Nanoalginato mediante síntesis en micelas inversas: encapsulación de doxorrubicina y citotoxicidad en células de cáncer de mama murino

Resumen

Las nanopartículas de alginato reticulado representan una plataforma atractiva para la encapsulación y administración de fármacos. En este trabajo presentamos un protocolo sencillo de micelas inversas que carga doxorrubicina (DOX), soluble en agua, en una matriz de alginato reticulado con calcio, generando partículas NALG-DOX con un diámetro hidrodinámico de ~83 nm y un potencial zeta de +7,2 mV. Las nanoalginato (NALG) resultantes son esféricas y monodispersas, según confirmó microscopía electrónica de transmisión (TEM). La liberación de DOX fue controlada, reteniéndose ~70 % a las 4 h y liberándose ~90 % a las 24 h a pH fisiológico. La imagen de fluorescencia confirmó la captación celular de DOX desde NALG-DOX en células 4T1 de cáncer de mama murino. Los ensayos de citotoxicidad (LIVE/DEAD y Alamar Blue) revelaron una IC₅₀ de 0,45 µg/mL para NALG-DOX frente a 0,093 µg/mL para DOX libre, mientras que el vector NALG vacío no mostró toxicidad. Estos resultados demuestran el potencial del método de micelas inversas para producir nanopartículas de alginato biocompatibles y cargadas con fármaco.

Antecedentes

La encapsulación de quimioterápicos ofrece ventajas frente a la administración sistémica de fármaco libre, como circulación prolongada, protección contra proteínas plasmáticas y reducción de la toxicidad sistémica. Los nanovectores pueden aprovechar el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) de los tumores sólidos, permitiendo una dirigición pasiva cuando tienen el tamaño adecuado. Aunque liposomas, partículas poliméricas y nanopartículas lipídicas han llegado a la práctica clínica, muchas formulaciones novedosas enfrentan desafíos en la preparación escalable y reproducible. El alginato, un polisacárido natural, biodegradable y no inmunogénico, puede reticularse con cationes divalentes (típicamente Ca²⁺) para formar nanopartículas de hidrogel. Este estudio presenta una síntesis rápida en micelas inversas a temperatura ambiente que produce nanopartículas de alginato uniformes capaces de encapsular fármacos hidrofílicos como la DOX.

Métodos

Materiales

Alginato sódico, cloruro de calcio dihidratado, ciclohexano, dodecilamina y clorhidrato de doxorrubicina se adquirieron de Sigma‑Aldrich y MedChem Express. Todas las soluciones se prepararon en agua de 18 MΩ.

Preparación del nanoalginato (NALG)

El alginato (15 mg/mL) se agitó durante 30 min para asegurar su disolución completa. Para la carga de DOX, el fármaco se disolvió en la misma fase acuosa. Ocho mililitros de ciclohexano se colocaron en un vial y se añadieron 80 µL de dodecilamina (solubilizada en agua tibia) para generar la fase oleosa. La solución acuosa de alginato/DOX (20 µL) se introdujo bajo agitación vigorosa (1200 rpm) durante 20 min, seguida de la adición de 30 µL de CaCl₂ 50 mM para reticular el alginato dentro de las micelas inversas. Tras 25 min, se añadieron 2 mL de agua para separar la fase acuosa, de la cual se recuperaron las nanopartículas por pipeteo.

Purificación

El extracto acuoso se filtró secuencialmente a través de unidades centrífugas de 100 kDa y 10 kDa (Pall, Millipore) para eliminar agregados y fármaco libre, obteniendo un volumen final de 1 mL de NALG o NALG-DOX purificados.

Caracterización

La dispersión dinámica de luz (Malvern Zetasizer) midió el tamaño (láser 633 nm, 25 °C, retrodispersión 173°). El potencial zeta se registró inmediatamente después. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) en un Tecnai F‑20 (4 kV) confirmó la morfología. El contenido de DOX se cuantificó por su fluorescencia intrínseca (excitación 470 nm, emisión 550 nm) y se comparó con una curva estándar.

Estudio de liberación

La diálisis (Slide‑A‑Lyzer MINI, 2 kDa MWCO) en PBS (pH 7,4) y tampón citrato (pH 5,5) evaluó la liberación de DOX a 1, 2, 4, 24, 48 y 72 h. Las lecturas de fluorescencia permitieron calcular la concentración de DOX liberado.

