Preparación y estudio farmacocinético de liposomas daidzein de circulación larga

Cromatogramas típicos de liposomas en blanco ( a ), sustancia de referencia daidzeína ( b ) y muestra DLCL ( c )

Examen de prescripción mediante prueba ortogonal

Tomando el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE) como índices de evaluación, se realizó el diseño ortogonal de cuatro factores y tres niveles para optimizar la mejor coincidencia de la relación molar de SPC a colesterol (A), la relación de masa del fármaco (daidzeína) a lípidos totales (SPC y colesterol) (p / p) (B), temperatura de hidratación (C) y tiempo ultrasónico (D) en la condición de 5% de contenido de DSPE-mPEG2000 [21, 22].

Diámetro y morfología de DLCL

El tamaño de partícula y el potencial zeta de la solución de DLCL preparada se midieron mediante un analizador de tamaño de partícula láser (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, Reino Unido) a temperatura ambiente, 230 V y 50 HZ. La solución de DLCL preparada se diluyó 10 veces con agua pura y luego se recogió del borde de la malla de cobre con unas pinzas. Después de secar a temperatura ambiente y teñir con una solución acuosa de ácido fosfotúngstico (2%, p / v), se observó la morfología de la DLCL completamente seca utilizando un microscopio electrónico de transmisión de emisión de campo (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Tokio, Japón) a una aceleración de 200 kV y transmisor LaB6.

EE y carga de fármacos de DLCL

El EE y la carga de fármaco de la DLCL preparada se analizaron mediante el método de diálisis que se indica a continuación:(1) Se agregaron 500 μL de la solución de DLCL preparada a una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 8000-14,000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), luego ató los dos extremos de la bolsa de diálisis firmemente y colocó la bolsa de diálisis en 20 ml de agua (medio de diálisis). Después de vibrar con agitador durante 12 h, se tomó 1 mL del medio de diálisis y se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min para determinar la concentración de fármaco libre ( C ₁ ) en el sobrenadante. (2) Se mezclaron quinientos microlitros de la solución de DLCL preparada y 2000 μL de metanol mediante agitación con vórtex durante 15 min para destruir los liposomas y luego se centrifugaron a 12000 rpm durante 10 min para determinar la concentración total del fármaco ( C ₀ ) en el sobrenadante. (3) Diez mililitros de la solución de DLCL preparada ( V ₀ ) se liofilizó para pesar la masa de polvo sólido ( W ₀ ). (4) El EE y la carga de fármaco se calcularon de acuerdo con la fórmula que se indica a continuación:

Liberación de fármacos in vitro

La liberación in vitro de DLCL y daidzeína libre se determinó mediante el método de diálisis. El fluido gástrico simulado era HCl 0,1 mol / L (pH 1,2) que contenía Tween-80 al 0,5%, y el fluido intestinal simulado era tampón PBS 25 mM (pH 6,9) que contenía Tween-80 al 0,5%. Se agregaron 0,5 ml de la solución de DLCL preparada a una bolsa de diálisis con una intercepción de peso molecular de 8000 a 14 000 y se colocaron en 20 ml de los dos medios de liberación, respectivamente. Los medios de prueba de liberación se agitaron (100 rpm) continuamente a 37ºC. En los momentos indicados (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 y 144 h), alícuotas de la muestra (1 mL ) se tomaron del dializado y luego se suplementaron con la misma cantidad de medio de liberación reciente. Se usó un miligramo por mililitro de daidzeína (disuelto en DMSO) como control y se colocó respectivamente en los dos medios de liberación anteriores para el mismo tratamiento. La daidzeína se midió en cada punto de tiempo y la tasa de liberación acumulada se calculó de acuerdo con la fórmula:

En la fórmula, V ₁ fue la cantidad de muestreo en cada momento, V ₂ fue el volumen del medio de diálisis, C ₁ ~ C _i fue la concentración de daidzeína medida en cada punto de tiempo, y V ₀ y C ₀ fueron el volumen y la concentración de DLCL añadidos a la bolsa de diálisis.

