Efecto Antitumoral Mejorado de Dacarbazina y Ácido Retinoico Todo-Trans Co-entregados vía Nanopartículas Lipídicas para Melanoma Maligno

Resumen

El melanoma maligno es un cáncer de piel altamente agresivo responsable del 80% de la mortalidad, y la supervivencia media general en pacientes con melanoma metastásico es solo de 6-9 meses. El tratamiento combinado mediante la administración simultánea de fármacos duales en un solo nanotransportador ha demostrado ser elegante y efectivo para combatir el cáncer. Aquí, empleamos una terapia combinada basada en dacarbazina (DBZ), fármaco aprobado por FDA para melanoma y ácido retinoico todo-trans (ATRA), agentes anticancerígenos prometedores cargados en nanoformulaciones lipídicas (RD-LNF) como nueva estrategia de tratamiento para melanoma maligno. Hemos encapsulado exitosamente ambos fármacos en nanoformulaciones lipídicas y mostramos una liberación controlada de la carga a lo largo del tiempo. Demostramos que la entrega simultánea de DBZ y ATRA pudo reducir eficazmente la proliferación celular de manera dependiente de la concentración. Las nanopartículas combinacionales redujeron significativamente la capacidad de formación de colonias de células de melanoma B16F10. El análisis por citometría de flujo mostró que RD-LNF indujo una mayor proporción de células apoptóticas con inhibición significativa de la progresión del ciclo celular y migración celular. Estos resultados sugieren el potencial prometedor de RD-LNF en el tratamiento de melanoma maligno con alta eficacia.

Introducción

El melanoma maligno es una de las malignidades agresivas que ocurre predominantemente en la piel humana. El melanoma representa el 4% de todos los cánceres dermatológicos, sin embargo, es responsable del 80% de la mortalidad por cáncer de piel y se está convirtiendo en una preocupación creciente en países subdesarrollados y en desarrollo. El melanoma tiene altas tendencias a metastatizar a varias partes del cuerpo incluyendo cerebro, corazón y pulmones, lo que lo convierte en una de las formas más agresivas de malignidades. Si se diagnostica en etapas tempranas, la escisión quirúrgica es una de las opciones terapéuticas potenciales. Sin embargo, la intervención quirúrgica no garantiza una recuperación completa del melanoma. Además, la fase de crecimiento radial de esta malignidad se vuelve resistente a la mayoría de otras opciones de tratamiento incluyendo quimioterapia y radioterapia. Para ser específico, los receptores de péptidos se sobreexpresan en la superficie del cáncer de melanoma, lo que lo convierte en una perspectiva atractiva. Se ha mostrado que el subtipo-2 del receptor de somatostatina (SSTR2) se expresa altamente en células de melanoma.

La dacarbazina (DBZ) o dimetil-triazeno-imidazol carboxamida (DTIC), un agente alquilante de DNA, es la única y primera opción de fármaco quimioterapéutico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). DBZ es un fuerte agente alquilante que mata las células cancerosas añadiendo grupos alquilo al DNA o materiales nucleares de las células cancerosas. A pesar de su acción potente, DBZ sufre de pobre solubilidad acuosa y vida media corta (41 min) en circulación sanguínea, disminuyendo su efecto terapéutico en el tratamiento de malignidades de melanoma. Además, se observó una tasa de respuesta decepcionante entre 10 y 25% con menos del 5% de recuperación completa del cáncer, indicando la limitación de una terapia de agente único. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar una estrategia alternativa para mejorar la eficacia del tratamiento de DBZ.

La co-entrega de múltiples agentes terapéuticos en una sola administración ha demostrado ser más efectiva comparada con la del agente terapéutico individual. La co-entrega de agentes terapéuticos en un solo sistema transportador conferirá actividad sinérgica, propiedades farmacocinéticas similares y mayor eficacia anticancerígena. El ácido retinoico todo-trans (ATRA) es un agente anticancerígeno prometedor usado en el tratamiento de varios cánceres. ATRA exhibió su eficacia terapéutica uniéndose a los receptores de ácido retinoico en el núcleo de las células cancerosas resultando en la inhibición de crecimiento, proliferación, diferenciación y eventual muerte celular. A diferencia de otros agentes quimioterapéuticos, ATRA no resultó en efectos adversos como cardiotoxicidad o hipoplasia de médula ósea. Se ha reportado que ATRA mejora la eficacia anticancerígena cuando se usa en combinación con un agente quimioterapéutico apropiado. De nuevo, el ATRA lipofílico sufre pobre solubilidad acuosa y clarificación sistémica rápida, lo que requiere la necesidad de un sistema de administración estable.

