Nanomicelas de oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico cargadas con emodina: diseño, caracterización y actividad antitumoral

Resumen

El propósito de este estudio fue preparar y caracterizar emodina cargada en oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico (CSO-SA/EMO) y evaluar su actividad antitumoral in vitro. En este estudio, oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico se usó como portador y sus propiedades fisicoquímicas se determinaron por diferentes métodos. El comportamiento de captación celular se examinó usando oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico etiquetado con FITC. CSO-SA/EMO se preparó usando ultrasonicación y diálisis. Tamaño de partícula, potencial superficial, eficiencia de encapsulación y comportamiento de liberación de fármaco se estudiaron in vitro. Los efectos de CSO-SA/EMO en células de cáncer gástrico se investigaron usando ensayo MTT y citometría de flujo. Resultados mostraron que el tamaño de partícula de CSO-SA/EMO fue mayor y el potencial menor que el de oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico. La captación micelar a 12 h por células MGC803 y BGC823 fue suficiente, y las micelas pudieron acumularse abundantemente en sitios de lesión en ratones logrando buena orientación pasiva EPR. Ensayos MTT y arresto de ciclo celular mostraron que CSO-SA/EMO mejoró significativamente la actividad antitumoral hacia células MGC803 y BGC823 comparado con emodina libre. Volumen tumoral, tinción hematoxilina-eosina y ensayo de etiquetado de extremo de desoxinucleótido terminal mediado por transferasa dUTP nick-end demostraron que CSO-SA/EMO tuvo efecto antitumoral significativo en tejidos tumorales in vivo. En conclusión, el método ultrasonicación-diálisis proporcionó un método simple y efectivo para preparar CSO-SA/EMO. La administración de emodina usando un sistema micelar mejoró sus efectos antitumorales efectivamente.

Introducción

La emodina (EMO) es un derivado antraquinona natural extraído principalmente de hierbas medicinales chinas tradicionales como ruibarbo, cuspidatum y multiflorum. La medicina tradicional china (MTC) se usa ampliamente en investigación clínica por su baja toxicidad, pocos efectos secundarios y bajo costo.

Estudios han mostrado que EMO tiene amplia actividad farmacológica, incluyendo inmunosupresión, antitusígeno, antihipertensivo, antiinflamatorio, antibacteriano y anticancerígeno. Se ha encontrado que EMO inhibe el crecimiento de células cancerosas y regula genes relacionados para controlar apoptosis de células tumorales, tumorigénesis, proliferación celular, invasión y metástasis. Estudios han mostrado que EMO puede inhibir diversas células cancerosas, como adenocarcinoma colorrectal humano, hepatocarcinoma, leucemia linfoide y cáncer de lengua humano SCC-4. EMO puede inhibir proliferación de células tumorales en cánceres gástrico, mamario y prostático. Sin embargo, EMO no exhibe efectos citotóxicos en células normales como fibroblastos gingivales humanos normales, células epiteliales bronquiales humanas y células mamarias humanas. Esto muestra que EMO exhibe citotoxicidad selectiva hacia células tumorales comparado con células normales.

El quitosano, un polisacárido natural, es la forma desacetilada de quitina. Este polímero natural tiene excelente solubilidad en agua, biofuncionalidad, compatibilidad sanguínea y características de degradabilidad microbiana, conocido por sus diversas aplicaciones biomédicas. Degradamos quitosano de alto peso molecular (450 kDa) usando quitosanasa bajo condiciones ácidas para obtener oligosacárido de quitosano de bajo peso molecular (CSO, 18 kDa). CSO puede penetrar fuertemente membranas celulares y ácido esteárico (SA) puede entrar al núcleo a través de vía glicoproteína. CSO se modificó hidrofóbicamente con SA usando carbodiimida (EDC) como reactivo de acoplamiento para sintetizar oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico anfipático (CSO-SA).

Aunque EMO tiene extensa actividad biológica, su estructura antraquinona es pobremente soluble en agua. Como los fármacos terapéuticos se transportan a través del torrente sanguíneo, su solubilidad afecta directamente su absorción y distribución. Los injertos CSO-SA pueden autoensamblarse en solución acuosa para formar nanomicelas hidrofóbicas por dentro e hidrofílicas por fuera. Dispersamos las nanomicelas del estado agregado usando sonda de ultrasonido. Como tanto EMO como CSO eran hidrofóbicos, EMO se encapsuló en el centro de las micelas.

