Optimización liposomas ácido glicirretínico via solución monofase liofilización: preformulación, diseño y evaluación in vitro

Resumen

En este estudio, liposomas ácido glicirretínico (GA) se formularon exitosamente usando método solución monofase liofilización. Trabajo preformulación examinó solubilidad fosfatidilcolina soja (SPC), colesterol y GA en co-solventes alcohol terc-butilo/agua (TBA/agua). Investigamos cómo porcentaje volumen TBA influye tasa sublimación, y caracterizamos GA liofilizado por DSC, XRD y FTIR. XRD indicó estado amorfo GA, mientras FTIR confirmó no ocurrieron cambios químicos. Pruebas solubilidad revelaron aumento marcado solubilidad acuosa GA. Usando diseño Box-Behnken y selección liooprotector, identificamos formulación óptima—508 mg SPC, 151 mg colesterol, 55 % TBA, y ratio peso trehalosa/SPC 4:1. Bajo estas condiciones, liposomas reconstituidos exhibieron eficiencia encapsulación 74,87 % y diámetro medio 191 nm. Estudios liberación in vitro mostraron liberación sostenida en dos medios, y ensayos captación celular demostraron captación tiempo-dependiente por células Hep G2.

Antecedentes

Ácido glicirretínico (GA), triterpeno saponina extraído raíces Glycyrrhiza, exhibe actividad antimicrobiana, antiviral y anticancerígena y se usa clínicamente hepatitis crónica y cáncer hígado. Según Sistema Clasificación Biofarmacéutica, GA fármaco clase II; su baja polaridad, alta hidrofobicidad y pobre solubilidad limitan biodisponibilidad oral y pueden causar retención sodio y pérdida potasio dosis-dependiente, llevando hipertensión. Mejorar absorción y mantener concentraciones terapéuticas mediante formulación dirigida es por tanto esencial.

Liposomas ampliamente reconocidos por biocompatibilidad, capacidad dirigir ganglios linfáticos y sitios tumorales via efecto permeabilidad y retención mejorada, y versatilidad transportar fármacos hidrofóbicos e hidrofílicos. Sin embargo, suspensiones liposomas acuosas convencionales son inestables, propensas fuga, fusión e hidrólisis fosfolípidos, dificultando almacenamiento largo plazo. Proliposomas —polvos fluidos secos que reconstituyen liposomas al hidratarse— ofrecen solución. Producción proliposomas tradicional por spray-drying o freeze-drying tiene inconvenientes: spray-drying puede dañar fármacos termosensibles, y freeze-drying consume tiempo y costoso por remoción prolongada agua.

Innovación reciente, método solución monofase liofilización, disuelve lípidos, fármaco y liooprotector soluble agua en co-solvente alcohol terc-butilo/agua, luego liofilización produce polvo seco que forma espontáneamente liposomas al añadir agua. Ventajas incluyen sublimación rápida, procesamiento un paso apto producción gran escala, bajo riesgo solvente residual (TBA clase 3), salida polvo estéril y compatibilidad fármacos pobremente solubles agua o inestables.

A pesar estos beneficios, lagunas conocimiento permanecen: impacto concentración TBA/agua en tasa sublimación, cambios estado sólido fármaco post-liofilización, y proceso ensamblaje hidratación polvo. Este estudio usa GA modelo abordar estas preguntas, optimizando variables formulación y proceso via diseño Box-Behnken, evaluando efectos liooprotector y evaluando liberación in vitro y captación celular.

Métodos / Experimental

Materiales

Ácido glicirretínico (≥ 98 % pureza) fuente Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. Fosfatidilcolina soja (Lipoid S100) y colesterol obtuvieron Lipoid GmbH y J&K Scientific Ltd., respectivamente. FITC-PEG-DSPE (PM 2000) de Shanghai Ponsure Biotech, Inc. Alcohol terc-butilo (≥ 98 %) y demás reactivos comprados Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Agua desionizada producida sistema Milli-Q.

Estudios Solubilidad

Soluciones saturadas GA, SPC y colesterol prepararon mezclas TBA/agua temperaturas 25 °C a 45 °C. Solubilidad GA cuantificó HPLC columna C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm) fase móvil metanol/agua (90:10 v/v) 1,0 ml min⁻¹, detectando 250 nm. Solubilidad SPC y colesterol estimó método turbidimétrico, monitorizando absorbancia 655 nm.

Preparación Solución Monofase Liofilización

GA, SPC y colesterol disolvieron TBA 45 °C; liooprotector seleccionado (manitol, lactosa, sacarosa o trehalosa) disolvió agua 45 °C. Dos soluciones mezclaron rendir solución monofase isotrópica (60 ml). Tras filtración (0,22 µm), alícuotas 2,0 ml colocaron viales liofilización 10 ml, pre-congelaron −40 °C 12 h, liofilizaron −50 °C 24 h (presión cámara 1–20 Pa).

Tamaño Partícula y Eficiencia Encapsulación

Liposomas reconstituidos prepararon dispersando 5 mg polvo proliposoma 5 ml agua purificada, vortex 1 min, repitiendo tras 15 min. Tamaño midió dispersión luz dinámica (Nano ZS90, Malvern). Eficiencia encapsulación (EE) determinó ultrafiltración-centrifugación: 1 ml dispersión filtró filtro 50 kDa PMCO, filtrado cuantificó HPLC, EE calculó via EE = (1 − W_libre/W_total) × 100 %.