Los sistemas de administración nanoparticulados han demostrado mejorar la eficacia terapéutica de los terapéuticos encapsulados liberándolos en los tejidos tumorales objetivo y evitando el efecto fuera de blanco en la circulación sistémica empleando el efecto de permeación y retención mejorada (EPR). Las nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) se consideran una alternativa a muchos transportadores existentes incluyendo liposomas o micelas debido a características sobresalientes como estabilidad mejorada, liberación controlada de fármaco, alta eficiencia de carga y facilidad de preparación/escalado. Uno de los aspectos importantes de SLN como transportador de administración de fármacos es el perfil de seguridad de los lípidos que son de estado GRAS, bien tolerados y lípidos fisiológicos. La incorporación estable de fármacos en el núcleo lipídico mejora la solubilidad acuosa y mejora el perfil farmacocinético y extiende la estabilidad fisiológica en la circulación sistémica.

En este estudio, abordamos una estrategia prometedora de co-entrega de DBZ y ATRA usando nanoformulaciones lipídicas para el tratamiento combinado en malignidades de melanoma. Se espera que DBZ se cargue en el núcleo lipídico mientras que ATRA se espera que sea parte de la estructura de la nanopartícula. Estudiamos las propiedades fisicoquímicas, captación celular y citotoxicidad in vitro de nanopartículas combinadas. Además, el efecto anticancerígeno se evaluóさらに mediante ensayo de apoptosis, análisis de ciclo celular, formación de colonias y análisis de migración celular.

Conclusiones

En conclusión, hemos formulado exitosamente dacarbazina y ácido retinoico todo-trans cargados en nanoformulaciones lipídicas. Nuestros resultados demuestran claramente que RD-LNF inhibe la proliferación de células de melanoma, induce apoptosis notable e inhibe la progresión del ciclo celular y migraciones celulares. El trabajo futuro se centrará en estudiar la eficacia anticancerígena en modelos animales clínicamente relevantes y desarrollar una terapia dirigida hacia la malignidad de melanoma. Este es un estudio preliminar realizado en células de melanoma y estudios de amplio rango en diferentes modelos animales clínicamente relevantes son la próxima parte de nuestro trabajo de investigación.

Materiales y Métodos

Preparación de Nanoformulaciones Lipídicas Cargadas con DBZ/ATRA

Las nanopartículas lipídicas cargadas con fármacos se prepararon por el método de sonicación. Brevemente, 10 mg de DBZ y 10 mg de ATRA se disolvieron en 2 mL de una solución de cloroformo que contenía 50 mg de fosfatidilcolina de huevo l-α (PC) y 2 mg de DSME-metil(polietilenglicol)-2000 (mPEG₂₀₀₀). El solvente orgánico se secó usando exposición a gas argón durante 20 min. La mezcla de fármaco + lípido seca se añadió con 80 mg de trimiristina (Tm) e incubó a 65 °C durante 1 h. A esta mezcla de aceite, se añadieron 5 mL de solución de poloxamer al 4% y se sonicó inmediatamente con sonda a 80 W durante 6 min. La emulsión resultante se enfrió en hielo durante 30 min. Las nanopartículas se sometieron a unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra 0.5 (corte 3 kDa; Merck, Alemania) a 12000×g durante 20 min. La cantidad de DBZ y ATRA libre en el filtrado se evaluó por método HPLC y se calcularon la eficiencia de carga y capacidad de carga. Se usó un sistema HPLC Waters que consistía en una bomba binaria Waters 1525, detector UV Waters 2487, detector de fluorescencia Waters 2475, calentador de columna 1500 y columna Symmetry C18 para el análisis de fármacos. Para ATRA, la fase móvil consistió en acetonitrilo y ácido trifluoroacético en relación v/v 90/10 a una velocidad de flujo de 1 mL/min y se detectó a 348 nm. Para DBZ, se usó acetonitrilo y fosfato de disodio 0.05 M en relación v/v 30/70 conteniendo 0.5% de TEA. El pH de la fase móvil se mantuvo en pH 3.7 y se usó una velocidad de flujo de 1 mL/min.