Farmacocinética de DLCL en ratas

Diez ratas macho Sprague-Dawley se dividieron al azar en dos grupos ( n =5). Un grupo era el grupo daidzeína (suspendido en carboximetilcelulosa sódica al 0,5%) y el otro grupo era el grupo DLCL (disuelto en agua). Las dosis de daidzeína en los dos grupos fueron de 30 mg / kg. Antes de la administración oral, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y quedaron libres para beber agua. Después de la administración intragástrica de las ratas, se extrajeron 0,5 ml de sangre del grupo de daidzeína del plexo venoso del fondo de ojo de cada rata a los 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h , 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h y 36 h, respectivamente. Mientras tanto, al grupo de DLCL se le extrajeron 0,5 ml de sangre de cada rata de la misma manera a 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h, 3 h , 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h y 36 h, respectivamente. La muestra de sangre se colocó en un tubo de centrífuga heparinizado y se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min, y se llevó el plasma para almacenar a -80 ° C. El contenido de daidzeína en la muestra de plasma se determinó mediante el método LC-MS / MS establecido para obtener su curva fármaco-tiempo en las ratas analizadas. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon con un modelo sin compartimentos mediante el software DAS3.0 (miembro profesional de la Sociedad China de Farmacología, Shanghai, China).

Determinación de daidazeína en plasma de rata por LC-MS / MS

Las muestras de plasma de rata se pretrataron de la siguiente manera:plasma de rata (50 μL), metanol (10 μL), estándar interno (IS) apigenina disuelta en metanol (10 μL, 500 ng / mL) y solución acuosa de ácido fórmico al 5% (100 μL ) se mezclaron en un tubo de ensayo limpio de 1,5 ml. Después de un breve mezclado en vórtice, se añadieron a la mezcla 1,2 ml de acetato de etilo. Después de agitar a temperatura ambiente durante 5 min, la mezcla se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min. La fase orgánica superior resultante (1 mL) se transfirió a otro tubo de ensayo limpio de 1,5 mL, se evaporó y se volvió a disolver en la fase móvil (100 μL). El sobrenadante obtenido por centrifugación a 12.000 rpm durante 10 min se recogió para análisis LC-MS / MS. Las condiciones cuantitativas de las muestras de plasma de rata se describen a continuación:GL Inertsustain C18 (100 mm × 2,1 mm, 3 μm) se conectó a una columna de protección de soporte de columna Shim-pack (5,0 mm × 2,0 mm, 1,6 μm) a una temperatura de columna de 40 ° C; el gradiente de elución con un caudal de 0,2 mL / min se realizó utilizando la fase móvil que consistió en agua (A) -metanol (B) en las condiciones de 50% B a 80% B (0-2,00 min), 80% B (2,00–4,00 min), 80% B a 50% B (4,00–6,00 min) y 50% B (6,10–8,00 min). El volumen de inyección fue de 10 µl. El modo de monitorización de reacciones múltiples de iones negativos (MRM) se utilizó para detectar los pares de iones de daidzeína ( m / z 253.0 → 224.15) e IS ( m / z 269,00 → 117,05). Las otras condiciones se establecieron de la siguiente manera:fuente de iones ESI, temperatura del bloque de calentamiento 400 ° C, temperatura de calentamiento del tubo DL 250 ° C, gas de atomización ( N ₂ ) caudal volumétrico 3,0 L / min, gas de secado ( N ₂ ) flujo volumétrico 15,0 L / min y voltaje de pulverización iónica - 4,5 V. Los tiempos de retención de daidzeína y patrón interno (apigenina) fueron de 4,5 min y 5,4 min, respectivamente, y las sustancias endógenas en plasma no interfirieron con la determinación de daidzeína y estándar interno (Fig. 2). La metodología cuantitativa se investigó estrictamente y cumplió con los requisitos del análisis cuantitativo de muestras biológicas (Tabla 2).

HPLC de plasma en blanco ( a ), daidzeína + apigenina (patrones internos) + plasma en blanco ( b ) y muestra de plasma ( c ). 1, daidzeína; 2, apigenina (IS)

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de la prueba de Tukey. Los valores se consideraron estadísticamente significativos en p <0.05.

Resultados y discusión

Efecto de los procesos de preparación sobre las características de los nanoliposomas

El diseño de la prueba ortogonal y los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 3, y los resultados del análisis de varianza se muestran en la Tabla 4. El análisis intuitivo (Tabla 3) mostró que el orden de influencia de cuatro factores en el tamaño de partícula era la relación fármaco-lípido> SPC- relación de colesterol> temperatura de hidratación> tiempo de ultrasonidos, que tuvo poco efecto sobre la eficiencia de encapsulación. El análisis de varianza (Tabla 4) mostró la relación fármaco-lípido; La relación SPC-colesterol tiene un efecto significativo sobre el tamaño de las partículas. Las condiciones óptimas de preparación para DLCL fueron A ₁ B ₁ C ₂ D ₁ , la proporción de SPC a colesterol fue de 55:40, la proporción de fármaco a lípido fue de 1:10, la temperatura de hidratación fue de 50 ° C y el tiempo de ultrasonidos fue de 24 min.

