria. Por el contrario, la intensidad fluorescente más fuerte fue revelada por el grupo CPDP NPs + LIFU. Se asumió que el Ce6 encapsulado estaba bien protegido y, por lo tanto, se había mantenido alejado de ser metabolizado. Como consecuencia, después de la estimulación con LIFU, se liberó Ce6 para producir ROS abundantes. Comparativamente, no se encontraron señales fluorescentes significativas en otros grupos (Fig. 4b).

un Imágenes CLSM de generación de ROS con varios tratamientos y b el correspondiente análisis de intensidad de FL (**** p <0,0001, n =3). Las barras de escala son de 50 μm

Citotoxicidad in vitro y capacidad de tratamiento concertado de NP de CPDP

Se introdujo el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para probar la citotoxicidad in vitro de CPDP NP. En este sentido, se diseñaron diferentes grupos con o sin irradiación LIFU a diferentes concentraciones. Los resultados indicaron que después de una coincubación de 24 h sin exposición a LIFU, no hubo un efecto obvio de la tasa de supervivencia de los NP de CPDP incluso a la concentración más alta (0,8 mg / ml), lo que demuestra la bioseguridad deseable de los NP de CPDP (Fig. 5a). By contrast, it showed that there was a striking decrease of cell viability after LIFU irradiation, showing the combination of CPDP NPs and LIFU has remarkably triggered 4T1 cell death, which was consistent with the in vitro ROS generation.

un Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. b 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p  < 0.0001, ***p  < 0.001, n =3)

To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.

In Vitro Inhibition of Cell Metastasis

The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.

un The wound healing and b The transwell assay after various treatments. c The corresponding migration rate of wound-healing assay. d The corresponding migration number of tranwell assay (****p  < 0.0001, n =3)

Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.

In Vivo Ultrasound Imaging

Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).

un 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. b , c The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p <0.01, * p  < 0.05, n =3)

In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs

Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.

un Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n =3). b Tumor volume analysis according to various treatments (**p <0,01). c Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n =3). d H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). e  Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)

To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.

Biosafety of CPDP NPs In Vivo

Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.

un The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n =3). b The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n =3). c H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)

In vivo Inhibition of Lung Metastasis

It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.

un Images of the general appearances of lung tissues. b The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p  < 0.01, n =3). c Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)