Análisis de Tamaño de Partícula y Morfología

La distribución de tamaño de partícula de la nanopartícula combinada se evaluó por Malvern Zetasizer Nano ZS90 con láser He-Ne (633 nm). Todas las muestras se diluyeron con agua destilada y los experimentos se realizaron a 24 °C en triplicado. La morfología de la nanopartícula se evaluó por microscopio electrónico de transmisión (TEM; JEOL JEM200CX a 120 kV). Las partículas diluidas se tiñeron con ácido fosfotúngstico al 2%, se secaron y observaron bajo TEM.

Liberación In Vitro de Fármacos de Nanoformulaciones Cargadas

La liberación de fármacos encapsulados se evaluó por el método de diálisis. Dos mililitros de nanopartículas cargadas con fármacos conteniendo un equivalente de 1 mg de ATRA y 1 mg de DBZ se sellaron en una membrana de diálisis (Spectra/Por, MWCO 3.5 kDa). El tubo de diálisis se colocó en 25 mL de tampón de liberación y se mantuvo a una rotación de 100 rpm a 37 °C. En intervalos de tiempo predeterminados hasta 72 h, se retiraron 1 mL de muestras y se reemplazaron con tampón fresco de igual cantidad. La cantidad de DBZ y ATRA se evaluó por método HPLC como se describió arriba.

Cultivo Celular y Análisis de Captación Celular

Células de melanoma murino (B16F10) se adquirieron de Recursos de Infraestructura de Línea Celular de China (Beijing, China). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS y 1% de mezcla de antibióticos. Los medios se cambiaron regularmente cada 2 días y se cultivaron tras 90% de confluencia. Para análisis de captación celular, células B16F10 se sembraron en una placa de 6 pocillos para 24 h de incubación. Las nanopartículas se cargaron con Cumarina-6 como rastreador fluorescente. El medio viejo se removió y se reemplazó con medio fresco conteniendo nanopartículas lipídicas de Cumarina-6 e incubó durante 1-3 h en orden inverso. Las células se lavaron y rasparon con raspador celular. Las células se centrífugaron a 1200 rpm durante 5 min y el pellet celular se resuspendió en 1 mL de PBS frío. Las muestras se evaluaron por citómetro de flujo AccuriTM C6 (BD Co., EE. UU.).

Ensayo de Citotoxicidad In Vitro

El efecto citotóxico de ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF en células B16F10 se evaluó por ensayo MTT. Las células (1 × 10⁴) se sembraron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incubaron durante 24 h. Las células se trataron primero con diferentes concentraciones de ATRA libre y DBZ y se probó su efecto anticancerígeno en células de melanoma. Seguido por, las células se trataron con una concentración fija de ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF a 25 μg/mL y 50 μg/mL, respectivamente. Las células se incubaron durante 24 h y luego el medio se removió cuidadosamente y se lavó dos veces con PBS. Al final, las células se trataron con 100 μL de solución MTT 5 mg/mL e incubaron durante 4 h. El medio de cultivo se removió cuidadosamente y se añadieron 100 μL de isopropanol e incubaron durante 15 min bajo condiciones de agitación. Los cristales de formazan disueltos se estudiaron a 570 nm usando un lector de microplacas. Las células no tratadas se usaron como control y los cálculos se basaron en la viabilidad celular de los controles.

Ensayo de Apoptosis - Citómetro de Flujo

El efecto de apoptosis de ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF en células B16F10 se evaluó siguiendo la tinción con kit de apoptosis basado en PE annexin V y 7AAD. Las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10⁵ células/pocillo e incubaron durante 24 h. Las células se trataron con 25 μg/mL equivalentes de ATRA libre, DBZ, D-LNF y formulaciones RD-LNF y las células no tratadas se consideraron como control. Tras 24 h de exposición al tratamiento, las células se tiñeron según el protocolo del fabricante. Se usó citómetro de flujo AccuriTM C6 para expresión de PE y 7AAD y se adquirieron un mínimo de 10,000 eventos en el citómetro de flujo. Células PE-positivas y 7AAD-negativas fueron apoptóticas tempranas; células PE-positivas y 7AAD-positivas fueron apoptóticas tardías.