Varios fármacos modelo se aplican a CSO-SA, lo que requiere peso molecular, estructura e hidrofobicidad de fármacos modelo. Estudios existentes incluyen curcumina, doxorrubicina, estearato de lamivudina y oxaliplatino que pueden mejorar efectos antitumorales significativamente. Exploramos condiciones óptimas de carga de CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO crea nuevas formas de dosificación con mayor solubilidad y eficiencia de utilización. CSO-SA/EMO puede proporcionar ideas para seleccionar fármacos modelo o portadores, y aplicación clínica de micelas.

Materiales y Métodos Experimentales

Materiales Experimentales

Ratones machos desnudos BALB/C+/nu se obtuvieron del Centro de Animales Experimentales de Universidad Zhejiang. Líneas de células de cáncer gástrico de baja diferenciación MGC803 y BGC823 se compraron del banco de células ATCC. Medio de cultivo RPMI-1640 y FBS se obtuvieron de Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, ácido trinitrobenceno sulfónico y pireno fueron suministrados por Sigma Aldrich. Universidad Zhejiang proveyó CSO-SA. Otros reactivos comprados fueron de grado AR.

Determinación de CMC y Espectros ¹H RMN de CSO-SA

En este reporte, la concentración micelar crítica (CMC) de CSO-SA se determinó por espectrofotometría de fluorescencia usando pireno como sonda fluorescente. Varias concentraciones de solución CSO-SA se agregaron a solución de pireno en acetona tras lo cual la acetona se evaporó durante la noche. Los espectros de emisión y valores de pico de pireno en soluciones CSO-SA de diferentes concentraciones se analizaron por espectrofotometría de fluorescencia. El primer pico (I₁ = 374 nm) y el tercer pico (I₃ = 385 nm) del espectro se registraron. Graficamos la concentración logarítmica (Log C) como abscisa e I₁/I₃ como ordenada y calculamos la CMC para las micelas poliméricas.

CSO y CSO-SA se disolvieron en D₂O a concentración 10 mg/ml. Espectros ¹H RMN se registraron, compararon y analizaron para picos característicos de CSO y CSO-SA.

Grado de Sustitución de Amino Detectado

El grado de sustitución de amino (SD%) se detectó usando método de ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS).

Diferentes concentraciones de soluciones CSO y CSO-SA se prepararon tras lo cual se agregaron sucesivamente 4% NaHCO₃ y 0.1% TNBS. Tras incubación a 37 °C por 2 h en baño de agua, se agregó ácido clorhídrico 2 mol/L. La absorbancia se midió a 344 nm por espectrofotometría ultravioleta-visible tras 30 min de ultrasonicación. Se dibujó curva estándar y se calculó SD% de muestra CSO-SA.

Tamaño de Partícula y Potencial de CSO-SA

Se preparó solución CSO-SA 1.0 mg/ml y las micelas se dispersaron completamente con sonda disruptora de células ultrasónica. El tamaño de partícula y potencial de CSO-SA se determinaron con analizador de tamaño de partícula y potencial superficial.

Captación Celular de CSO-SA

Soluciones FITC y CSO-SA se mezclaron, agitaron durante la noche y transfirieron a bolsa de diálisis. FITC no reaccionado y etanol absoluto se removieron por diálisis con agua desionizada por 24 h. Finalmente, se obtuvo solución CSO-SA etiquetada con FITC (FITC-CSO-SA) con concentración 1.0 mg/mL.

Células MGC803 y BGC823 se usaron como células diana para examinar captación celular de CSO-SA. Basado en tasa de proliferación celular, células se sembraron en placas de 24 pozos y cultivaron durante la noche hasta volverse completamente adherentes. Ochenta μL de solución FITC-CSO-SA se agregaron en punto de tiempo establecido. Células se incubaron con 10 μL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) por 15 min para teñir núcleo celular. La captación de CSO-SA por FITC-CSO-SA se detectó por microscopía confocal de barrido láser.

Distribución In Vivo de CSO-SA

La distribución de CSO-SA in vivo se determinó por tinción con tinte fluorescente DiR. Solución CSO-SA/DiR se preparó por diálisis.

