Entrega de ácido oleanólico mediante micelas poliméricas: solubilidad mejorada y eficacia antiarrugas probada

Resumen

El ácido oleanólico se ha utilizado solo como agente subsidiario en productos cosméticos. El objetivo del estudio es mostrar el efecto del ácido oleanólico como ingrediente activo para el alivio de arrugas en humanos y desarrollar una formulación de micelas poliméricas que permita usar el ácido oleanólico, poco soluble, como ingrediente principal en productos cosméticos para reducir arrugas. Se evaluó la solubilidad del ácido oleanólico en solubilizantes, surfactantes y polímeros. Los tamaños y formas de las partículas de micelas poliméricas que contienen ácido oleanólico se evaluaron por espectrofotometría de dispersión de luz electroforética y crio-microscopía electrónica de barrido. La eficiencia de encapsulación y la permeación cutánea se midieron por HPLC. La estabilidad de las micelas poliméricas almacenadas a 40 °C durante 3 meses se evaluó por observación visual, medición del tamaño de partícula y medición del contenido de ácido oleanólico. Las micelas poliméricas en forma final de ampolla se aplicaron alrededor de los ojos de 23 sujetos femeninos durante 8 semanas. Cinco parámetros cutáneos se evaluaron por profilometría óptica cada 4 semanas durante 8 semanas. Además, profesionales realizaron observaciones visuales de la piel y se realizó un estudio de irritación cutánea humana. Se prepararon micelas poliméricas de ácido oleanólico con tamaño de partícula inferior a 100 nm usando Capryol 90® y poloxámero. La tasa de permeación cutánea del ácido oleanólico en las micelas poliméricas fue mayor que en otras soluciones hechas de ácido oleanólico disperso en 2 surfactantes diferentes. No se observaron cambios significativos en el tamaño de partícula, color o contenido de ácido oleanólico, y las micelas poliméricas almacenadas a 40 °C durante 3 meses no sufrieron separación de fase. Tras 8 semanas de aplicación, no se desarrolló irritación cutánea y los cinco parámetros evaluados por profilometría óptica, así como las puntuaciones de evaluación visual, mejoraron significativamente. Este estudio mostró que las micelas poliméricas de ácido oleanólico preparadas en este estudio fueron estables y efectivas para aliviar arrugas en humanos como ingrediente activo principal. Basado en estos hallazgos, se espera que las micelas poliméricas de ácido oleanólico puedan usarse ampliamente en aplicaciones cosméticas.

Introducción

El envejecimiento cutáneo incluye flacidez, adelgazamiento y arrugas. Puede acelerarse por infección, tabaquismo, luz UV, trauma, desequilibrio hormonal, estrés y/o pro-oxidantes como hidrolasas incluyendo elastasa o colagenasa [1]. Las especies reactivas de oxígeno o radicales libres generados por las causas mencionadas dañan células vecinas y resultan en reducción de la elasticidad cutánea y adelgazamiento [2, 3]. Especialmente, se sabe que la luz UV desencadena la generación de especies reactivas de oxígeno, que dañan lípidos de membrana, proteínas celulares y ADN, y así aceleran el desarrollo de arrugas de expresión, pecas y melasma [1-4]. El ácido oleanólico es un componente efectivo de origen vegetal natural extraído de varias especies de plantas y usado como ingrediente médico y cosmético mayor. También se encuentra en frutas como manzanas o peras [5]. Como un tipo de terpeno pentacíclico hidroxilado, el ácido oleanólico se aisló por primera vez de hojas de olivo (Olea europaea) y se encuentra ampliamente en plantas incluyendo swertia de Asia oriental (Eugenia jambos) y genciana amarilla (Gentiana lutea). Promueve funciones antienvejecimiento mediante la síntesis no solo de pro-colágeno, importante para la síntesis de colágeno, sino también de ceramidas y filagrina, e inhibiendo la actividad de MMP-1, una enzima que degrada proteínas como el colágeno [5, 6]. Sobre la base de estos hallazgos, se puede asumir que el ácido oleanólico tiene un doble efecto antienvejecimiento al no solo promover la producción de colágeno sino también prevenir su degradación [7]. Como resultado, el ácido oleanólico es un ingrediente antienvejecimiento muy prometedor para productos cosméticos. Sin embargo, el uso del ácido oleanólico en productos cosméticos como ingrediente principal está limitado por su pobre solubilidad acuosa; así, solo pequeñas cantidades de ácido oleanólico como parte de una formulación emulsionada se han usado como ingrediente subsidiario en productos cosméticos [8]. Sus propiedades fisicoquímicas relacionadas con la absorción cutánea incluyen su punto de fusión, peso molecular, coeficiente de partición e hidrofilicidad. Su punto de fusión es superior a 300 °C, indicando que es un material altamente cristalino. Los materiales altamente cristalinos requieren mayor energía para la disolución, muestran pobre biodisponibilidad debido a su solubilidad limitada y por lo tanto son mal absorbidos [9]. Además, se sabe que compuestos altamente hidrofílicos o lipofílicos, o compuestos de alto peso molecular no permean fácilmente la piel [10, 11]. El método más frecuente para mejorar la permeación cutánea de tales moléculas es la síntesis de precursores o el uso de portadores coloidales de fármacos. En este sentido, liposomas, emulsiones y micelas poliméricas se han estudiado activamente [12].

