Eficacia antitumoral y farmacocinética mejoradas de la bufalina mediante liposomas pegilados

Métodos

Productos químicos y reactivos

La bufalina (≥ 98% de pureza) se compró a BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, China). L-α-fosfatidilcolina, colesterol y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenglicol) -2000] (sal de amonio; DSPE-PEG ₂₀₀₀ ) se adquirieron de Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, MO, EE. UU.) (las fórmulas moleculares de estas sustancias se muestran en el archivo adicional 1:Figura S1). El acetonitrilo utilizado era de calidad espectroscópica y se compró a Honeywell (América). El cloroformo y el alcohol (grado analítico) se adquirieron de Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (China). Todos los productos químicos eran de calidad analítica o de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Y el agua se desionizó con el sistema de purificación de agua Millipore (Milford, MA, EE. UU.) Y se filtró con una membrana de 0,22 μm.

Animales y celdas

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar (Shaanxi, China) (aprobación 2015-1013-R). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley, que pesaban inicialmente 250 ± 20 g, de la Cuarta Universidad Médica Militar (Xi’an, China). Las líneas celulares SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 y HepG2 se compraron respectivamente del Shanghai Cell Bank o del Experimental Animal Center de la Cuarta Universidad Médica Militar, cultivadas en RPMI 1640 suplementado con un 10% ( v / v ) suero fetal bovino (FBS) y antibióticos al 1% (100 U / mL de penicilina G y 0,1 mg / mL de estreptomicina). Las células se mantuvieron en su fase de crecimiento exponencial en una atmósfera de 5% de CO ₂ y 90% de humedad relativa a 37 ° C.

Síntesis de liposomas cargados con Bufalin

Los liposomas se prepararon como un tamaño de lote de 10 ml usando homogeneización a alta presión. La cantidad de bufalina utilizada fue la misma en todos los liposomas. Brevemente, se prepararon liposomas comunes cargados con bufalina con una composición de bufalina, colesterol y L-α-fosfatidilcolina en una relación molar de 10:30:60; Los liposomas PEGilados cargados con bufalina se sintetizaron con una composición de bufalina, colesterol, L-α-fosfatidilcolina y DSPE-PEG ₂₀₀₀ en una proporción molar de 10:30:55:5, respectivamente.

Las mezclas de fosfolípidos anteriores se dispersaron totalmente en 3 ml de cloroformo y luego el cloroformo se volatilizó completamente en un evaporador rotatorio a 50ºC en condiciones de descompresión. Posteriormente, el disolvente residual (si lo hubiera) se secó colocándolo en un desecador de vacío durante la noche, y luego la película delgada seca preparada se rehidrató usando un vórtice en 10 ml de agua desionizada precalentada a 50 ° C a 10 mmol / ml de fosfolípido durante 15 min. La mezcla así formada se procesó adicionalmente con homogeneización a alta presión. Se optimizó la presión y el tiempo de homogeneización, que resultó ser de 500 bar a 35 ° C, y el proceso se recicló 10 veces. La suspensión de liposomas resultante se extruyó inmediatamente con una extrusora Lipex (ATS, Canadá) dos veces usando membranas de policarbonato (tamaño de poro de 0,2 µm, Whatman, Maidstone, Reino Unido) para formar liposomas unilaminares. La suspensión liposomal en blanco también se preparó mediante el mismo método que se describió anteriormente, omitiendo el paso de adición de bufalina.

Caracterización de liposomas cargados con Bufalin

Tamaño de partícula y potencial Zeta

El tamaño de partícula y zeta El potencial de los liposomas se determinó mediante una técnica de dispersión de luz dinámica utilizando el método zeta analizador de potencial (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, California, EE. UU.). Todos los liposomas de bufalina se diluyeron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración adecuada antes de determinar la distribución de tamaño y zeta potencial. Las mediciones se llevaron a cabo en modo totalmente automático.

Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución

Los liposomas de bufalina se caracterizaron además con estudios de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM). La suspensión liposomal bufalina soportada sobre una rejilla de cobre de malla 300 se tiñó negativamente con 1% ( w / v ) ácido fosfotúngstico. La imagen directa de la morfología se ejecutó a voltajes de aceleración de 200 kV utilizando un TEM (Hitachi H-7650, Tokio, Japón).

