Nanosferas de albúmina en nanopuntos de MoSe2 biocompatibles y dirigidas a tumores como un agente de terapia de modalidad dual para radioterapia fototérmica sinérgica

Métodos

Materiales

FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS y CH ₃ -PEG ₅₀₀₀ -NHS se obtuvieron de Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Isotiocianato de fluoresceína (FITC), albúmina de suero bovino (BSA, purificada ≥ 98,0%), MoSe ₂ a granel polvo y tinción de yoduro de propidio (PI) de calceína-AM (CA) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE. UU.). Se obtuvieron 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de Aladdin (Shanghai, China). Todos los reactivos de cultivo celular fueron proporcionados por Corning Inc. El kit de recuento celular 8 (CCK-8) fue suministrado por Dojindo Laboratories (Japón). Millipore (Temecula, CA) suministró el anticuerpo γ-H2AX.

Preparación de FA-MoSe ₂ @BSA NS

En primer lugar, en un procedimiento típico, 50 mg de MoSe ₂ Se añadió polvo a los 25 ml de agua destilada con agitación de 20 min y luego se sonicó en un baño de hielo usando sonicación de punta (Scientz-IID, 950 W, 25 kHz). La sonicación se pulsó durante 2 s activada y 3 s desactivada durante un tiempo total de sonicación de 12 h con una amplitud del 70%. Después de eso, la mezcla se centrifugó a 6000 rpm durante 25 min. El sobrenadante se recogió y se centrifugó de nuevo a 12.000 rpm durante 30 min, lo que dio como resultado MoSe ₂ nanodots (MoSe ₂ NDs) solución. Posteriormente, se agregaron 25 mg de polvo de BSA al sobrenadante anterior con agitación leve, formando coacervados endurecidos después de agitar durante 6 h a 25 ° C y pH =7,4, y luego se procesó mediante reticulación con glutaraldehído al 0,5% (250 μL). Posteriormente, se eliminó el glutaraldehído dializándolo en agua durante 1 día, lo que resultó en el MoSe ₂ @BSA nanoesferas (MoSe ₂ @BSA NS). A continuación, MoSe ₂ Las nanoesferas @BSA se dividieron en dos partes, una se mezcla con FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 mg), y el otro se mezcló con CH ₃ -PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 mg) y se agitó durante 2 h. Por último, la solución se dializó en agua para dar como resultado FA-MoSe ₂ purificado. @BSA NS y MoSe ₂ Solución @BSA NSs. La solución preparada se almacenó a 4 ° C. Además, se utilizó un espectrómetro UV-VIS para cuantificar el FA en el FA-MoSe ₂ @BSA NSs. En detalle, después de mezclar MoSe ₂ Nanoesferas @BSA con FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 mg) y reaccionando durante 2 h, la mezcla se centrifugó para eliminar el FA no unido. Se recogió el sobrenadante para la detección de absorción. La concentración de FA se detectó mediante un espectrómetro UV-vis a una longitud de onda máxima de absorción de FA (280 nm). La eficiencia de encapsulación de FA (EE) se calculó como se describe en la siguiente ecuación:

Caracterizaciones de FA-MoSe ₂ @BSA NS

La morfología de las muestras se observó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEOL JEM2011, Tokio, Japón) y microscopio electrónico de barrido (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Se utilizó Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Reino Unido) para el tamaño y el potencial zeta. Los espectros de absorción ultravioleta-visible (UV-Vis) se registraron en un espectrofotómetro ultravioleta-visible UV2550 (Shimadzu, Kyoto, Japón). Los espectros de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se detectaron mediante un espectrómetro FTIR (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Alemania). La difracción de rayos X en polvo (XRD) de las nanoesferas se registró con un difractómetro de rayos X (Seifert Jso-Debyerex-2002, Alemania). El contenido de Mo en células y tejidos se midió mediante espectrometría de emisión atómica de plasma acoplada inductivamente (ICP-AES, Hitachi P4010, Japón). Durante la irradiación NIR, se registró la variación de la temperatura cada 30 s utilizando un termómetro de termopar (Fluke, EE. UU.).

Cultivo celular y absorción celular

Se adquirieron células 4T1 de tumor mamario de ratón de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio DMEM complementado con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% a 37 ° C con CO ₂ al 5% .