Las micelas poliméricas son agregados nano-escalados autoensamblados que forman estructuras núcleo-capa en solución acuosa. Las micelas poliméricas a menudo están hechas de copolímeros di-bloque o tri-bloque que pueden formar un núcleo interno hidrofóbico y una capa externa hidrofílica [13, 14]. Se considera que las micelas poliméricas son más estables físicamente que las micelas de surfactante ya que las propiedades de las micelas poliméricas varían según el tipo y la relación de monómeros poliméricos en un copolímero en bloque y tienen concentraciones micelares críticas relativamente bajas [15, 16].

En este estudio, preparamos micelas poliméricas de ácido oleanólico y evaluamos su tamaño y forma de partícula, y la resultante eficiencia de encapsulación y tasa de permeación cutánea del ácido oleanólico. La estabilidad física del ácido oleanólico en esta forma también se evaluó durante 3 meses. El efecto antiarrugas humano del ácido oleanólico en formulación real de producto cosmético también se investigó.

Materiales y Métodos

Materiales

Ácido oleanólico, Tween 80, Tween 20 y Tween 60 se compraron de TCI (Tokio, Japón). PEG 400, Pluronic F127 y Pluronic F68 se obtuvieron de BASF (Ludwigshafen, Alemania). Propilenglicol, PEG 300 y PEG 200 se obtuvieron de JUNSEI (Tokio, Japón). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 y Capryol™ PGMC se compraron de Gattefossé (Lyon, Francia). EDTA disódico (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corea), alantoína (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.), dipropilenglicol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corea), propanodiol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, EE. UU.), carbómero (The Lubrizol Corporation, Ohio, EE. UU.), PEG/PPG/polibutilenglicol-8/5/3 glicerina (NOF Corporation, Tokio, Japón), hialuronato sódico (TCI, Tokio, Japón), beta-glucano (SK Bioland, Cheonan, Corea), fenoxietanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corea), caprililglicol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Corea) y etilhexilglicerina (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Corea) se usaron para preparar el producto cosmético que contiene ácido oleanólico. Acetonitrilo grado HPLC se obtuvo de Burdick & Jackson (Muskegon, MI, EE. UU.). Se usó agua triple destilada, y otros disolventes y reactivos fueron grado EP y GR. Ratones hembras sin pelo Crlori:SKH1-hr se compraron de OrientBio (Seongnam, Corea).

Análisis HPLC

El ácido oleanólico se analizó usando HPLC Shimadzu serie LC-30 (Shimadzu Corporation, Kioto, Japón). Se usó una columna analítica Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelona, España) a temperatura ambiente. La fase móvil consistió en acetonitrilo y agua (85:15, v/v), la velocidad de flujo fue 1 mL/min y el volumen de inyección 10 μL. El ácido oleanólico se analizó a UV λ = 210 nm. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente [17].