Se prepararon tres lotes de DLCL en paralelo de acuerdo con el proceso optimizado anteriormente. El EE fue de 85,3 ± 3,6% y la carga de fármaco fue de 8,2 ± 1,4%. El tamaño de partícula promedio fue de 156,1 ± 3,0 nm con el PDI de 0,294 ± 0,012 y el potencial zeta de -49 ± 0,6 mV. La distribución del tamaño de partícula de DLCL se mostró en la Fig. 3, que indicó que en las condiciones optimizadas del proceso de preparación, el DLCL preparado tenía una distribución de tamaño de partícula estrecha y uniforme. La forma y estructura de las partículas de DLCL observadas por TEM era redonda o elíptica, y el tamaño era básicamente uniforme (Fig. 4).

Distribución del tamaño de partículas de DLCL

Fotografía TEM de DLCL

La daidzeína es un fármaco típico con escasas propiedades hidrófilas y lipófilas. La combinación direccional del fármaco con el extremo polar del fosfolípido puede hacer que ambos se encuentren en un estado muy disperso. Se inhiben las características cristalinas del fármaco y se aumenta la solubilidad en lípidos [11]. Se informó que en la interacción entre la daidzeína y la bicapa lipídica, aproximadamente el 15% de la daidzeína se encuentra en la región hidrófila de la membrana del liposoma [23, 24] y el resto se distribuye en la interfaz agua / membrana [25]. Según los resultados de TEM, la estructura doble de DLCL era obvia y la inserción de daidzeína no afectó la estructura doble de los lípidos.

Efecto de los procesos de preparación en la liberación de fármacos in vitro

Los resultados de los experimentos de liberación in vitro se muestran en la Fig. 5. En el medio de liberación del fluido gástrico simulado (0.1 mol / L de HCL que contiene 0.5% de Tween-80), la tasa de liberación acumulada de daidzeína fue de aproximadamente 85% en 1 h. y liberación completa a las 12 h; La DLCL liberó el 18% a 1 h, el 60% a las 12 hy el 100% a las 48 h. En el medio de liberación de líquido intestinal simulado (tampón PBS 25 mM que contiene 0,5% de Tween-80, pH 6,9), la tasa de liberación acumulada de daidzeína fue de aproximadamente 73% a 1 h, 84% a 12 h, y liberación completa a 24 h; La DLCL liberó un 3% a 1 h, un 59% a las 12 hy un 100% a las 48 h.

Liberación in vitro de DLCL y daidzeína libre en solución de clorhidrato (pH 1,2) que contiene Tween 80 al 0,5% ( a ) y tampón de fosfato (pH 6,9) que contiene 0,5% de Tween 80 ( b ) (media ± DE, n =3)

Los resultados del experimento de liberación in vitro mostraron que la DLCL fue de liberación significativamente lenta en medios de diálisis con pH 1,2 y pH 6,9, y la velocidad de liberación en medios de diálisis con pH 1,2 fue más rápida que en medios de diálisis con pH 6,9. Esto puede deberse al hecho de que las estructuras de la bicapa lipídica son vulnerables en condiciones ácidas y tienen poca estabilidad.

Efecto de los procesos de preparación en la farmacocinética in vivo

Las curvas de concentración plasmática media-tiempo de daidzeína después de la administración oral de una dosis única de daidzeína y DLCL se muestran en la Fig.6, y los principales parámetros farmacocinéticos no compartimentales de daidzeína en ambos grupos se muestran en la Tabla 5. Los resultados mostraron que bajo la isodosis daidazeína (30 mg / kg) en ambos grupos, la concentración plasmática de daidzeína en el grupo DLCL fue siempre más alta que en el grupo daidzeína. El AUC _{0− t} (el área bajo la curva de concentración plasmática del fármaco-tiempo, que representa la absorción total después de una sola dosis y refleja el grado de absorción del fármaco) de daidzeína en el grupo de DLCL fue 1515,52 ± 532,40 μg / L * h, que fue 2,5 veces mayor que la de el grupo daidzeína ( p <0,05). Además, el MRT _{0− t} (tiempo medio de residencia, que es el tiempo necesario para la eliminación del 63,2% del fármaco en el organismo) y t _1/2 (la vida media de eliminación, que es el tiempo necesario para reducir a la mitad la concentración plasmática del fármaco de la fase terminal) de daidzeína en el grupo de DLCL se prolongó 1,6 veces y 1,8 veces la del grupo de daidzeína, respectivamente ( p <0,05). Los resultados farmacocinéticos indicaron que la DLCL no solo podría reducir el efecto de primer paso de la daidzeína para promover su absorción oral, sino también prolongar su tiempo medio de residencia para lograr el efecto de liberación lenta.