Ratones machos desnudos de seis semanas se usaron como modelo experimental. Ratones desnudos se inocularon subcutáneamente con 1 × 10⁸/mL células MGC803. CSO-SA/DiR se administró vía vena cola a volumen de células tumorales ~200 mm³. Los ratones fueron anestesiados en puntos de tiempo establecidos. La distribución temporal de CSO-SA/DiR in vivo se registró usando imagenador de cuerpo vivo de animal pequeño (rango longitud de onda 580-700 nm, tiempo exposición 1000 ms).

Detección de Concentración EMO por HPLC

La concentración de EMO se determinó por HPLC. EMO se aplicó a columna empaquetada Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) con columna de protección (4.6 × 10 mm, 5 μm). Temperatura de columna se estableció en 30 °C, flujo 1.0 mL/min, longitud de onda detección 254 nm, volumen inyección 20 μL. Fase móvil fue metanol/0.1% ácido fosfórico (85:15, v/v). Concentración EMO se graficó como abscisa y área de pico como ordenada. Curvas estándar de EMO se dibujaron para determinar rango lineal óptimo. Todas las muestras inyectadas HPLC se filtraron a través de filtro orgánico 0.45 μm para proteger la columna.

Preparación de CSO-SA/EMO

En este estudio, EMO se encapsuló con sonda ultrasónica. Una proporción de formulación inicial 10% (EMO: CSO-SA, p/p) se usó como punto de partida. La solución EMO se agregó lentamente en manera gota a gota a la solución micelar en baño de hielo. La sonda ultrasónica se aplicó por 20 ciclos (400 W, trabajo 2 s, parada 3 s).

Las micelas cargadas con fármaco se transfirieron a bolsa de diálisis (MWCO, 3.5 kDa) y dializaron contra agua desionizada por 24 h para remover etanol del disolvente. CSO-SA/EMO puro se obtuvo por centrifugación del dializado para remover EMO libre.

Propiedades de CSO-SA/EMO (Diámetro Partícula, Potencial, TEM, EE%)

El tamaño de partícula y potencial superficial de CSO-SA/EMO se midieron con analizador de tamaño de partícula y potencial superficial.

Solución CSO-SA/EMO 0.1 mg/ml se agregó gota a gota sobre película de carbono en cable de cobre, teñida con 2% ácido fosfotúngstico y secada. La morfología y tamaño de partícula de CSO-SA/EMO se observaron por microscopía electrónica de transmisión.

La eficiencia de encapsulación (EE%) y carga de fármaco (DL%) de CSO-SA/EMO se detectaron por extracción con disolvente orgánico y HPLC. A 200 μL muestra de solución micelar CSO-SA/EMO, se agregó 1.8 mL metanol para dispersar micelas y extraer fármaco. La concentración EMO se midió como C_EMO. Otros 400 μL de solución micelar CSO-SA/EMO se colocaron en tubo centrífuga de ultrafiltración y centrifugaron (12,000 rpm, 5 min) para obtener sobrenadante. EE% y DL% se calcularon según fórmulas: EE% = (10×C_EMO - C)×V/M_EMO×100%; DL% = (10×C_EMO - C)×V/[(10×C_EMO - C)×V + M_CSO-SA]×100%, donde C_EMO es concentración EMO en micelas, C es concentración EMO de micelas cargadas tras centrifugación de ultrafiltración, V es volumen de micela cargada sometida a diálisis, M_EMO es cantidad EMO administrada durante carga, M_CSO-SA es masa de CSO-SA.

Evaluación de Liberación de Fármaco In Vitro

La liberación de fármaco desde CSO-SA/EMO se investigó usando PBS (pH 7.2) como medio de liberación. Un mililitro de solución micelar cargada se colocó en bolsa de diálisis 3.5 kDa sellada en ambos extremos luego colocada en tubo con medio de liberación apropiado. La bolsa de diálisis se colocó en agitador termostato horizontal a 37 °C. Muestras se tomaron en puntos de tiempo establecidos y reemplazaron con mismo volumen de medio de liberación fresco. El contenido de EMO en las muestras se determinó por HPLC y la cantidad acumulada de EMO liberada se calculó.