Estudio de solubilidad y optimización de formulación

Una cantidad medida de ácido oleanólico se añadió a un solubilizante, se agitó a 60 °C durante 48 h y se sonificó durante 5 min usando un limpiador ultrasónico. La suspensión se centrifugó a 2000 rpm usando una centrífuga Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Alemania), y luego se recogió el sobrenadante. Luego el sobrenadante se filtró a través de un filtro de membrana PVDF de 0,45 μm (Whatman, Kent, Reino Unido). La solubilidad del ácido oleanólico en el solubilizante correspondiente se estimó restando el peso de los sólidos restantes de la suma de los pesos iniciales del ácido oleanólico y el solubilizante (Tabla 1).

El estudio de optimización de formulación se realizó usando poloxámero 188, poloxámero 407, Tween 60 y Tween 80. Se probaron varias proporciones de polímeros anfifílicos y surfactantes como se resume en la Tabla 2. Cada uno de ácido oleanólico y Capryol® 90 se pesó, calentó y agitó a más de 60 °C hasta observar soluciones claras. Los polímeros/surfactantes mostrados en la Tabla 2 se añadieron luego a la solución clara y se agitaron a más de 60 °C hasta observar soluciones claras. Las soluciones se dispersaron luego en agua destilada (Fig. 1). La solución resultante se dejó por aproximadamente 48 h, y luego se hizo una inspección visual para seleccionar la formulación óptima. Los resultados de las inspecciones visuales de cada formulación en la Tabla 2, incluyendo observaciones de precipitación, separación de fase, transparencia y gelificación, se resumen en la Tabla 3.

Preparación de micelas poliméricas de ácido oleanólico

Las micelas poliméricas de ácido oleanólico (MPO) se prepararon usando las formulaciones G y H en la Tabla 2 usando el método mostrado en la Fig. 1. MPO-G y MPO-H se usaron para experimentos subsiguientes y MPO-H en los productos cosméticos para los ensayos clínicos.

Prueba de tinción

La micelización polimérica cuando la formulación G o H se dispersaba en agua se confirmó por observación visual, es decir, transparencia. La formación de MPO (MPO-G o MPO-H) también se confirmó por una prueba de tinción. Se añadió azul de metileno a las mezclas de agua y Capryol® 90, agua, Capryol® 90, MPO-G y MPO-H y el color de las soluciones se observó visualmente y fotografió.

Medición del tamaño de partícula

La técnica ELS (dispersión de luz electroforética) mide la fluctuación de intensidad de dispersión de las partículas en función del tiempo cuando las partículas exhiben tanto movimiento browniano aleatorio como movimiento electroforético orientado en un campo eléctrico bien definido. La movilidad electroforética de la partícula se mide por la técnica ELS [18] y permitió evaluar el tamaño de partícula de tanto MPO-G como MPO-H usando un espectrofotómetro de dispersión de luz electroforética (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japón).

Análisis de crio-microscopía electrónica de barrido (Cryo-SEM)

La microscopía electrónica de barrido criogénica o crio-microscopía electrónica de barrido (cryo-SEM) es una técnica poderosa para visualizar el estado de la microestructura o nanoestructura de suspensiones o dispersiones de polímeros coloidales después de haber sido inmovilizadas por congelación rápida y fracturadas para imagen. La fractura se hace y examina a −196 °C, el punto de ebullición normal del nitrógeno líquido y muy por debajo de la temperatura de transición vítrea tanto de partículas masivas como totalmente coalescidas. Las imágenes de cryo-SEM revelan una gama de respuestas de las partículas a fracturas que se propagan a través de ellas a través del hielo [19]. Se usó crio-microscopía electrónica de barrido (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) para observar la forma de los MPO.