Para la captación celular, se utilizó FITC para marcar los NS mediante absorción física. Las células 4T1 se adhirieron a portaobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos y se incubaron con FITC libre, MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA y FA-MoSe ₂ @BSA NS a la misma concentración de FITC (0,05 mg / ml) durante 3 h, respectivamente. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con 0,2 ml de glutaraldehído, seguido de tinción con DAPI durante 10 min. Las imágenes de fluorescencia de las células se capturaron utilizando el microscopio de barrido láser. Para seguir observando la captación celular, las células 4T1 (2 × 10 ⁵ células / pocillo) se cultivaron en una placa de cultivo celular de 6 pocillos durante 24 hy luego se incubaron con MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA y FA-MoSe ₂ @BSA NS por 3 h adicionales. Después de eso, las células tratadas se lavaron suavemente con PBS tres veces, se homogeneizaron y se trataron con 1 ml de solución de agua regia durante 4 h. Se utilizó ICP-AES para detectar el contenido de Mo dentro de las células. Relación de absorción =\ (\ frac {\ mathrm {Ma}} {\ mathrm {Mb}} \) × 100%, donde Ma es la masa del Mo dentro de las celdas y Mb es la masa del Mo total agregado.

Biocompatibilidad in vitro

En primer lugar, se extrajo sangre completa de ratón sano para detectar la hemólisis in vitro de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. En detalle, se recolectaron glóbulos rojos (RBC) por centrifugación. Descartando los sobrenadantes, los glóbulos rojos recolectados se mezclaron con FA-MoSe ₂ @BSA NS (en PBS, 1:4) a concentraciones predeterminadas (50 μg / mL, 100 μg / mL, 150 μg / mL, 200 μg / mL y 400 μg / mL). Como control positivo o negativo, los glóbulos rojos se incubaron con agua desionizada o PBS. Después de incubar en reposo a 37ºC durante 1 h, se centrifugó el conjunto de suspensiones anterior (10.000 rpm, 1 min) y se controló la absorbancia de los sobrenadantes a 541 nm mediante un espectrómetro UV-Vis. La relación de hemólisis se calculó mediante la siguiente ecuación.

donde A _t , A _pc y A _nc son la absorbancia del sobrenadante a 541 nm de la muestra de prueba, controles positivos y negativos, respectivamente.

Además, la citotoxicidad de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA se detectaron mediante un ensayo CCK-8 estándar. Celdas 4T1 (1 × 10 ⁵ células / ml, 0,5 ml) se sembraron en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Después de desechar el medio antiguo, medio fresco que contenga 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 y 0,4 mg / ml de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA se incubaron con células 4T1 durante 24 h. Se utilizó PBS para lavar suavemente las células tres veces. A continuación, se añadió a cada pocillo una solución de trabajo de 100 μL de CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM), seguido de incubación a 37 ° C durante 1 h. El valor de absorbancia a 450 nm se detectó utilizando un lector de microplacas (Labtech, Inc., Durham, Carolina del Norte).

Radioterapia fototérmica in vitro

En primer lugar, se investigó el rendimiento fototérmico in vitro de los NS. MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ @BSA NS con las mismas concentraciones de Mo cultivadas con células durante 3 hy luego irradiadas mediante irradiación NIR durante 5 min (808 nm, 1 W / cm ² ). La temperatura de las células tratadas en cada pocillo se detectó con una cámara térmica infrarroja (Fluke TI25, EE. UU.), Respectivamente.

A continuación, para la terapia fototérmica in vitro, se cultivaron células 4T1 adherentes con diferentes concentraciones de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ @BSA NS durante 3 h. Se eliminaron los NS fuera de las células. A continuación, las células se trataron con o sin NIR (808 nm, 1 W / cm ² , 5 min) y diferentes dosis de irradiación de rayos X (RT, 0-5 Gy, 0,084 Gy / s). Después de otra incubación de 24 h, se detectó la viabilidad celular mediante un ensayo CCK-8 estándar. Las células tratadas anteriormente se tiñeron conjuntamente con calceína-AM / PI para detectar las células vivas y muertas y luego se obtuvieron imágenes mediante un microscopio de barrido láser confocal (calceína-AM:Ex =488 nm, Em =515 nm; PI:Ex =535 nm, Em =617 nm). Además, las células tratadas también se analizaron mediante inmunofluorescencia γ-H2AX. Después del tratamiento anterior, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min y se permeabilizaron con metanol durante 15 min a -20ºC y se lavaron con PBS. Posteriormente, las células se mezclaron con un tampón de bloqueo (1% de BSA en solución de PBS) durante 1 ha 25 ° C y se incubaron adicionalmente con anticuerpo monoclonal de ratón anti-fosfo-histona γ-H2AX (dilución 1:500) durante la noche a 4 °. C. Después del lavado con PBS, se observó la fluorescencia de las células mediante un microscopio de barrido láser confocal.