Análisis de Ciclo Celular - Citómetro de Flujo

Las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10⁵ células/pocillo e incubaron durante 24 h. Las células se trataron con 25 μg/mL equivalentes de ATRA libre, DBZ, D-LNF y formulaciones RD-LNF y las células no tratadas se consideraron como control. Tras 24 h, las células tratadas se lavaron y recolectaron por tripsinización y fijaron con etanol al 70% durante 2 h a 4 °C. Las células se trataron luego con ribonucleasa para deshacerse de cualquier contaminación de RNA. Ahora, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) durante 30 min a 37 °C en la incubadora. La fluorescencia de células teñidas con PI se determinó por el citómetro de flujo AccuriTM C6. La fase del ciclo celular se dividió en subG1, G1, S y G2/M.

Ensayo de Formación de Colonias

Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10⁵ células/pocillo e incubaron durante 24 h. Las células se trataron con 25 μg/mL equivalentes de ATRA libre, DBZ, D-LNF y formulaciones RD-LNF. Las células tratadas se tripsinizaron, lavaron y contaron usando un contador celular. Las células se sembraron luego en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1500 células/pocillo. Las células se incubaron luego bajo condiciones ambientales de 37 °C durante 12 días hasta que las colonias son visibles. Las células se lavaron con PBS y fijaron con metanol a ácido acético a agua (1:1:8) durante 10 min, seguido de tinción con violeta de cristal al 0.1% durante 45 min. Las células teñidas se observaron luego bajo microscopio de luz.

Ensayo de Migración Celular

Cámara Transwell de 12 pocillos con tamaño de poro de 8 μm se usó para este ensayo. Para iniciar el estudio, 5 × 10⁴ células/pocillo se sembraron en la cámara superior. El medio superior carece de FBS mientras que el medio de la cámara inferior consiste en 10% FBS. Tras 24 h, la cantidad de células migradas a la superficie de la membrana inferior se fijó y tiñó con tinte violeta de cristal al 0.5%. El número de células se contó en cinco campos seleccionados aleatoriamente bajo microscopio de luz; el número promedio de células se registró y analizó.

Análisis Estadístico

Los datos se presentan como media ± DE y se realizaron en triplicado a menos que se mencione lo contrario por separado. Dos grupos se compararon usando pruebas t no pareadas, mientras que la comparación de más de dos grupos se hizo usando ANOVA de una vía con prueba de comparaciones múltiples de Turkey. Las estadísticas se realizaron usando software GraphPad Prism y una diferencia de p < 0.05 se consideró significativa.

Resultados y Discusión

Preparación y Caracterización de Nanoformulaciones Lipídicas Cargadas con DBZ/ATRA