Eficiencia de encapsulación

La eficiencia de encapsulación de las micelas poliméricas de ácido oleanólico se evaluó. El MPO se centrifugó a 2000 rpm durante 15 min, y el sobrenadante se recogió y analizó por HPLC. La eficiencia de encapsulación se calculó como la cantidad de ácido oleanólico en las micelas poliméricas dividida por la cantidad de ácido oleanólico añadida inicialmente (mg) durante la preparación de MPO.

Estabilidad de MPO-H

La estabilidad física de MPO-H se evaluó almacenándolo a 40 °C durante 3 meses. Cambios de color, separación de fase, presencia de precipitados y cambios de turbidez se evaluaron visualmente. Muestras de MPO-H tomadas en intervalos de tiempo regulares se analizaron por HPLC para determinar las cantidades de ácido oleanólico restantes y por un ELS-Z para determinar el tamaño de partícula de MPO-H. Los resultados se presentan en la Fig. 9.

Prueba de permeación cutánea in vitro

Se realizó un estudio de permeación cutánea in vitro usando una célula de difusión de Franz para investigar la mejora en la permeación cutánea del ácido oleanólico. La prueba se realizó en MPO-G, MPO-H, la mezcla de ácido oleanólico y Tween 80 dispersa en agua destilada, y la mezcla de ácido oleanólico y propilenglicol dispersa en agua destilada. La piel de un ratón hembra sin pelo de 6 semanas se cortó en piezas del tamaño requerido. Se usaron células de Franz verticales, y la piel se fijó entre las dos cámaras con su estrato córneo hacia arriba. 330 μL de la formulación seleccionada se aplicaron sobre la piel y las células de Franz se cubrieron con parafilm. El receptor se llenó con solución PBS (pH 7,4) y etanol en proporción 9:1 (v/v). La solución del receptor se rellenó con solución PBS fresca en cada tiempo de muestreo. Las muestras se retiraron a 2, 4, 6, 8, 10, 20 y 24 h y se analizaron por HPLC. Tras 24 h, el exceso de formulación restante en la piel se retiró con Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australia). La piel usada en el estudio de permeación se limpió con solución PBS y el ácido oleanólico restante en la piel se midió por HPLC. Todos los experimentos de permeación se realizaron en triplicado.

Estadísticas del estudio

Los experimentos se realizaron en tres repeticiones independientes, y los resultados de este estudio se reportaron como media ± DE. El análisis estadístico se verificó por prueba t independiente, y el valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Preparación de ampolla con MPO-H

Para la prueba clínica, MPO-H se usó como producto de prueba. MPO-H, agua purificada, EDTA disódico, alantoína, dipropilenglicol, propanodiol, carbómero y PEG/PPG/polibutilenglicol-8/5/3 glicerina se añadieron y agitaron durante 10-15 min usando un agitador magnético, y luego se añadió hidróxido de potasio y la mezcla se agitóさらに 5-10 min. Una vez que los ingredientes estuvieron homogéneamente mezclados, se añadieron hialuronato sódico y beta-glucano y se agitaron 2-5 min más, y luego se añadieron fenoxietanol, propanodiol, caprililglicol y etilhexilglicerina y se agitaron 2-5 min. La fórmula final se añadió a una ampolla como producto de prueba. Las burbujas de aire de la ampolla se eliminaron usando un horno de vacío antes del uso de prueba. Un control se preparó siguiendo el mismo método para el producto de prueba excepto que se excluyó el ácido oleanólico.

Pruebas de aplicación humana

Estudio de irritación cutánea humana

Una prueba de parche del producto cosmético, que contenía MPO-H en una ampolla, se realizó en 25 sujetos masculinos y femeninos de 22 a 56 años que aceptaron participar en una prueba de irritación cutánea humana. Cada sustancia de prueba se gotearon en el brazo superior y se fijó con un parche. El parche se adherió durante 24 h y el grado de estimulación fue observado por 2 profesionales a 30 min, 24 h y 48 h después de la remoción del parche según los criterios del Grupo Internacional de Investigación de Dermatitis de Contacto (ICDRG).