Eficiencia de atrapamiento

El contenido de bufalina se analizó mediante el método de HPLC. El sistema de HPLC Shimadzu (Kyoto, Japón) estaba equipado con una bomba LC-20AT, un detector de matriz de diodos SPO-M20A, un horno de columna CTO-10AS VP y un muestreador automático SIL-10AF. Todas las separaciones se llevaron a cabo en una columna SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, China). El volumen de inyección fue de 20 µl y el efluente de la columna se controló a 296 nm. Los datos se adquirieron y procesaron utilizando el software ClassVP. La fase móvil consistió en una mezcla de acetonitrilo:dihidrogenofosfato de potasio al 0,1% (con ácido fosfórico para ajustar el valor de pH de 3,8) con gradiente de elución (50:50, v / v ). La cromatografía se realizó a un caudal de 1,0 ml / min. Para determinar la eficacia de atrapamiento, se añadió 1,0 ml de suspensión liposomal de bufalina a la columna Sephadex G50 y se eluyó con PBS. La porción azulada del efluente se recogió y se completó hasta 10,0 ml (el volumen final) mediante la adición de PBS. La cantidad ( W ₁ ) de bufalina en la suspensión liposomal se determinó mediante el método de HPLC. Se añadió PBS a la otra porción de 1,0 ml de suspensión liposomal de bufalina, para alcanzar el volumen final hasta 10,0 ml, y la cantidad ( W ₂ ) de bufalina contenida se determinó por los mismos medios. El porcentaje de bufalina atrapado en los liposomas de bufalina se calculó mediante la fórmula:

Ensayo de estabilidad in vitro

La eficiencia de atrapamiento probada por el método de cromatografía Sephadex y el tamaño de partícula determinado por zeta Se aplicó un analizador de potencial para evaluar el perfil de estabilidad después del almacenamiento a 4 ° C los días 0, 7, 15, 30 y 90. En los cinco puntos de tiempo, se aspiraron 200 μL de suspensión de liposomas para determinar la tasa de fuga de liposomas. Inmediatamente, se separó bufalina libre de 200 µl de suspensión de liposomas usando cromatografía en columna Sephadex G50, y se determinó la cantidad de bufalina libre mediante el método HPLC. La tasa de fuga de liposomas se calculó mediante la fórmula:

Liberación in vitro de Bufalin

Los comportamientos de liberación in vitro de bufalina de los liposomas se llevaron a cabo utilizando la técnica de la bolsa de diálisis a 37 ° C como se describió anteriormente con algunas modificaciones. Se utilizó como medio de liberación PBS (pH =7,4) que contenía suero de ternero fetal al 10%. El fármaco libre se eliminó de los liposomas de bufalina mediante diálisis exhaustiva durante 4 h contra tampón PBS a 4ºC. Brevemente, se pipeteó 1,0 ml de suspensión liposomal de bufalina en un tubo de diálisis (Spectrumlabs, EE. UU.; MWCO 30 kDa) con una suave agitación horizontal (120 rpm / min) a temperatura ambiente. El tubo de diálisis se mantuvo en 50 ml de PBS (pH =7,4) que contenía suero de ternero fetal al 10% y la temperatura se mantuvo a 37ºC. El dializado se retiró del medio y se reemplazó con un volumen igual de PBS fresco en diferentes duraciones de tiempo, a saber. horas 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 y 48. La concentración de bufalina liberada se midió por HPLC como se describió anteriormente.

Citotoxicidad

Se llevaron a cabo estudios de citotoxicidad in vitro utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) en varios tipos de líneas de células tumorales, incluidas SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 y HepG2. Además, las células U87 y U251 se seleccionaron para medir los efectos citotóxicos de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina en células tumorales de glioma. Las células U87 y U251 se sembraron respectivamente en placas de microtitulación de 96 pocillos a 1,0 × 10 ⁵ células / pocillo y se deja adherir (37 ° C, 5% CO ₂ ) durante 24 h, después de lo cual se aspiró el medio y se reemplazó con 0,1 ml de medio fresco. La entidad bufalina, los liposomas en blanco, los liposomas PEGilados en blanco, los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina se diluyeron en medio completo y se añadieron a las células en un volumen total de 0,1 ml para lograr la concentración final deseada; para el control, no se añadió solución de prueba. Los liposomas en blanco y los liposomas PEGilados en blanco se evaluaron para probar la toxicidad de los excipientes usados ​​en la preparación de liposomas de bufalina. Después de 24 h, se evaluó la viabilidad celular incubando en un medio de crecimiento que contenía 5 mg / ml de MTT durante 4 ha 37 ° C. Después de aspirar el medio de cultivo, los cristales de formazán formados se solubilizaron con 200 µL de disolvente orgánico. La absorbancia se midió en un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm.