Citotoxicidad de CSO-SA/EMO

Las tasas de supervivencia de células de cáncer gástrico tratadas con CSO-SA/EMO, CSO-SA y EMO se detectaron por ensayo MTT. Células se sembraron en placas de 96 pozos a concentración ~10⁵/ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA y EMO se agregaron a diferentes concentraciones. Tras incubación por diferentes periodos, 20 μL solución MTT trabajo se agregó. Tras 4 h incubación, 200 μL DMSO se agregó y la densidad óptica (OD) de la solución a 570 nm se midió por lector de microplacas.

Efecto de CSO-SA/EMO en Ciclo Celular

Células de las dos líneas se sembraron en placa de 6 pozos a densidad 10⁵/mL. Tras 12 h cultivo, CSO-SA, CSO-SA/EMO y EMO se agregaron e incubaron por 24 h. Las células se digirieron, recolectaron y lavaron. 500 μL solución tinción PI se agregó a cada muestra celular, el pellet celular se resuspendió lentamente y las células se incubaron en oscuridad a 37 °C por 30 min. Fluorescencia roja se detectó por citómetro de flujo a longitud de onda excitación 488 nm. Contenido ADN analizado por software FlowJo.

Efectos Antitumorales de CSO-SA/EMO Evaluados por Análisis In Vivo e Histológicos

Experimentos con animales se realizaron según Guías para Comité de Cuidado y Uso Animal, Universidad Zhejiang. Células MGC803 (1 × 10⁶) se inyectaron subcutáneamente en flanco anterior derecho de ratones machos desnudos a 5-6 semanas edad. Tumores permitidos crecer a diámetro ~5 mm. En ese punto, ratones se dividieron aleatoriamente en grupo control, grupo inyección EMO y grupo inyección CSO-SA/EMO, con 3 animales cada grupo. Todos los ratones inyectados intravenosamente con reactivos relevantes vía vena cola una vez al día por 2 semanas. Calibrador Vernier electrónico usó para medir diámetros largo (a) y corto (b) del tumor (b). Volumen tumoral calculado según fórmula V = a × b²/2. Peso corporal de cada ratón registrado tras lo cual tumores recolectados para análisis histológico. Tasa inhibición tumoral determinada en tejidos tumorales tras tinción hematoxilina-eosina (HE). Etiquetado de extremo de desoxinucleótido terminal mediado por transferasa dUTP nick-end (TUNEL) realizado para detectar apoptosis celular en tejido íleon terminal usando kit detección muerte celular in situ según instrucciones del fabricante.

Resultados y Discusión

CMC y Espectros ¹H RMN de CSO-SA

Los polímeros anfifílicos se autoensamblaron en micelas en medio hidrofílico. Menor CMC resultó en mayor formación de micelas. Esto fue beneficioso para mantenimiento de estructura micelar tras administración intravenosa. Cuando CSO-SA formó micelas, la sonda fluorescente pireno pudo entrar fácilmente al núcleo hidrofóbico de las micelas aumentando intensidad de fluorescencia del pireno cargado que aumentó intensidad del espectro de emisión. En este punto, I₃ aumentó significativamente más rápido que I₁, así la relación de intensidad de fluorescencia I₁/I₃ disminuyó abruptamente. Un punto de quiebre significativo pudo observarse en gráfico I₁/I₃ y valores Log C (Fig. 1). Cálculos de punto de inflexión mostraron CMC = 179.02 μg/mL. Cuanto menor el CMC, mayor la capacidad de formar micelas y mayor resistencia a dilución lo que mejoró protección de estructura micelar tras administración intravenosa.

Nanomicelas de oligosacárido de quitosano-g-ácido esteárico cargadas con emodina: diseño, caracterización y actividad antitumoral — Variación de relación de intensidad de fluorescencia (I₁/I₃) versus concentración logarítmica de CSO-SA

EDC se usó como agente de acoplamiento entrecruzante para reaccionar con grupo carboxilo de SA y formar derivado intermedio activo -OO-acil isourea. Este puede reaccionar con grupo amino primario de CSO para formar enlace amida. La estructura de CSO-SA se determinó y confirmó basada en espectro de resonancia magnética nuclear de protón. ¹H RMN (400 MHZ, D₂O) δ 1.06 (m, CH₂), 1.02 (m, CH₃) corresponden a protón metileno y protón metilo de SA respectivamente.