Ensayo clínico para mejora de arrugas

Las micelas poliméricas que contienen ácido oleanólico en una ampolla como forma de producto final se aplicaron alrededor de los ojos de 23 sujetos femeninos de 30 a 65 años que aceptaron participar en la prueba de mejora de arrugas. Los sujetos cumplieron los criterios de inclusión y ninguno de los criterios de exclusión y aceptaron participar en la prueba de aplicación humana. Se siguió el método doble ciego por tanto investigadores como sujetos de prueba. La prueba se realizó durante 8 semanas, y la evaluación se realizó cada 4 semanas. Se usaron el método doble ciego y asignación aleatoria. El producto de prueba y el control se aplicaron aleatoriamente por separado al lado izquierdo o derecho de la cara del mismo sujeto. Cinco parámetros se evaluaron por profilometría óptica usando Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Colonia, Alemania) cada 4 semanas durante 8 semanas—rugosidad promedio (R3) fue el endpoint primario, y los cuatro parámetros de rugosidad cutánea (R1), rugosidad máxima (R2), profundidad de suavidad (R4) y rugosidad promedio aritmética (R5) fueron los endpoints secundarios. Los aumentos o disminuciones de los cinco parámetros en la misma área del sujeto se midieron a lo largo del tiempo, y los valores promedio de aumento o disminución de los cinco parámetros se calcularon y compararon entre tratamientos de control y producto de prueba. Además, se hizo una observación visual de la piel por profesionales. Se tomaron fotografías de arrugas oculares usando Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Corea). Los criterios usados para determinar las puntuaciones de evaluación visual se muestran en la Fig. S1, y los resultados visuales se presentan en la Fig. 13. Los parámetros se compararon y analizaron usando una prueba t de muestras pareadas con una fiabilidad del 95 % [20-25].

Resultados y Discusión

Determinación de solubilizante, surfactante y polímero

La solubilidad del ácido oleanólico en solubilizantes biocompatibles, específicamente surfactantes y polímeros, se muestra en la Tabla 1. El ácido oleanólico tiende a ser soluble en aceites hidrofóbicos con bajo balance hidrofilia-lipofilia (HLB). Capryol® 90 tiene un valor HLB ligeramente superior comparado con aceites generales [26]. Sin embargo, el ácido oleanólico muestra solubilidad relativamente alta en Capryol® 90. Además, Capryol® 90 puede estabilizarse fácilmente como núcleo interno de micelas [27]. Tras seleccionar Capryol® 90, se cribaron varios tipos de surfactantes o poloxámeros para la parte de capa de las micelas de ácido oleanólico [27-30]. Las composiciones de micelas de ácido oleanólico mostradas en la Tabla 2 son las que fueron transparentes inmediatamente después de diluirse con agua destilada. Sin embargo, algunas composiciones fueron inestables y sufrieron precipitación, separación de fase o gelificación dentro de 24 h. Imágenes representativas de estados de precipitación, separación de fase, líquido transparente y gel se muestran en la Fig. 2. El estado final de cada fórmula se resume en la Tabla 3. Las composiciones G y H permanecieron transparentes incluso después de 24 h. Aunque la composición I permaneció clara, era un gel en lugar de un líquido. Las composiciones A a D se volvieron opacas con precipitación después de 24 h. Dados estos resultados, las composiciones G y H se seleccionaron para desarrollo adicional.

Características de las micelas poliméricas de ácido oleanólico

Las estructuras de las micelas poliméricas de ácido oleanólico se investigaron por prueba de tinción. La Fig. 3 muestra las imágenes de la mezcla de Capryol® 90 y agua destilada, Capryol® 90, agua destilada, y las micelas poliméricas de composición G (MPO-G) y de composición H (MPO-H), después de añadir azul de metileno a la solución. Se produjo una clara separación de fase para la mezcla de Capryol® 90 y agua destilada. Se observó precipitación de azul de metileno en el caso de Capryol® 90. El agua destilada se volvió azul oscuro tras la adición de azul de metileno. MPO-G y MPO-H también se volvieron azules indicando que las micelas poliméricas consistían en un núcleo interno de fase oleosa y una capa externa de fase acuosa. En otras palabras, un polímero anfifílico, poloxámero 407 en las composiciones G y H, sirve como capa externa y ayuda a formar exitosamente micelas poliméricas de ácido oleanólico encapsulando el núcleo interno de Capryol® 90 que contiene ácido oleanólico [31].