Estudio farmacocinético in vivo de liposomas de bufalina mediante el método HPLC

El estudio farmacocinético se realizó para evaluar la absorción, distribución, metabolismo y excreción de bufalina a partir de liposomas comunes o liposomas de circulación prolongada y para buscar las diferencias de biodisponibilidad de bufalina mediante la técnica de HPLC.

En este experimento, se compraron ratas Sprague-Dawley macho adultas jóvenes y sanas, con un peso de 250 ± 20 g, de la Cuarta Universidad Médica Militar (Xi’an, China). Las ratas fueron alojadas en jaulas bien ventiladas a temperatura ambiente (24 ± 2 ° C) y 40-60% de humedad relativa mientras estaban en un ciclo regular de luz-oscuridad de 12 h. Los animales se aclimataron durante un mínimo de 3 días antes del experimento. Los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité de Ética Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar.

Se prepararon liposomas cargados con bufalina, liposomas PEGilados cargados con bufalina y bufalina en suspensión acuosa con solubilización asistida por etanol como se describió anteriormente y luego se administraron por vía intravenosa a una dosis equivalente de 0,5 mg / kg, respectivamente. Se recolectaron muestras de sangre de la fosa orbital de ratas bajo anestesia ligera con éter en tubos de micro-fuga que contenían heparina como anticoagulante a 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 min post- dosificación y luego centrifugado a 3500 r / min durante 15 min a 4 ° C. El plasma separado se almacenó congelado a -20 ° C antes del ensayo.

Pretratamiento de muestra

Se siguió un método simple de extracción líquido-líquido para la extracción de bufalina y patrón interno de sangre de rata. A 200 μL, se añadió una solución estándar interna (20 μL de 100 μg / mL de stock de trabajo de cinobufagin) equivalente a 10,0 μg y se mezcló durante 10 s en un ciclomezclador, seguido de extracción con 3,0 mL de acetato de etilo:éter de petróleo, 1:1 ( v / v ) y mezcla. La mezcla se agitó con vórtex durante 5 min, seguido de centrifugación durante 15 min a 4000 r / min en Sigma 3-16k (Frankfurt, Alemania). Se separó una alícuota de 3,0 mL de capa orgánica y se evaporó a sequedad bajo nitrógeno, y luego se redisolvió el residuo en 200 μL de acetonitrilo. Se inyectaron veinte microlitros de líquido sobrenadante en una columna analítica para su análisis después de una centrifugación de 15 minutos a 12.000 r / min.

Análisis farmacocinético

La concentración sanguínea máxima observada ( C _máx ) y el tiempo de vida media ( T _1/2 ) se obtuvieron mediante inspección visual de los datos experimentales. Los datos se sometieron a un análisis de farmacocinética no compartimental utilizando Medicamentos y Estadísticas (DAS 2.1.1) editado por el comité profesional de farmacología matemática de la Sociedad Farmacológica China para la evaluación clínica de medicamentos. Los datos se analizaron según un modelo abierto de dos compartimentos.

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresaron como media ± DE ( n =3), y las diferencias entre formulaciones se compararon mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), utilizando el software GraphPad Prism 5. P <0.05 denota importancia en todos los casos.

Resultados

Propiedades fisicoquímicas

La rehidratación de la película combinada con la tecnología de homogeneización a alta presión se utilizó para la preparación de liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina. La rehidratación con película es uno de los métodos convencionales para sintetizar liposomas con procesos maduros y controlados para atrapar fármacos lipofílicos. Además, la cantidad de ciclos de homogeneización juega un papel clave para lograr una suspensión liposomal uniforme y estable.