Grados de Sustitución de Grupo Amino

El SD% de CSO-SA es el porcentaje de grupos amino sustituidos por ácido esteárico en quitosano. TNBS reaccionó con grupos amino libres en quitosano y formó derivados trinitrobenceno con absorción UV a 344 nm. La curva estándar del derivado trinitrobenceno de quitosano se determinó por absorción UV a 344 nm. El SD% de CSO-SA se calculó en 9.3 ± 8%. Esto confirmó que CSO y SA se enlazaron exitosamente basado en su proporción de injerto.

Tamaño de Partícula y Potencial de CSO-SA, CSO-SA/EMO

La Tabla 1 muestra que el promedio Z de CSO-SA fue 139.3 ± 2.2 nm. PDI fue 0.179 ± 0.03 indicando dispersión relativamente uniforme. Comparado con CSO-SA, el promedio Z y PDI de CSO-SA/EMO aumentaron. Tras cargar EMO, la carga positiva superficial de CSO-SA/EMO fue mayor que la de CSO-SA.

Captación Celular

FITC no afectó las propiedades fisicoquímicas de CSO-SA. Obtuvimos FITC-CSO-SA injertando fluoresceína FITC en CSO-SA. Tras teñir células con Hoechst 33342, la captación de células FITC-CSO-SA se observó usando microscopía confocal de barrido láser. Encontramos que la captación de MGC803 aumentó gradualmente con tiempo creciente y fluorescencia FITC aumentó gradualmente. La captación micelar de BGC823 fue similar a MGC803 de manera dependiente del tiempo. FITC-CSO-SA tuvo buena capacidad de penetración celular y se distribuyó uniformemente en citoplasma de células de cáncer gástrico (Fig. 2).

Distribución de CSO-SA In Vivo

La tecnología de imagen infrarroja cercana (NIR) es ventajosa para penetrar biomateriales y tejidos. Tras inyectar CSO-SA/DiR en vena cola de ratones desnudos, la distribución de CSO-SA/DiR se observó y registró en diferentes tiempos usando imagenador de cuerpo vivo de animal pequeño. Como se muestra en Fig. 3, la distribución de CSO-SA/DiR fue similar a otras micelas a 4 h tras inyección vena cola y se distribuyó principalmente en hígado, bazo y tejidos tumorales. La distribución de nanomicelas en tumor aumentó gradualmente en intensidad con tiempo creciente. Esto indicó que injerto CSO-SA tuvo buena capacidad de orientación pasiva principalmente debido al efecto EPR de nanomicelas (Fig. 3).

Preparación de CSO-SA/EMO

Influencia de Diferentes Ambientes pH en Carga de Fármaco

Preparamos solución CSO-SA y ajustamos pH de CSO-SA para investigar efecto de pH en carga de fármaco. Como se muestra en Fig. 4, CSO-SA tuvo buena capacidad de carga de fármaco y exhibió tendencia parabólica en rango pH 6.4-6.8. El nivel más alto de carga de fármaco se vio en pH 6.6 haciendo este valor el pH óptimo para carga de fármaco (Fig. 4).

Eficiencia de Encapsulación, TEM y Carga de Fármaco

CSO-SA se autoensambla en nanocompuestos micelares núcleo-cáscara. Los moietes hidrofóbicos forman espontáneamente estructuras de núcleo hidrofóbico para repeler medios hidrofílicos. Esta estructura proporciona vehículo clave para carga de fármaco porque EMO puede encapsularse fácilmente en el núcleo hidrofóbico debido a su estructura hidrofóbica. Investigamos efecto de CSO-SA en capacidad de carga de EMO variando dosificación de EMO. Como se muestra en Fig. 5, con dosificación creciente de EMO, la cantidad de carga de fármaco aumenta. La tasa de carga de CSO-SA alcanzó hasta 21.16% cuando la proporción fue 30% (Fig. 5).

CSO-SA/EMO se amplió 30,000 veces con microscopio electrónico de transmisión. Forma y tamaño de nanomicelas se observaron y registraron.

Liberación de EMO desde CSO-SA/EMO

La solución micelar cargada se agregó a bolsa de diálisis 3.5 kDa con PBS (pH 7.2) usado como medio de liberación. Cada vez que se removía una muestra se reemplazaba con mismo volumen de medio de liberación fresco.