El tratamiento del melanoma sigue siendo un gran desafío y las opciones de tratamiento estándar incluyendo quimioterapia, radioterapia o resección quirúrgica serán efectivas solo en tumores sólidos masivos acompañados de mal pronóstico. FDA ha aprobado fármacos como paclitaxel o su combinación, pero falló en mejorar el impacto general en la supervivencia del paciente y cura del cáncer. La dacarbazina (DBZ) es la primera opción de fármaco quimioterapéutico aprobado por FDA; sin embargo, DBZ sufre de malas propiedades fisicoquímicas y resultó en una tasa de respuesta decepcionante entre 10 y 25%. Para lidiar con estos desafíos, hemos desarrollado una estrategia terapéutica novedosa de combinación con ATRA y DBZ en nanoformulaciones lipídicas (Fig. 1). Hipotetizamos que la combinación de dos componentes terapéuticos mejorará la eficacia antitumoral en malignidades de melanoma. Vale la pena notar que ATRA, aunque exhibe propiedades anticancerígenas, no resultó en ningún efecto adverso en el entorno sistémico. Como DBZ es hidrofóbico por naturaleza, hemos diseñado nanoformulaciones lipídicas que pueden incorporar establemente los fármacos hidrofóbicos en el núcleo lipídico y ATRA se cargará como componente estructural de las nanopartículas. Las nanopartículas lipídicas que llevan los componentes terapéuticos ayudarán a entregar en el tumor profundo en el cuerpo. La eficiencia de carga de DBZ y ATRA fue 91.2 ± 1.25% y 95.8 ± 1.14% respectivamente. La capacidad de carga de DBZ y ATRA en RD-LNF fue 7.07 ± 0.65% p/p y 7.48 ± 1.05% p/p, respectivamente. El tamaño de partícula de D-LNF se observó en 121.5 ± 1.65 nm con un índice de polidispersidad (PDI) de 0.134 y potencial zeta de -23.5 ± 0.85 mV. El tamaño de partícula de RD-LNF fue 138.2 ± 1.28 nm con un PDI de 0.159 y potencial zeta de -25.4 ± 0.58 mV. El aumento en el tamaño de partícula general se atribuyó principalmente a la carga estructural de ATRA; sin embargo, el tamaño final de RD-LNF fue menor a 150 nm permitiendo acumular preferentemente en tumores de melanoma maligno debido al efecto EPR. Además, la presencia de PEG hidrofílico evitará la agregación de partículas y reducirá su captación por el sistema reticuloendotelial (RES) y mejorarán su rendimiento sistémico en el cuerpo. La carga superficial alrededor de -25 mV conferirá excelente estabilidad de almacenamiento. La morfología de partícula se investigó por microscopio electrónico de transmisión (TEM) (Fig. 2). Como se ve, tanto D-LNF como RD-LNF son perfectamente esféricos en tamaño y distribuidos uniformemente en la rejilla de cobre. La diferencia de tamaño entre D-LNF y RD-LNF fue consistente con la observación DLS. La falta de desechos de partículas, partículas pequeñas y agregación indica el éxito del proceso de formulación.

Estructura de dacarbazina (DBZ) y ácido retinoico todo-trans (ATRA). Ilustración esquemática de nanoformulaciones lipídicas cargadas con DBZ/ATRA presentada. La nanoformulación lipídica se preparó por método de ultrasonicación. Tanto DBZ como ATRA son moléculas hidrofóbicas con peso molecular menor a 300 g/mol. Se espera que las moléculas hidrofóbicas se concentren en el núcleo de las nanopartículas estabilizadas por un surfactante.

Análisis morfológico de D-LNF y RD-LNF usando microscopía electrónica de transmisión. Imagen representativa representando la morfología precisa presentada.

Análisis de Estabilidad y Liberación In Vitro de Fármacos de D-LNF y RD-LNF

RD-LNF exhibió una excelente estabilidad tanto en pH 7.4 (PBS) como en suero (10% FBS) (Fig. 3a). El tamaño de partícula no mostró ningún aumento significativo en ambas condiciones a lo largo del período de estudio indicando la estabilidad de las nanopartículas. La capacidad de liberación de fármaco de manera oportuna decide la efectividad de los sistemas de nanopartículas cargadas con fármacos. Hemos realizado la cinética de liberación de DBZ y ATRA de D-LNF y RD-LNF en tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4). Como se muestra en Fig. 3b, no se observó liberación en ráfaga o liberación en fases de fármaco desde ninguno de los dos sistemas de nanopartículas indicando la carga estable en el núcleo de las nanopartículas y no en la superficie de la nanopartícula. No se observó diferencia significativa en la liberación de DBZ de D-LNF y RD-LNF indicando que la presencia de ATRA no ralentizó ni alteró el patrón de liberación del fármaco. Un ligero retraso en la liberación de DBZ de RD-LNF podría atribuirse al aumento de la longitud de camino atribuido a ATRA en la estructura lipídica. Es interesante notar que ATRA se liberó significativamente más lento comparado con DBZ en el sistema transportador RD-LNF. Diferencias significativas comenzaron a aparecer tras 24 h hasta 72 h atribuidas principalmente a la naturaleza extremadamente hidrofóbica de ATRA y siendo parte del componente estructural. En general, la falta de liberación en ráfaga y la liberación controlada de componentes terapéuticos beneficiarán el tratamiento del cáncer de melanoma.

a Análisis de estabilidad de RD-LNF en condiciones de pH 7.4 y suero (10% FBS). b Liberación in vitro de DBZ de D-LNF; y liberación in vitro de DBZ y ATRA de RD-LNF. El estudio de liberación se realizó en tampón fosfato salino (pH 7.4) para período de estudio de 72 h. Los resultados se presentan como media ± desviaciones estándar (n = 4).