El tamaño de partícula, distribución de tamaño y forma pueden ser buenos indicadores para predecir la estabilidad física de formulaciones de micelas. El tamaño de partícula promedio de MPO-G fue 80,4 nm, y el de MPO-H fue 57 nm (Fig. 4). Los histogramas de MPO-A, G y H se muestran en la Fig. 5 para comparar las distribuciones de tamaño afectadas por el estado de fase. Como se muestra en la Tabla 3, MPO-A es opaco debido a precipitación, y MPO-G y H son transparentes. El tamaño de partícula de MPO-A es más de 100 nm, y MPO-A muestra una distribución de tamaño más ancha que MPO-G y H (Fig. 5). MPO-H muestra una distribución de tamaño de partícula más estrecha que MPO-G y exhibe una fluidez adecuada para productos cosméticos.

La eficiencia de encapsulación para tanto MPO-G como MPO-H fue 99 a 100 %, indicando que casi el 100 % del ácido oleanólico fue encapsulado en el núcleo interno de MPO (Fig. 6).

La forma de MPO-G y MPO-H se investigó por crio-microscopía electrónica de barrido (Cryo-SEM). Cryo-SEM mostró que tanto MPO-G como MPO-H eran micelas poliméricas de forma esférica. Sin embargo, las micelas poliméricas MPO-H fueron más consistentes en tamaño y forma que las micelas poliméricas MPO-G (Fig. 7).

Estudio de permeación cutánea in vitro de MPO

La cantidad total de ácido oleanólico restante en la piel, y la cantidad total de ácido oleanólico permeado a través de la piel en función del tiempo se midieron usando la piel de un ratón hembra sin pelo de 6 semanas. Cuatro formulaciones diferentes, MPO-G, MPO-H, la mezcla de ácido oleanólico y Tween 80 dispersa en agua destilada (OTw), y la mezcla de ácido oleanólico y propilenglicol dispersa en agua destilada (OPG) se compararon en términos de eficiencia de permeación cutánea del ácido oleanólico. Las cantidades totales de ácido oleanólico permeado a través de la piel después de 24 h fueron 29,49 ± 4,00 % para MPO-H, 21,39 ± 5,91 % para MPO-G, 13,66 ± 0,81 % para OTw, y 5,90 ± 2,47 % para OPG. Como se muestra en la Fig. 8, la primera detección de ácido oleanólico en el caso de tanto MPO-G como MPO-H fue posible a 8 h, mientras que la primera detección de ácido oleanólico en OTw fue posible a 10 h, y OPG a 20 h. Las proporciones de ácido oleanólico dejado en la piel fueron 56,22 ± 13,50 % para MPO-H, 36,74 ± 0,72 % para MPO-G, 27,44 ± 7,02 % para OTw, y 26,28 ± 5,42 % para OPG. MPO-H mostró la mayor cantidad tanto de ácido oleanólico permeado a través de la piel como de ácido oleanólico restante en la piel (Fig. 8). Estos resultados indican que los MPO pueden permear más rápido y más que formulaciones que no forman micelas.