La concentración de EMO en diferentes puntos de tiempo se determinó por HPLC, tras lo cual se calculó porcentaje de liberación acumulada. Como se muestra en Fig. 6, CSO-SA/EMO exhibió efecto de liberación sostenida significativo comparado con EMO libre. Estos resultados muestran que el porcentaje de liberación de EMO libre fue 38.4% a 0.5 h mientras que el porcentaje de liberación de EMO desde CSO-SA/EMO fue ~6.6%. A 4 h, porcentaje liberación EMO libre fue 83.7% y porcentaje liberación CSO-SA/EMO fue ~32.5%. En 72 h, liberación EMO libre alcanzó 97.2% mientras liberación EMO desde CSO-SA/EMO fue 78.4%. EMO se liberó desde micelas cargadas CSO-SA/EMO de dos formas principales: por disociación de EMO del núcleo micelar y por penetración desde núcleo micelar al medio de liberación.

Toxicidad de CSO-SA/EMO a Células de Cáncer Gástrico

El ensayo MTT es método estándar para detectar viabilidad celular. La citotoxicidad de EMO libre, CSO-SA y CSO-SA/EMO a células de cáncer gástrico MGC803 y BGC823 se midió usando ensayo MTT. Mostró que EMO y CSO-SA/EMO podían inhibir células MGC803 y BGC823 de manera dependiente de dosis y tiempo. Sin embargo, a misma concentración, CSO-SA/EMO tuvo mayor efecto inhibitorio en células MGC803 y BGC823 comparado con solución EMO libre. Los valores IC₅₀ (Tabla 2) de EMO y CSO-SA/EMO para células de cáncer gástrico se calcularon. El IC₅₀ de CSO-SA/EMO fue significativamente menor que el de EMO en cada punto de tiempo (24 h, 48 h, 72 h). Los valores IC₅₀ de CSO-SA mostraron que CSO-SA fue un portador biológico seguro con poca toxicidad biológica lo que confirmó que la citotoxicidad de CSO-SA/EMO fue causada por EMO (Fig. 7).

Tabla 2 y Fig. 7 mostraron que la citotoxicidad del sistema de administración de fármaco CSO-SA/EMO fue significativamente mayor que la de EMO libre. Sin embargo, cuando se simuló la liberación de CSO-SA/EMO y EMO libre en ambiente in vivo, la liberación de EMO libre alcanzó 38.4% a 0.5 h mientras liberación de CSO-SA/EMO fue solo 6.6%. En general, la concentración de EMO libre fue mayor que la de CSO-SA/EMO en cada punto de tiempo.

Este fenómeno se explica fácilmente. Aunque CSO-SA/EMO liberó EMO relativamente lento, el efecto antitumoral de CSO-SA/EMO no se ralentiza ni declina. Muchos estudios han mostrado que sistemas de administración de nanofármacos pueden mejorar la actividad antitumoral de fármacos quimioterapéuticos.

Primero, aunque EMO libre exhibe una explosión inicial de actividad, EMO no puede ser eficientemente captado por las células mientras CSO-SA aceleró grandemente la captación celular a través de endocitosis o fagocitosis.

Segundo, cuando CSO-SA/EMO se acerca a membranas celulares, la interacción entre nanopartículas y membranas celulares puede afectar la estructura y propiedades de nanomicelas así como la función de macromoléculas biológicas como canales iónicos. Por tanto, la adhesión de CSO-SA/EMO a membranas celulares no resulta en una simple adsorción física sino que puede cambiar el equilibrio dinámico de la célula y further promover la citotoxicidad de CSO-SA/EMO.

Finalmente, EMO libre tiene estructura antraquinona hidrofóbica resultando en pobre distribución en sangre. El sistema de administración CSO-SA/EMO aumenta solubilidad de EMO y mejora disolución llevando a mayor concentración molecular en células circundantes.

Detección de Arresto de Ciclo Celular por FCM

El análisis de ciclo celular es aspecto importante del tratamiento clínico de tumores malignos. Aplicación de fármacos específicos de ciclo a células tumorales durante periodos sensibles a fármacos ha mostrado gran eficacia. Aunque análogos de bromuro de etidio no pueden penetrar células normales, pueden teñir núcleos celulares penetrando membranas celulares dañadas. ADN de doble cadena incrustado con PI produce fluorescencia roja y la intensidad de fluorescencia es proporcional al nivel de ADN de doble cadena. Contenido ADN determinado por citometría de flujo (FCM) tras tinción ADN con PI. Distribución de ciclo celular y apoptosis analizadas basada en distribución de contenido ADN.