Captación Celular In Vitro

La captación celular mayor o mejorada de la nanopartícula determina la eficacia terapéutica en las células cancerosas. Hemos realizado la captación celular de RD-LNF en células cancerosas B16F10 y Cumarina-6 se usó como rastreador fluorescente. Como se muestra en Fig. 4, se observó una internalización notable de nanopartículas tras 1 h de incubación con nanopartículas y la captación aumentó consistentemente hasta 3 h. La notable captación de nanoformulaciones lipídicas es consistente con la mayor captación celular del sistema transportador basado en lípidos. Se especuló que la difusión pasiva y mecanismo basado en endocitosis podrían ser responsables de la mayor captación celular. Las nanopartículas tras la endocitosis alcanzarán el lisosoma donde los fármacos encapsulados son liberados y exhiben sus respectivas acciones farmacológicas.

Análisis de captación celular in vitro de células de melanoma B16F10. Las células cancerosas se trataron con RD-LNF y los tiempos de incubación variaron de 1h a 3 h y la captación celular se analizó usando citómetro de flujo. La Cumarina-6 se usó como rastreador fluorescente.

Ensayo de Citotoxicidad In Vitro

El ensayo MTT se realizó en células B16F10 tras tratamiento con formulaciones respectivas para evaluar el efecto anticancerígeno de agentes terapéuticos individuales (Fig. 5a). Primero, se evaluó la citotoxicidad de DBZ libre y ATRA individual. DBZ exhibió un efecto citotóxico dependiente de la concentración en las células cancerosas de melanoma mientras que ATRA exhibió un efecto citotóxico significativamente mayor en células B16F10. A 100 μg/mL, DBZ exhibió ~45% de viabilidad celular comparado con ~22% de viabilidad celular para ATRA indicando la excelente eficacia terapéutica de ATRA. Para probar que la co-entrega de DBZ y ATRA podría potencialmente inhibir la progresión del cáncer, se trataron células de melanoma con nanoformulaciones lipídicas cargadas con DBZ+ATRA (RD-LNF). Nanoformulaciones lipídicas cargadas con DBZ (D-LNF) conteniendo la entidad de fármaco único se usó como grupo de referencia para resaltar la eficacia sinérgica de ATRA (Fig. 5b). Como se esperaba, a 25 μg/mL de concentración fija, ATRA mostró viabilidad celular ligeramente menor comparada con DBZ mientras que D-LNF basado en nanopartículas no mejoró el efecto anticancerígeno de DBZ y permaneció lejos de ser efectivo. Como se esperaba, RD-LNF mostró viabilidad celular significativamente menor y mayor efecto anticancerígeno comparado con D-LNF indicando un efecto terapéutico sinérgico aparente de componentes duales hacia la muerte de células cancerosas de melanoma. RD-LNF mostró un efecto anticancerígeno significativamente mayor comparado con cualquier otro grupo de tratamiento. Podría esperarse que la liberación lenta y sostenida de DBZ junto con la liberación lenta de ATRA del sistema nanotransportador podría contribuir al efecto terapéutico sinérgico. En este estudio, dacarbazina (DBZ) fue el fármaco quimioterapéutico principal y ATRA se empleó como componente estructural de nanopartículas lipídicas, por lo tanto no se creó un grupo separado para R-LNF. Hemos estudiado el efecto anticancerígeno de ATRA y DBZ desnudos en las células cancerosas. Además, muchos reportes publicados son prueba del efecto anticancerígeno de ATRA; por lo tanto, hemos usado ATRA como componente estructural que también podría mejorar la eficacia anticancerígena de terapéuticos encapsulados de manera sinérgica.

a Ensayo de citotoxicidad in vitro de DBZ libre y ATRA de manera dependiente de la concentración. b Citotoxicidad in vitro de ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF a una concentración fija de 25 μg/mL y 50 μg/mL.