Las morfologías de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina son casi esféricos u ovalados como se observa en TEM como se muestra en la Fig. 1. De acuerdo con la imagen de TEM, los tamaños medios de partícula de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina los liposomas estaban ambos por debajo de 200 nm. Los tamaños medios de partícula de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina fueron 127,6 ± 3,64 nm y 155,0 ± 8,46 nm, respectivamente (Fig. 1c), medidos por zeta analizador de potencial (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, California, EE. UU.). En comparación con los liposomas cargados con bufalina, los liposomas PEGilados cargados con bufalina exhibieron una carga superficial negativa, lo que sugiere una excelente estabilidad (liposomas cargados con bufalina 2,24 mV; liposomas PEGilados cargados con bufalina -18,05 mV, archivo adicional 2:Tabla S1). Además, las distribuciones de zeta potencial se puede ver en la Fig. 1b. Sin embargo, la eficacia de atrapamiento de bufalina en liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina determinada por HPLC es 76,31 ± 3,40% y 78,40 ± 1,62%, respectivamente.

Propiedades fisicoquímicas de liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina. un Imágenes TEM de liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina con forma casi esférica u ovalada. b El tamaño de partícula y la distribución típicos de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina medidos por dispersión dinámica de la luz. c La superficie típica zeta potencial de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina

Ensayo de estabilidad in vitro

Los perfiles de estabilidad de los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina se muestran en la Tabla 1. Además, también se ha calculado la relación de fuga de liposomas. Para los liposomas cargados con bufalina, los resultados fueron respectivamente 0.0, 16.7, 25.2, 27.9 y 30.6% a 4 ° C los días 0, 7, 15, 30 y 90. Para los liposomas PEGilados cargados con bufalina, los resultados fueron respectivamente 0.0 , 5.0, 8.8, 14.5 y 18.0% a 4 ° C los días 0, 7, 15, 30 y 90.

Perfil de liberación in vitro

El perfil de liberación de bufalina a partir de liposomas cargados con bufalina o liposomas PEGilados cargados con bufalina se resume en la Fig. 2. A partir de los datos experimentales, en el mismo medio de disolución, la bufalina podría difundirse en PBS que contiene suero de ternera fetal al 10% rápidamente sin restricciones, seguido de bufalina liposomas cargados y por último liposomas PEGilados cargados con bufalina.

Liberación in vitro de bufalina a partir de liposomas comunes cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina en medio de disolución tampón de fosfato, pH 7,4. Los datos son medias ± DE, n =3

Citotoxicidad

Las viabilidades celulares de varios tipos de líneas de células tumorales afectadas por la entidad bufalina se muestran en la Fig. 3a cuando se prueban mediante el ensayo MTT, y su concentración inhibitoria media máxima (IC ₅₀ ) también se calculan en Archivo adicional 2:Tabla S2. Bufalin provocó la inhibición del crecimiento en múltiples células tumorales de una manera dependiente de la dosis, mientras que los resultados de IC ₅₀ reveló que la bufalina era más sensible a las células cancerosas del glioma U251 y U87 que las otras células cancerosas analizadas, respectivamente. Cuando se aplica con entidad bufalina, liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina, las viabilidades celulares de U251 realizadas por ensayo MTT se muestran en la Fig. 3b. Cuando se cultivaron durante 12 h, las viabilidades celulares de la entidad bufalina, los liposomas cargados con bufalina y los liposomas PEGilados cargados con bufalina exhibieron de manera diferente, mientras que los de los liposomas en blanco y los liposomas PEGilados en blanco no cambiaron. Como se describe, en el mismo nivel de concentración, la viabilidad celular de U251 en el grupo de liposomas PEGilados cargados con bufalina fueron siempre más bajas que las del grupo de liposomas cargados con bufalina; mientras tanto, los impactos de la entidad bufalina en la viabilidad celular fueron mínimos.