Estabilidad de micelas poliméricas líquidas de ácido oleanólico

Sobre la base de la caracterización y estudios de permeación in vitro, MPO-H fue finalmente seleccionado para la preparación de ampolla. Antes de la preparación de ampolla, se evaluó la estabilidad de ONM-H. Para el estudio de estabilidad, MPO-H se almacenó en viales bajo condiciones de estudio de estabilidad acelerada a 40 °C/75 % HR durante 3 meses. Precipitación, separación de fase, cambios de color y transparencia se evaluaron visualmente. La proporción de ácido oleanólico se midió luego usando HPLC, y los cambios en el tamaño de partícula también se verificaron. La estabilidad se verificó a lo largo del tiempo. MPO-H permaneció transparente sin precipitación o separación de fase, y su color no cambió durante 3 meses bajo las condiciones de estabilidad acelerada. La proporción de ácido oleanólico medida por HPLC y los cambios en el tamaño de partícula a lo largo del tiempo se muestran en la Fig. 9. La proporción de ácido oleanólico permaneció sobre 98 %, y el tamaño de partícula de 49,6 ± 5 nm permaneció casi constante durante el período de 3 meses del estudio de estabilidad. Estos resultados muestran que MPO-H es físicamente y químicamente estable durante 3 meses bajo las condiciones de estabilidad acelerada.

Ensayo clínico

Prueba de irritación humana

Antes del ensayo clínico, se realizó una prueba de irritación humana en 25 voluntarios sanos hombres y mujeres de 22-56 años. El producto de prueba se aplicó con parche en el brazo superior de los sujetos durante 24 h, y el índice de irritación cutánea se midió a 30 min, 24 h y 48 h después de la remoción del parche. No se observó irritación con la fórmula cosmética de ampolla que contenía MPO-H a 1 h o 48 h después de la remoción del parche.

Ensayo clínico

El ensayo clínico se realizó en 23 sujetos femeninos, de 30-65 años con arrugas alrededor de los ojos; excluyendo los 3 abandonos, 20 sujetos completaron el ensayo aplicando por separado tanto el producto de prueba, la ampolla MPO-H, como el control a cualquiera de los lados izquierdo o derecho de su cara durante 8 semanas. Los cambios cutáneos se evaluaron según cinco parámetros—rugosidad promedio (R3) como endpoint primario, y cuatro parámetros adicionales como endpoints secundarios, a saber, rugosidad cutánea (R1), rugosidad máxima (R2), profundidad de suavidad (R4) y rugosidad promedio aritmética (R5). La puntuación de evaluación visual añadió un endpoint secundario adicional. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

El endpoint primario R3 había disminuido un 0,673 % tras 4 semanas de uso del producto de prueba y disminuyó significativamente un 7,835 % tras 8 semanas de uso (p = 0,006). Con la aplicación del control, R3 había aumentado un 5,127 % tras 4 semanas de uso y aumentó significativamente un 9,971 % tras 8 semanas de uso (p = 0,010). La diferencia en el valor R3 entre las áreas tratadas por el producto de prueba y las tratadas por el control fue estadísticamente significativa tras 8 semanas de uso (p = 0,000) pero no estadísticamente significativa tras 4 semanas de uso, quizás debido a la variación inter-sujeto (Fig. 10).

El análisis del endpoint secundario R1 mostró que el valor había disminuido un 4,629 % tras 4 semanas de uso del producto de prueba y disminuyó significativamente un 9,973 % tras 8 semanas de uso (p = 0,017). Con la aplicación del control, R1 había aumentado un 8,037 % tras 4 semanas de uso y un 4,799 % tras 8 semanas de uso. La diferencia en los valores R1 entre las áreas usando el producto de prueba y el control no fue estadísticamente significativa tras 4 semanas de uso pero sí lo fue tras 8 semanas de uso (p = 0,024). El endpoint secundario R2 había disminuido un 1,048 % tras 4 semanas de uso del producto de prueba y un 5,803 % tras 8 semanas. Con la aplicación del control, había aumentado un 7,261 % tras 4 semanas y un 9,536 % tras 8 semanas. La diferencia en el valor R2 entre las áreas tratadas por el producto de prueba y las tratadas por el control fue estadísticamente significativa tras 8 semanas de uso (p = 0,016) pero no tras 4 semanas de uso. El endpoint secundario R4 había disminuido significativamente un 8,594 % (p = 0,039) tras 4 semanas de uso del producto de prueba y un 9,747 % tras 8 semanas de uso. Con el control, R4 había aumentado un 10,764 % tras 4 semanas de uso y un 3,491 % tras 8 semanas de uso. Curiosamente, la diferencia en el valor R4 entre las áreas usando el producto de prueba y el control fue estadísticamente significativa tras 4 semanas de uso (p = 0,008) pero no tras 8 semanas. El endpoint secundario R5 había disminuido un 6,333 % tras 4 semanas de uso del producto de prueba y un 8,556 % tras 8 semanas de uso. La diferencia en el valor R5 entre las áreas de uso del producto de prueba y el control no fue estadísticamente significativa ni tras 4 semanas ni tras 8 semanas de uso.