Cultivo celular y tratamiento

Células 4T1‑luc2‑GFP de cáncer de mama murino (PerkinElmer) se cultivaron en RPMI 1640 + 10 % FBS + 1 % penicilina/estreptomicina. Se sembraron a 4000 células/pozo (placa de 96 pozos) y se trataron tras 24 h con NALG, DOX libre o NALG-DOX a distintas concentraciones.

Imagen de fluorescencia

A las 48 h, las células se fijaron con formalina, se tiñeron con NucBlue y se obtuvieron imágenes en un EVOS FL Auto (ThermoFisher) usando canales DAPI, GFP y DOX. Las imágenes se procesaron con ImageJ.

Ensayo LIVE/DEAD

A las 72 h, las células se incubaron con reactivos NucBlue Live y NucGreen Dead (ThermoFisher), se fijaron y se obtuvieron imágenes como se describió. La fluorescencia verde indicó células muertas.

Ensayo de viabilidad Alamar Blue

Se añadió Alamar Blue (10 µL por pozo en 100 µL de medio) a las 72 h, se incubó 1 h a 37 °C y se leyó en un Tecan Infinite M200 Pro (560/590 nm). La viabilidad celular se expresó como porcentaje relativo a controles sin tratar.

Resultados y discusión

Síntesis en micelas inversas

El enfoque de micelas inversas produjo coloides acuosos transparentes de NALG y NALG-DOX. El ciclohexano actuó como fase oleosa, mientras que la dodecilamina funcionó como surfactante para estabilizar las cadenas de alginato dentro de las micelas. El cloruro de calcio reticuló la red de hidrogel, y la posterior extracción acuosa produjo partículas monodispersas.

Caracterización de partículas

Los datos de DLS mostraron NALG a 92,2 ± 4,2 nm (PDI 0,320 ± 0,063, ζ –15,0 ± 0,8 mV) y NALG-DOX a 82,8 ± 3,6 nm (PDI 0,204 ± 0,044, ζ +7,2 ± 4,6 mV). Las imágenes TEM confirmaron morfología esférica con diámetros acordes a las mediciones DLS. La carga de DOX fue ~7 % (≈4 µg/mL), indicando una eficiencia de encapsulación moderada típica de vectores poliméricos.

Cinética de liberación

En PBS (pH 7,4), ~70 % de DOX permaneció a las 4 h, con ~90 % liberado a las 24 h. A pH 5,5, la liberación se aceleró, reflejando el microambiente tumoral ácido y los compartimentos intracelulares, y permitiendo un perfil de liberación de fármaco sensible al pH.

Captación celular

La microscopía de fluorescencia a las 48 h reveló DOX localizado cerca del núcleo en tratamientos con DOX libre y NALG-DOX. El DOX encapsulado mostró una distribución perinuclear distinta, consistente con captación endocítica y liberación subsiguiente en el endosoma ácido.

Citotoxicidad

La imagen LIVE/DEAD mostró mínima muerte celular con NALG solo, mientras que DOX y NALG-DOX indujeron citotoxicidad dependiente de la dosis. El análisis Alamar Blue arrojó valores IC₅₀ de 0,093 µg/mL para DOX libre y 0,45 µg/mL para NALG-DOX. La mayor IC₅₀ de NALG-DOX refleja la liberación controlada y la menor disponibilidad inmediata del fármaco, sin embargo, el fármaco encapsulado mantiene su eficacia.

Conclusiones

Hemos establecido un método rápido y escalable de micelas inversas para generar nanopartículas de alginato de ~90 nm que encapsulan eficientemente DOX. El NALG-DOX resultante muestra liberación controlada, toxicidad sistémica reducida y actividad antitumoral comparable a DOX libre in vitro. Los trabajos futuros se centrarán en optimizar la eficiencia de encapsulación y el comportamiento in vivo.

Abreviaturas

4T1‑luc2‑GFP

4T1 luciferasa/proteína fluorescente verde

CaCl₂

Cloruro de calcio

DAPI

4′,6‑Diamidino‑2‑fenilindol

DLS

Dispersión dinámica de luz

DMSO

Dimetilsulfóxido

DOX

Doxorrubicina

NALG

Nanopartículas de alginato

NALG‑DOX

Nanopartículas de alginato con doxorrubicina

PBS

Salina fosfato amortiguada

PDI

Índice de polidispersidad

TEM

Microscopía electrónica de transmisión