Ensayo de Formación de Colonias

El ensayo de formación de colonias se realizó para evaluar el potencial de tumorigénesis de células de melanoma. Como se muestra, DBZ libre y ATRA tienen un papel limitado en inhibir la formación de colonias y similarmente, D-LNF fue inefectivo en controlar la formación de colonias (Fig. 6). Como se esperaba, la combinación de DBZ + ATRA resultó en potenciación significativa de inhibición de formación de colonias comparada con fármacos libres individuales o nanopartículas cargadas con fármaco único. El ensayo de formulación de coloniasさらに reitera la superior eficacia anticancerígena de RD-LNF sobre fármacos libres.

Efecto de ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF en la formación de colonias. Células B16F10 tratadas con formulaciones respectivas y formación de colonias fotografiada tras tinción con violeta de cristal.

Ensayo de Apoptosis In Vitro y Análisis de Ciclo Celular

La inducción de apoptosis de células B16F10 tras tratamiento con D-LNF y RD-LNF se estudió usando un citómetro de flujo tras teñir las células con mezcla Annexin V-FITC/PI (Fig. 7a). Como se muestra, ATRA y DBZ causaron solo 10-12% de apoptosis de células cancerosas y gran parte de las células permanecen intactas. Se observó un ligero aumento en células apoptóticas tempranas tras tratamiento con D-LNF que podría sugerir el efecto del transportador de administración. Importante, RD-LNF indujo una mayor proporción de células apoptóticas con una mayor proporción de células en apoptosis tardía y temprana indicando la superior eficacia anticancerígena de nanopartículas combinacionales. RD-LNF mostró que células de apoptosis tardía aumentaron 21.5% mientras que células de apoptosis temprana aumentaron hasta 18.3% y la proporción de células viables disminuyó de 95 a 52%, respectivamente, sugiriendo que la combinación de DBZ + ATRA contribuyó a la apoptosis de células cancerosas y pudo inhibir la inhibición proliferativa de células de melanoma B16F10. El efecto de apoptosis de formulaciones fueさらに confirmado por análisis de ciclo celular. Como se muestra, DBZ y ATRA exhibieron un ligero aumento en la población sub-G0 mientras que D-LNF mostró una población sub-G0 relativamente mayor comparada con fármacos libres individuales (Fig. 7b). Notablemente, se observó un aumento notable en la población sub-G0 para células de melanoma tratadas con RD-LNF indicando la apoptosis marcada de las células cancerosas. Es bien sabido que DBZ podría aumentar los niveles de expresión de p21, caspasa-3 y PARP clivado y por tanto promueve la apoptosis celular a través de la estabilización de p53. La inducción de p53 inhibirá la progresión del ciclo celular. Se espera que la combinación de DBZ + ATRA potencie el mecanismo de apoptosis y detenga la progresión del ciclo celular de células cancerosas y exhiba la eficacia anticancerígena.

a Ilustración de apoptosis de células B16F10 tras tratamiento con ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF. Las células no tratadas se consideraron como control apropiado. La apoptosis se analizó usando citómetro de flujo. b Ilustraciones de análisis de ciclo celular realizado en células B16F10 tras tratamiento con formulaciones respectivas.

Efecto de Nanopartículas Combinacionales en Migración Celular

La migración celular se analizó a través de la membrana Transwell y se observaron las células migrantes por tinción con violeta de cristal (Fig. 8). Tras 24h, las células de control habían logrado casi la migración completa de células cancerosas. ATRA parece inhibir la migración celular relativamente mejor que células tratadas con DBZ. D-LNF también mostró un efecto inhibidor notable en la migración celular; sin embargo, el efecto de migración celular más notable se observó en células de melanoma B10F16 tratadas con RD-LNF. Como se ve, una disminución múltiple en la migración celular se observó comparada con células de control no tratadas. Estos resultados demuestran claramente que RD-LNF potencialmente disminuye la proliferación celular maligna aberrante y suprime la migración celular eficientemente.

Microfotografías representativas del ensayo de migración celular de células B16F10 tras tratamiento con ATRA libre, DBZ, D-LNF y RD-LNF y su cuantificación.