El análisis del endpoint secundario adicional, la evaluación visual de arrugas, mostró que la puntuación de evaluación visual había disminuido un 2,917 % tras 4 semanas de uso del producto de prueba y disminuyó significativamente un 8,333 % tras 8 semanas de uso (p = 0,034). Con la aplicación del control, la puntuación de evaluación visual había aumentado un 1,667 % tras 4 semanas y un 4,167 % tras 8 semanas. La diferencia de la puntuación de evaluación visual entre las áreas tratadas por el producto de prueba y por el control fue estadísticamente significativa tras 8 semanas de uso (p = 0,046) pero no tras 4.

En resumen, el análisis del área arrugada alrededor de los ojos mostró que la diferencia en el valor del endpoint primario R3 entre las áreas tratadas por el producto de prueba y por el control fue estadísticamente significativa tras 8 semanas de uso. En términos de los endpoints secundarios, todos los valores habían disminuido tras el uso del producto de prueba y aumentado tras el uso del control. La diferencia en los valores R4 entre las áreas tratadas por el producto de prueba y las tratadas por el control fue estadísticamente significativa tras 4 semanas de uso, pero la diferencia de los valores R1 y R2 fueron estadísticamente significativas solo tras 8 semanas de uso (Fig. 11). La puntuación de evaluación visual por profesionales mostró que todas las puntuaciones promedio de evaluación visual para arrugas habían disminuido tras 4 semanas y 8 semanas de tratamiento con el producto de prueba comparado con el control (Tabla 5). La diferencia en la puntuación de evaluación visual entre las áreas tratadas por el producto de prueba y por el control fue estadísticamente significativa tras 8 semanas de uso (Fig. 12). En general, según todos los endpoints, la fórmula cosmética que contenía MPO-H como ingrediente principal se encontró que ayuda a mejorar las arrugas tras 8 semanas de uso (Fig. 13).

Conclusiones

Los surfactantes son excipientes comúnmente usados en productos cosméticos para mejorar la solubilidad de materiales poco solubles. Una advertencia sería la cantidad incluida en el producto. Los surfactantes deben añadirse en cantidad suficiente para disolver materiales poco solubles sin precipitación. Solo una cantidad mínima debe añadirse por razones de seguridad. La formulación de micelas podría ser la solución a este problema. Las micelas poliméricas de ácido oleanólico desarrolladas en este estudio mejoran la solubilidad del ácido oleanólico con una cantidad mínima de surfactantes y mejoran la permeación del ácido oleanólico a través de la piel. Se desarrollaron micelas poliméricas estables de ácido oleanólico usando Capryol 90 y poloxámero. Las micelas poliméricas de ácido oleanólico desarrolladas en este estudio fueron estables, es decir, no mostraron ninguna precipitación, separación de fase o degradación a 40 °C tras 3 meses. El ensayo clínico mostró que, como ingrediente activo principal, el ácido oleanólico en la formulación de micelas poliméricas es efectivo para aliviar arrugas humanas. Basado en estos hallazgos, se puede concluir que el ácido oleanólico, que es poco soluble en agua y por lo tanto inutilizable en su forma nativa como ingrediente principal para aliviar arrugas cutáneas, puede formularse en micelas poliméricas aplicables. Además, se espera que las micelas poliméricas de ácido oleanólico desarrolladas en este estudio resulten muy útiles para aliviar arrugas humanas y resulten ampliamente aplicables a aplicaciones cosméticas.