Curvas de concentración plasmática media-tiempo de DLCL y daidzeína libre después de la administración oral de una dosis única de daidzeína (30 mg / kg) (media ± DE, n =5)

Conclusiones

Se ha informado que los portadores de nano-lípidos, incluido el sistema de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS), las nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) y los portadores de lípidos nanoestructurados (NLC), pueden mejorar eficazmente la solubilidad, permeabilidad, estabilidad gastrointestinal y biodisponibilidad oral de fármacos. SEDDS está compuesto de aceite isotrópico anhidro, emulsionante, emulsionante auxiliar, solubilizante y fármaco. Mediante la emulsificación de lípidos en el tracto gastrointestinal, puede aumentar la absorción del área de superficie y la permeabilidad de los fármacos y promover que los fármacos entren en la circulación sistémica. Sin embargo, SEDDS tiene una carga de fármaco baja y es propenso a la cristalización del fármaco y la precipitación in vivo, y la correlación entre los resultados in vitro e in vivo es pobre [26, 27]. El SLN se compone de fármaco, lípido y tensioactivo. Con características de estructura de partículas únicas y ventajas de liberación controlable, SLN puede mejorar significativamente la focalización y promover la captación de células cancerosas cuando se usa para encapsular medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, el GC no es adecuado para encapsular fármacos hidrófilos y fármacos con carga catiónica [28]. NLC es la segunda generación de nanopartículas lipídicas formadas por una mezcla de lípidos líquidos y sólidos, con mayor estabilidad que SLN. Puede encapsular de forma eficaz moléculas hidrófobas y prolongar el tiempo de residencia de los fármacos en el organismo, pero su coste de preparación es elevado [29].

Con el fin de mejorar la escasa biodisponibilidad oral de la daidzeína, los estudios recientes se centraron en su novedoso sistema de administración de fármacos, como los nanoportadores de lípidos cargados con complejo de daidzeína-fosfolípidos con 91,7 ± 1,5% de EE y 6,87 veces más AUC [11], daidzeína -sistema de nanoentrega autoensamblado con 85,9 ± 2,7% de EE nueve veces mayor de AUC [12], y nanopartículas de daidzeína-PLGA con 81,9% de EE y 5,57 veces de aumento de AUC [13].

En el presente trabajo, el EE y la carga de fármaco de DLCL preparado en condiciones optimizadas fueron 85,3 ± 3,6% y 8,2 ± 1,4%, respectivamente. Los tiempos de liberación completa in vitro de DLCL en el medio de pH 1,2 y pH 6,9 aumentaron en cuatro y dos veces los de los fármacos libres, respectivamente. Después de que a las ratas se les administró por vía oral una dosis única de daidzeína (30 mg / kg) y DLCL (que contenía una dosis igual de daidzeína), el t _1/2 , MRT _{0− t} y AUC _{0– t} de daidzeína en el grupo DLCL aumentó en 1.8, 1.6 y 2.5 veces en comparación con los del grupo daidzeína, lo que indicó que DLCL promovió la absorción oral y prolongó el tiempo medio de residencia de daidzeína en ratas.

Disponibilidad de datos y materiales

Los autores declaran que los materiales, los datos y los protocolos asociados están disponibles de inmediato para los lectores sin calificaciones indebidas en los acuerdos de transferencia de material. Todos los datos generados y analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

Abreviaturas

AUC:

Área bajo la curva de concentración de tiempo;

C _máx :

Concentración máxima

Tubo DL:

Tubo de disolvente

DLCL:

Liposomas Daidzein de circulación prolongada

DSPE-mPEG2000:

Distearoil fosfoetanolamina-PEG2000

EE:

Eficiencia de encapsulación

ESI:

Ionización por electropulverización

HPLC:

Cromatografía líquida de alta resolución

IS:

Estándar interno

LC-MS / MS:

Espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida

m / z :

Relación masa-carga

MPS:

Sistema de fagocitos mononucleares

MRM:

Modo de monitoreo de reacciones múltiples

MRT:

Tiempo medio de residencia

MS:

Espectrogtafia de masas

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

PDI:

Índice de polidispersidad

PEG:

Polietilenglicol

RSD:

Derivación estándar relativa;

SD:

Desviación estándar

SEM:

Error estándar de la media

SPC:

Fosfatidilcolina

t _1/2 :

Vida media de eliminación

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

T _máx :

El momento de la concentración máxima

Transición de intervalo de banda indirecta-directa-indirecta controlada por campo eléctrico en monocapa InSe El óxido de grafeno en un compuesto con nanopartículas de plata reduce la citotoxicidad de fibroblastos y células endoteliales de una nanoplataforma antibacteriana