Modelo animal

Se proporcionaron ratones desnudos Balb / c (5-8 semanas de edad) de Charles River Laboratories (Beijing, China). Para establecer el modelo de tumor animal 4T1, 150 μL de 10 ⁶ las células en suspensión se inyectaron por vía subcutánea en el lomo de un ratón. Los ratones se alimentaron en la habitación de los animales y se observaron cada 2 días. Todos los procedimientos experimentales y de bienestar en este estudio se realizaron de acuerdo con las políticas del Ministerio de Salud Nacional y fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital Popular de la ciudad de Shangqiu. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 100 mm ³ , los ratones se solicitaron para experimentos in vivo.

Biodistribución y circulación sanguínea in vivo

Se investigó la biodistribución sistémica de los NS en ratones portadores de tumores 4T1. 1 h, 1 día, 7 días y 24 días después de la inyección intravenosa de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ @BSA (10 mg / kg), el tumor y los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) fueron pesados ​​y digeridos por solución de agua regia 12 h. El contenido de Mo y Se en estos tejidos se analizó mediante un ICP-AES. Además, se inyectó por vía intravenosa a ratones Balb / c sanos con FA-MoSe ₂ @BSA (10 mg / kg). Aproximadamente 10 μL de sangre de la cola de los ratones fueron recolectados y analizados por un ICP-AES para la circulación sanguínea.

Radioterapia fototérmica in vivo

Para la radioterapia fototérmica in vivo, los ratones portadores de tumores ( n =5 por grupo) fueron tratados con PBS + NIR, PBS + RT, MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR y FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT (con 5 mg / kg de MoSe ₂ ). La dosis de radioterapia fue de 5 Gy. En las 24 horas posteriores a la inyección intravenosa, la región del tumor se irradió mediante una irradiación NIR de 5 minutos (808 nm, 1 W / cm ² ). Durante la irradiación, las imágenes térmicas de los ratones se registraron mediante una cámara térmica infrarroja. En los siguientes 30 días, se controlaron la longitud y el ancho del tumor cada 4 días. El volumen relativo del tumor se calculó como V / V ₀ , donde V ₀ representa el volumen del tumor cuando se inició el tratamiento. Mientras tanto, el peso corporal de cada ratón también se controló cada 4 días.

Biocompatibilidad in vivo

Para biocompatibilidad in vivo, 150 μL de FA-MoSe ₂ Se inyectó por vía intravenosa @BSA NS (15 mg / kg) en ratones desnudos Balb / c sanos. Antes de la inyección y después de 30 días, se extrajo sangre para evaluaciones de recuentos sanguíneos completos, incluidos glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC), hemoglobina (HGB), volumen plaquetario medio (MPV), hemoglobina corpuscular media (MCH), hematocrito (HCT), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), volumen corpuscular medio (MCV) y plaquetas (PLT). Al mismo tiempo, se sacrificaron los ratones y se recogieron el corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón. Los órganos obtenidos se fijaron con paraformaldehído al 4% y se seccionaron en rodajas de 5 μm y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se obtuvieron imágenes de las secciones teñidas con un microscopio digital.

Análisis estadístico

Los datos se muestran como media ± DE. t del estudiante de dos colas Se utilizó la prueba para analizar la significancia estadística de dos grupos. Las diferencias se consideraron significativas para * P <0.05 y altamente significativo para ** P <0.01.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de FA-MoSe ₂ @BSA NS