Estudios han mostrado que EMO afecta distribución de ciclo celular. Análisis FCM mostró que CSO-SA/EMO y EMO podían bloquear células MGC803 y BGC823 en fase G2/M del ciclo celular.

Células MGC803 se expusieron a misma concentración (20 μM) de CSO-SA, EMO libre y solución CSO-SA/EMO por 24 h. El porcentaje de células MGC803 en fase G2/M fue 8.95%, 15.29% y 23.12% respectivamente. Porcentaje grupo control fue 6.47%. Los porcentajes de células BGC823 en G2/M tratadas con 20 μM CSO-SA, EMO libre o CSO-SA/EMO bajo mismas condiciones fueron 14.25%, 16.79% y 35.71% respectivamente que fueron valores más altos que grupo control (13.66%). Estos datos mostraron que CSO-SA/EMO bloqueó fase G2/M de células MGC803 y BGC823 más eficientemente y significativamente que EMO libre a misma concentración. CSO-SA no mostró diferencia con controles (Fig. 8).

Efecto Antitumoral de CSO-SA/EMO In Vivo

Para further estudiar efecto antitumoral de CSO-SA/EMO, la tasa de inhibición tumoral y niveles de apoptosis celular se evaluaron in vivo. Los resultados mostraron que tanto CSO-SA/EMO como EMO tuvieron efecto inhibitorio notable en crecimiento tumoral (Fig. 9a). La tasa de inhibición tumoral del grupo CSO-SA/EMO fue tres veces la del grupo EMO (Fig. 9d). El peso de ratones en cada grupo no cambió significativamente (Fig. 9b). Esto mostró que tanto CSO-SA/EMO como EMO fueron relativamente seguros. Alteraciones morfológicas y apoptosis en tejidos tumorales de cada grupo mostraron que CSO-SA/EMO tuvo efectos antitumorales significativos (Fig. 9e, f).

Conclusiones

En este estudio, detectamos estructura, CMC, SD%, tamaño de partícula y potencial de CSO-SA con diferentes métodos. Resultados demuestran que CSO-SA anfifílico funcionó bien como portador. Intensidad de fluorescencia de células de cáncer gástrico mostró que CSO-SA fue captado rápidamente dentro de 12 h. Ratones desnudos se usaron como modelo para estudiar distribución de CSO-SA dentro de 72 h. Con el tiempo, la distribución de CSO-SA en lesión se volvió más concentrada exhibiendo buen efecto de orientación pasiva.

CSO-SA/EMO se preparó con método ultrasonicación-diálisis. CSO-SA tuvo fuerte capacidad de carga de fármaco. Cuando pH ambiente se estableció en 6.6, el nivel de carga de fármaco alcanzó 21.6% a proporción de formulación 30%. Comparado con CSO-SA, CSO-SA/EMO tuvo mayor tamaño de partícula y potencial zeta. La forma de CSO-SA/EMO pudo registrarse directamente usando TEM. La liberación de EMO desde CSO-SA/EMO fue 78.4% dentro de 72 h, indicó proceso suave y continuo en cuerpo. Considerando efecto antitumoral de CSO-SA/EMO comparado con EMO libre, lo confirmamos con varios experimentos.

Toxicidad de CSO-SA a células de cáncer gástrico detectada por ensayo MTT. Resultados mostraron que CSO-SA fue portador biológico seguro. Comparado con EMO libre, CSO-SA/EMO mejoró significativamente la actividad antitumoral contra células de cáncer gástrico. Ciclo celular de MGC803 y BGC823 pudo arrestarse en fase G2/M más efectivamente por CSO-SA/EMO. Volumen tumoral, tinción HE y ensayo TUNEL demostraron efecto antitumoral más significativo de CSO-SA/EMO que EMO libre.

Basado en resultados anteriores, CSO-SA es portador biocompatible y seguro. CSO-SA/EMO en este estudio utiliza una formulación de dosificación nueva y efectiva para tratamiento de cáncer y exhibe buen efecto de orientación pasiva in vivo.