Citotoxicidad in vitro de liposomas en blanco, liposomas PEGilados en blanco, entidad bufalina, liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina contra células tumorales. un Viabilidad celular de varios tipos de líneas de células tumorales a diversas concentraciones de entidad bufalina. b Viabilidad celular de las células U251 a diversas concentraciones de liposomas en blanco, liposomas PEGilados en blanco, entidad bufalina, liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina

Estudio farmacocinético in vivo

Validación del método

La curva de calibración se trazó basándose en un análisis de regresión lineal de la objeción a la relación de área de pico estándar interno ( y ) versus concentraciones ( x , μg / mL) de bufalina en la solución estándar a siete concentraciones diferentes. La ecuación de regresión fue y =0,4238 x + 0.2429 (rango lineal 0.05–10.0 μg / mL) y coeficientes de correlación ( R ² ) fueron 0,9965. El valor del límite de detección (LOD) fue de 0,01 μg / ml, que se calculó como la cantidad de muestra inyectada que dio una relación señal / ruido de 3 (S / N =3).

Especificidad, precisión y recuperación

El grado de interferencia de sustancias endógenas se evaluó mediante la inspección de cromatogramas derivados de muestras de plasma en blanco procesadas. Archivo adicional 3:La Figura S2 presenta cromatogramas típicos de plasma en blanco, plasma en blanco enriquecido con bufalina, plasma en blanco enriquecido con bufalina y resibufogenina (como estándar interno), muestras de plasma enriquecidas con resibufogenina 30 min después de la administración intravenosa de la entidad bufalina, muestras de plasma enriquecidas con resibufogenina 30 min después de la administración intravenosa de liposomas cargados con bufalina, y muestras de plasma enriquecidas con resibufogenina 30 min después de la administración intravenosa de liposomas PEGilados cargados con bufalina. La bufalina y la resibufogenina se eluyeron a aproximadamente 7,191 y 10,131 min, respectivamente. No se encontraron picos de interferencia y materiales de membrana de liposomas en el tiempo de retención de bufalina o patrón interno. Los resultados de las pruebas de precisión y recuperación se ilustran en la Tabla 2.

Farmacocinética

Los perfiles de concentración en sangre-tiempo de liposomas cargados con bufalina, liposomas PEGilados cargados con bufalina y su comparación con la entidad bufalina en suspensión acuosa se muestran en la Fig. 4. Los parámetros farmacocinéticos medios se presentan en la Tabla 3. Los resultados mostraron que había diferencias significativas en la mayoría de estos parámetros entre ellos, y la C _máx de liposomas cargados con bufalina fue menor que la entidad bufalina, mientras que la de liposomas PEGilados cargados con bufalina fue menor. Además, la T _{1 / 2z} La relación de liposomas PEGilados cargados con bufalina a entidad bufalina y liposomas cargados con bufalina a entidad bufalina fue de aproximadamente 2,15 veces (87,84 min / 40,52 min) ( P <0,01) y 1,34 veces (54,40 min / 40,52 min) ( P <0.05), respectivamente. Las AUC _{(0– t )} La relación de liposomas PEGilados cargados con bufalina a entidad bufalina y liposomas cargados con bufalina a entidad bufalina fue de aproximadamente 5,49 veces (139,157.83 ng / (mL min) /25,334.27 ng / (mL min)) ( P <0,01) y 2,28 veces (57.751,88 ng / (ml min) /25.334,27 ng / (ml min)) ( P <0.01), respectivamente. Reveló que la entidad bufalina se eliminó rápidamente en el torrente sanguíneo y la preparación de liposomas aumentó la concentración de fármaco en el plasma y resistió la eliminación. Además, la modificación de PEG podría facilitar este efecto.

Curva de concentración-tiempo de bufalina en plasma en ratas

Discusión

Este estudio preparó con éxito liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina mediante el método de rehidratación de película de homogeneización, los cuales tenían un rango de tamaño óptimo y baja polidispersidad y podían reproducirse fácilmente en un gran tamaño de lote. Este estudio encontró que la formulación liposomal mejoró enormemente la solubilidad de la bufalina.