El procedimiento de preparación del FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA se muestran en la Fig. 1a. Brevemente, MoSe ₂ inestable Los nanodots se prepararon a partir de MoSe ₂ a granel bajo ultrasonidos, luego estabilizado y ensamblado por la proteína BSA, y conjugado simultáneamente a la molécula objetivo FA a través de "puentes" de PEG. El MoSe ₂ preparado Los ND eran nanopuntos ultrapequeños como se observa en TEM (Fig. 1b). El patrón XRD de MoSe ₂ ND se mostró en el archivo adicional 1:Figura S1. El pico de difracción a 13,1 ° pertenece al plano (002), que coincide con la posición del pico del MoSe en masa ₂ . El pico distinto (002) indica la existencia de pocas capas en el eje c de MoSe ₂ NDs. El pico de difracción del plano (100) para MoSe ₂ Los ND se amplían significativamente en comparación con el MoSe ₂ masivo , que puede deberse a la reducción de tamaño de MoSe ₂ ND [23]. Después del ensamblaje y la conjugación con proteína BSA y FA, ​​los nanocompuestos formaron partículas en forma de esfera (Fig. 1c). Los espectros FTIR mostraron la existencia de enlace –CONH- en FA-MoSe ₂ @BSA NS, lo que indica que FA probablemente se conjugó en MoSe ₂ a través del enlace éster (archivo adicional 1:Figura S2). Además, hemos cuantificado el FA en el FA-MoSe ₂ Nanoesferas @BSA, que fue 10,5 ± 0,11%. El análisis DLS reveló que los diámetros promedio de MoSe ₂ ND y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA eran de aproximadamente 3,8 nm y 139,8 nm, respectivamente (Fig. 1d). Después de 7 días de almacenamiento, el tamaño de MoSe ₂ Los ND aumentaron de 3.8 a 63.2 nm, mientras que FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA no mostraron cambios obvios en el tamaño (Fig. 1e), lo que indica agregación y baja estabilidad de MoSe ₂ ND en almacenamiento a largo plazo. Además, cuando se dispersa en diferentes medios como agua, PBS y medio celular, FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA mostraron una distribución de tamaño similar (Fig. 1f). Estos resultados indicaron el FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA son estables en condiciones fisiológicas y esta estabilidad mejorada de MoSe ₂ Es probable que los ND se atribuyan al ensamblaje de BSA y al revestimiento de PEG [24, 25]. Como se muestra en la Fig. 1g, los espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) de MoSe ₂ ND y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA tenían características de absorbancia NIR igualmente altas, lo que indica que las modificaciones de BSA y FA no afectaron la absorbancia de MoSe ₂ .

un Un esquema de FA-MoSe ₂ Síntesis de @BSA NSs . b Imagen TEM de MoSe ₂ NDs. El recuadro era la imagen TEM de alta resolución. c Las imágenes TEM y SEM de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. d La distribución de tamaño de MoSe ₂ ND y FA-MoSe ₂ @BSA NSs. e El cambio de tamaño de MoSe ₂ ND y FA-MoSe ₂ @BSA NS en agua durante 7 días. f La distribución de tamaño de FA-MoSe ₂ @BSA NS en agua, PBS y medio, respectivamente. g Los espectros de absorbancia de MoSe ₂ ND y FA-MoSe ₂ @BSA NS

Efecto fototérmico de FA-MoSe ₂ @BSA NS

La Figura 2a muestra que la temperatura de FA-MoSe ₂ La solución de @BSA NS aumentó con concentraciones crecientes (0–200 μg / mL). Después de la irradiación NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) durante 5 min, el cambio de temperatura de FA-MoSe ₂ La solución de @BSA NS a 200 μg / mL alcanzó aproximadamente 41 ° C, mientras que la temperatura del agua pura solo aumentó aproximadamente 1,5 ° C en las mismas condiciones. Además, el cambio de temperatura de FA-MoSe ₂ @BSA NS irradiados con diferente intensidad de potencia (0,5–2,0 W / cm ² ) durante 5 min. Como se muestra en la Fig. 2b, la temperatura aumentó hasta un máximo de 40,6 ° C al aumentar la intensidad de la potencia del láser. La Figura 2c muestra la fotoestabilidad de FA-MoSe ₂ @BSA NS, lo que implica que el FA-MoSe ₂ @BSA NS retuvo sus excelentes efectos fototérmicos sin ninguna atenuación de la elevación de temperatura después de tres ciclos de irradiación NIR. Estos resultados demostraron que FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA tenían una fotoestabilidad significativa y excelentes propiedades fototérmicas. Como se muestra en la Fig. 2d, los valores de la unidad Hounsfield (HU) de FA-MoSe ₂ Las imágenes de @BSA NS obtenidas con tomografía computarizada (TC) se correlacionaron positivamente con sus concentraciones, lo que indica que las NS podrían potencialmente usarse como un radio-sensibilizador.