Tasa Sublimación y Presión Vapor

Mezclas TBA/agua porcentajes volumen TBA variables (10–90 %) pre-congelaron y liofilizaron; tiempo hasta sublimación completa registró calcular tasa (µl min⁻¹). Presión vapor midió ebulliometro estático y ecuación Antoine.

Caracterización Fisicoquímica

DSC (HSC-1, 25–350 °C, 10 °C min⁻¹, atmósfera N₂) evaluó transiciones térmicas. XRD (D8 Focus, Cu-Kα, 5°–60°, 5° min⁻¹) evaluó cristalinidad. FTIR (Nicolet 6700, 4000–400 cm⁻¹, 4 cm⁻¹ resolución) verificó integridad química.

Estabilidad

Polvos proliposomas almacenaron 25 °C, nitrógeno-llenados, oscuridad. Tras 6 meses, EE y tamaño partícula liposomas reconstituidos re-evaluaron.

Liberación In Vitro

Liberación estudió diálisis (PMCO 8000–14000 Da) en PBS (pH 7,4) o 0,1 % Tween 80 salino 37 °C, agitación 300 rpm. Muestras retiraron hasta 12 h, reemplazaron medio fresco, GA cuantificó HPLC.

Captación Celular

Liposomas GA marcados FITC incubaron células HepG2 (1 × 10⁴ células mL⁻¹) 0,5, 1, 2 y 4 h. Tras lavado y quenching azul tripano, células lisaron Triton X-100. Fluorescencia (excitación 495 nm, emisión 520 nm) midió y normalizó contenido proteico (ensayo BCA).

Resultados y Discusión

Solubilidad y Sublimación

Solubilidad GA en TBA/agua subió progresivamente tanto porcentaje volumen TBA como temperatura; solubilidad excedió 0,5 mg mL⁻¹ cuando TBA > 40 %. SPC y colesterol requirieron volúmenes TBA decrecientes conforme temperatura aumentó sobre 35 °C, confirmando efecto disolución favorable TBA.

Tasa sublimación aumentó 4 µl min⁻¹ a 10 % TBA a más 10 µl min⁻¹ arriba 60 % TBA, atribuido mayor presión vapor saturada y cristales hielo aguja finos observados microscopía óptica.

Cambios Fisicoquímicos Post-Liofilización

DSC mostró desplazamiento pico fusión GA temperaturas menores conforme contenido TBA disminuía, mientras XRD confirmó pérdida completa picos cristalinos, indicando estado amorfo. Espectros FTIR permanecieron inalterados, probando estabilidad química. Amorfización aumentó solubilidad acuosa 6,36 µg mL⁻¹ (crudo) a 19–64 µg mL⁻¹ dependiendo ratio TBA.

Cribado Factor Único

SPC óptimo (480 mg), colesterol (120 mg) y TBA (50 %) identificaron basado mayor puntuación combinada EE y diámetro medio.

Optimización Box-Behnken

Usando SPC, colesterol y TBA variables independientes, modelo predijo condiciones óptimas: 508 mg SPC, 151 mg colesterol, 55 % TBA, rindiendo EE = 68,55 % y diámetro medio = 220 nm. Gráficos interacción confirmaron efectos sinérgicos.

Selección Liooprotector

Trehalosa superó lactosa, sacarosa y manitol. Ratio trehalosa/SPC 4:1 maximizó EE (74,87 %) y minimizó tamaño partícula (191 nm), con protección superior ciclos congelación-descongelación.

Microscopía Electrónica Transmisión

Imágenes mostraron hidratación inicial GA disperso y fragmentos lípidos, evolucionando liposomas esféricos uniformes ~200 nm con envoltura bicapa y fármaco atrapado.

Estabilidad

Tras 6 meses 25 °C, EE permaneció 72,82 % y diámetro 198 nm, indicando robusta estabilidad física.

Liberación In Vitro

Ambos medios PBS y salino exhibieron liberación sostenida: 65,25 % y 69,46 % GA liberado 12 h, con fase inicial rápida seguida meseta, confirmando comportamiento liberación sostenida.

Captación Celular

Captación HepG2 aumentó 1.480 ng mL⁻¹ proteína 30 min a 2.030 ng mL⁻¹ 240 min, con microscopía fluorescencia corroborando internalización tiempo-dependiente.

Conclusiones

Este trabajo demuestra método solución monofase liofilización, acoplado diseño Box-Behnken y liooprotector trehalosa, produce liposomas cargados GA alta eficiencia encapsulación (74,87 %), tamaño partícula pequeño (191 nm) y liberación sostenida 12 h. Método produce polvo seco estable apto producción gran escala y ofrece plataforma prometedora entregar terapéuticos hidrofóbicos.

Abreviaturas

BBD

Diseño Box-Behnken

DSC

Calorimetría diferencial barrido

EE

Eficiencia encapsulación

FTIR

Espectroscopía infrarrojo transformada Fourier

GA

Ácido glicirretínico

MD

Diámetro medio

SPC

Fosfatidilcolina soja

TBA

Alcohol terc-butilo

TEM

Microscopía electrónica transmisión

XRD

Difracción rayos X