Los liposomas PEGilados cargados con bufalina exhibieron una carga superficial negativa con un valor absoluto mayor que los liposomas cargados con bufalina con una carga superficial positiva. El zeta El potencial está determinado principalmente por las propiedades de la superficie. Los liposomas cargados con bufalina no modificados eran neutrales y sus potenciales estaban generalmente dentro de ± 5 mV. Sin embargo, DSPE no se carga en condiciones neutrales, pero el proceso de preparación no puede ser completamente neutral, por lo que DSPE está cargado negativamente. Mientras tanto, el zeta El potencial de la macromolécula PEG es aproximadamente negativo para varios milivoltios, potencial negativo cercano a neutral. Por lo tanto, después de la modificación de la superficie de DSPE-PEG ₂₀₀₀ en liposomas cargados con bufalina, el zeta el potencial de los liposomas PEGilados cargados con bufalina es negativo. Estos hallazgos sugieren que la modificación de la superficie de DSPE-PEG ₂₀₀₀ cambia los potenciales eléctricos superficiales de los liposomas, lo que mejora su estabilidad. Se confirmó mediante una prueba de estabilidad in vitro. Li y col. [12] empleó un sistema de coadministración de liposomas que acopló mAb anti-CD40 a la superficie de los liposomas PEGilados envueltos con bufalina. Los liposomas se sintetizaron con una composición de bufalina, colesterol, EPC, DSPE-PEG ₂₀₀₀ y DSPE-PEG ₂₀₀₀ -Mal en una relación molar de 20:55:5:5:15, respectivamente. A continuación, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 se conjugó con los liposomas mediante la reacción de maleimida-tiol para la preparación de anti-CD40 anclado al liposoma de bufalina. Con respecto al perfil de estabilidad, solo se menciona que la carga superficial negativa sugiere una excelente estabilidad sin una descripción de datos clara y definida.

Li y col. [13] preparó un liposoma cargado de bufadienólido (BU-lipo) que constaba de Lipoid E-80® al 1,25% y colesterol al 0,06%. Las eficiencias de atrapamiento de bufalina, cinobufagina y resibufogenina fueron 86,5, 90,0 y 92,1%, respectivamente. Teniendo en cuenta la estabilidad de los fosfolípidos, se eligió un pH de 6,5 para la formulación de BU-lipo. Las propiedades de BU-lipo, como pH, PSD, zeta el potencial y la eficiencia de atrapamiento no cambiaron durante al menos 3 meses a 2-8 ° C. Sin embargo, era necesario controlar estrictamente las condiciones de almacenamiento. Es necesario estudiar una preparación más estable a pH neutro para reducir los costos de transporte y almacenamiento, que deben tenerse en cuenta para la futura aplicación clínica.

De acuerdo con la formulación de la preparación de los estudios anteriores, replicamos los experimentos sobre liposomas cargados con bufalina. Sin embargo, la estabilidad de los liposomas no pudo satisfacer las necesidades de producción.

En el presente estudio, se sintetizaron liposomas PEGilados cargados con bufalina con una composición de bufalina, colesterol, L-α-fosfatidilcolina y DSPE-PEG ₂₀₀₀ en una relación molar de 10:30:55:5, respectivamente. Especialmente antes de extruirse con una extrusora Lipex utilizando membranas de policarbonato, la mezcla así formada se procesó adicionalmente con homogeneización a alta presión.

Cuando se almacenan en pH neutro a 4 ° C durante 3 meses, los tamaños de partículas de ambos liposomas aumentaron ligeramente y la eficiencia de atrapamiento disminuyó modestamente en general, lo que será conveniente para su uso en aplicaciones clínicas. Una fotografía de TEM mostró que una gruesa estructura tridimensional similar a una nube cubría la superficie de los liposomas cargados de bufalina, lo que indica que DSPE-PEG ₂₀₀₀ juega un papel en la estabilización estérica debido a su característica de estructura de polímero lineal anfifílico.

Un estudio de liberación in vitro reveló que las liberaciones de bufalina a partir de liposomas cargados con bufalina y liposomas PEGilados cargados con bufalina se retrasaron en el mismo medio de disolución, mientras que la entidad bufalina se difundió en PBS rápidamente sin restricciones. La modificación de la superficie de DSPE-PEG ₂₀₀₀ alteró las propiedades de barrera de la capa límite acuosa y la permeabilidad de la membrana, lo que resultó en una baja velocidad de liberación de bufalina de los liposomas.

En cuanto al estudio de citotoxicidad, la bufalina provocó una obvia inhibición del crecimiento en múltiples células tumorales de forma dosis-dependiente, mientras que los resultados de IC ₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.

Los efectos de acoplamiento de los polaritones de plasma superficial y las resonancias magnéticas dipolo en metamateriales Preparación de nanoesferas poliméricas impresas con iones de paladio (II) y su eliminación del paladio (II) de la solución acuosa