un Curvas de calentamiento fototérmico de FA-MoSe ₂ Solución de @BSA NS en diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 μg / ml) bajo irradiación láser de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W / cm ² . b Curvas de calentamiento fototérmico de FA-MoSe ₂ Solución de @BSA NS a 100 μg / ml bajo irradiación láser de 808 nm a diferente densidad de potencia (0,5, 1, 1,5 y 2 W / cm ² ). c Variaciones de temperatura de FA-MoSe ₂ @BSA NS bajo tres ciclos de irradiación láser de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W / cm ² . d Imágenes CT (recuadro) y valores HU de FA-MoSe ₂ @BSA NS con diferentes concentraciones

Captación celular y biocompatibilidad in vitro

Para evaluar la captación celular, MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA fueron etiquetadas por FITC. Como se muestra en la Fig. 3a, se observó una fluorescencia de FITC mucho más fuerte dentro del citoplasma en FA-MoSe ₂ Células tratadas con @BSA NSs, en comparación con las de MoSe ₂ @BSA Células tratadas con NSs y libres con FITC. El análisis cuantitativo de ICP-AES mostró una mayor captación celular de FA-MoSe ₂ @BSA NS que MoSe ₂ @BSA NSs (Fig. 3b). Estos resultados demostraron que FA mejoró la captación celular de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Curiosamente, después de un bloqueo de FA, el FA-MoSe ₂ Las células tratadas con @BSA NSs mostraron una fluorescencia verde de FITC más débil dentro del citoplasma en comparación con la de sin bloqueo de FA. En correspondencia, la tasa de absorción celular de FA-MoSe ₂ Las células tratadas con @BSA NSs + FA es menor que la de FA-MoSe ₂ Células tratadas con @BSA NSs. Indica que el receptor de FA en la membrana celular se ve obstaculizado (por FA libre), a su vez, reduce la capacidad de focalización y la accesibilidad de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Además, demuestra que el receptor de FA está sobreexpresado en las células 4T1 y los NS de FA-MoSe2 @ BSA entran en las células probablemente a través de una vía de endocitosis mediada por receptores [26, 27].

un Imágenes de fluorescencia confocal de células 4T1 después de la incubación con FITC libre y MoSe ₂ marcado con FITC @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + bloqueo FA y FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Los colores rojo y azul representan la fluorescencia FITC y los núcleos celulares teñidos con DAPI, respectivamente. b Análisis cuantitativo de ICP-AES de células 4T1 hacia MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + bloqueo FA y FA-MoSe ₂ @BSA NS

La biocompatibilidad in vitro de los NS se evaluó mediante análisis de hemólisis y citotoxicidad. La figura 4a no mostró hemólisis obvia para FA-MoSe ₂ @BSA Glóbulos rojos (RBC) tratados con NSs o RBC tratados con PBS. Además, cuando las concentraciones de hasta 0,4 mg / ml de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA se incubaron con células durante 24 h, hubo menos del 10% de supresión de la viabilidad. Estos resultados sugirieron que el FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA tienen una gran biocompatibilidad in vitro.

un Relación de hemólisis de glóbulos rojos después de 1 h de incubación con FA-MoSe ₂ @BSA NS a diferentes concentraciones. El recuadro muestra la fotografía de glóbulos rojos expuestos a agua destilada, PBS y FA-MoSe ₂ @BSA NS con diferentes concentraciones seguidas de centrifugación. b Viabilidad celular de las células 4T1 después del tratamiento con MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ @BSA NS a diferentes concentraciones durante 24 h

Radioterapia fototérmica in vitro

Como se muestra en la Fig. 5a, b, células tratadas con FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA mostraron el mayor aumento de temperatura (ΔT =23,6 ° C) después de 5 min de irradiación NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) en comparación con MoSe ₂ @BSA Células tratadas con NSs y PBS. La Figura 5c mostró una mejora de la eficacia de la RT mediante la adición de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Con dosis crecientes de rayos X, la eficacia de RT de FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA mejoraron mucho más que las de MoSe ₂ @BSA NSs. Se demostró que FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA podrían mejorar el efecto de la radioterapia, probablemente debido a su capacidad de atenuación de rayos X que podría concentrar la energía de la radiación de rayos X dentro de las células tumorales y generar electrones Auger secundarios, lo que da como resultado daños en el ADN y supresión del crecimiento celular [28, 29].

un Imágenes térmicas de PBS, MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ Células tratadas con @BSA NS, y b las correspondientes curvas de cambio de temperatura bajo irradiación continua con un láser de 808 nm (1 W / cm ² ). c Viabilidad celular de 4 células T1 tratadas con PBS, MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ @BSA NS combinados con diferentes dosis de irradiación de rayos X (0–5 Gy). d Viabilidad celular de células 4T1 tratadas con diferentes muestras con láser NIR de 808 nm (5 min, 1 W / cm ² ) e irradiación de rayos X (5 Gy)

Para una evaluación adicional del efecto terapéutico combinado de RT y PTT, las células 4T1 se trataron solo con NIR o RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR o FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT. Como se muestra en la Fig. 5d, FA-MoSe ₂ El grupo tratado con @BSA NSs + NIR + RT mostró la muerte celular dependiente de la concentración más significativa, con una tasa de supresión del 92,8%. El excelente efecto terapéutico del FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA probablemente se debieron a (1) la ablación fototérmica del PTT y el daño del ADN por RT de FA-MoSe ₂ @BSA NS, y (2) la focalización de FA mejoró la internalización celular de FA-MoSe ₂ @BSA NS y, por lo tanto, la generación de más calor y rayos X para matar las células.

Como se muestra en la Fig. 6a, se pudieron observar pocas células muertas en los grupos de control PBS + NIR y PBS + RT. Aunque se encontraron células muertas en FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT o FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR grupos, pero las células vivas todavía existían. Por el contrario, en FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT group, más del 95% de las células estaban dañadas y mostraban fluorescencia roja, lo que indica que la RT y PTT combinados de FA-MoSe ₂ Las NS de @BSA podrían mejorar la eficacia terapéutica.

un Vivo-muerto y b Imágenes de tinción γ-H2AX de células 4T1 tratadas con PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT y FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectivamente

Desde FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA tienen una alta absorbancia de rayos X, sería posible que tuvieran la capacidad de mejorar la RT. Como se muestra en la Fig. 6b, se observaron niveles muy bajos de señales de γ-H2AX en los grupos tratados con PBS, FA-MoSe ₂ @BSA NS solamente y FA-MoSe ₂ Grupos tratados con @BSA NSs + NIR. Mientras tanto, FA-MoSe ₂ El grupo tratado con @BSA NSs + NIR + RT mostró niveles más altos de señales γ-H2AX, lo que indica un daño más significativo en el ADN dentro de los núcleos celulares. Estos resultados demostraron que FA-MoSe ₂ Los NS de @BSA podrían mejorar el efecto de RT atribuyéndose a su capacidad de atenuación de rayos X, que concentraría la energía de la radiación de rayos X dentro de las células tumorales y generaría electrones secundarios y Auger para causar daños en el ADN y supresión del crecimiento celular [30-32].

Biodistribución y circulación sanguínea in vivo

Como se muestra en la Fig. 7a, b, a las 24 h posteriores a la inyección, los elementos Mo y Se se acumularon en el tumor excepto en el hígado y el riñón. El contenido de los elementos de Mo en el tejido tumoral después de las inyecciones de MoSe ₂ @BSA NS y FA-MoSe ₂ También se evaluaron las NS de @BSA. Como se muestra en la Fig. 7c, los niveles de Mo en el tejido tumoral para FA-MoSe ₂ El grupo tratado con @BSA NS aumentó con el tiempo y alcanzó el pico 24 h después de la inyección, que fue más alto que el de MoSe ₂ @BSA Grupo tratado con NS. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs. The Mo t _1/2 α (blood distribution half-life) and t _1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe₂ @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

El a Mo y b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm ² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

un In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. ** P  < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

un H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Conclusiones

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.

Abreviaturas

BSA:

Albúmina de suero bovino

FA:

Folic acid

MoSe₂ :

Molybdenum selenide

NDs:

Nanodots

NIR:

Infrarrojo cercano

NSs:

Nanospheres

PEG:

Polietilenglicol

PTT:

Terapia fototérmica

RT:

Radiotherapy

Aumento de capacidad inducido por ciclos de aerogel de grafeno / ánodo compuesto de nanomembrana de ZnO fabricado por deposición de capa atómica Supercondensadores asimétricos cuasi-sólidos de alta eficiencia basados ​​en electrodos compuestos MoS2 / MWCNT y PANI / MWCNT