Eficacia antitumoral mejorada de terapia Cisplatino-Tetrandrina mediante administración con nanopartículas biocompatibles

Resumen

La terapia combinada ha sido una estrategia estándar en el tratamiento clínico de tumores. Hemos demostrado que la combinación de Tetrandrina (Tet) y Cisplatino (CDDP) presenta una marcada actividad anticancerígena sinérgica, pero los efectos secundarios inevitables limitan su concentración terapéutica. Considerando las diferentes propiedades fisicoquímicas y farmacocinéticas de los dos fármacos, los cargamos juntos en un nanovehículo mediante el método de doble emulsión mejorado. Las nanopartículas (NP) se prepararon a partir de la mezcla de poli(etilenglicol)-policaprolactona (PEG-PCL) y policaprolactona (HO-PCL), de modo que CDDP y Tet pueden localizarse en las NP simultáneamente, resultando en bajo efecto interferente y alta estabilidad. Imágenes de microscopio de fluorescencia revelaron la captación celular de ambos agentes hidrofílicos e hidrofóbicos administrados por las NP. Estudios in vitro en diferentes líneas celulares tumorales y tejido tumoral revelaron tasas aumentadas de inhibición tumoral y apoptosis. En cuanto a estudios in vivo, se observó eficacia antitumoral superior y efectos secundarios reducidos en el grupo NP. Además, la imagen ¹⁸FDG-PET/CT demostró que las NP redujeron las actividades metabólicas de los tumores más prominentemente. Nuestros resultados sugieren que las NP de copolímero en bloque PEG-PCL podrían ser un portador prometedor para quimioterapia combinada con eficacia sólida y efectos secundarios menores.

Introducción

Con el desarrollo de la terapia integral de tumores, los compuestos de platino juegan un papel importante en el tratamiento de diversos cánceres, entre los cuales el cisplatino (CDDP) se usa ampliamente en clínica [1, 2]. Hoy en día, el CDDP sigue siendo significativo cuando se combina con inmunoterapia tumoral, mostrando efecto favorable en tumores malignos como cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) [3]. Sin embargo, estos agentes quimioterapéuticos siempre logran actividad antitumoral a expensas de toxicidad indeseable [4], por lo que agentes terapéuticos que puedan reducir toxicidad y mejorar eficacia de quimioterapia se han explorado sin cesar [5, 6]. La tetrandrina (Tet) es miembro de alcaloide bis-bencilisoquinolina [7], mostrando efecto satisfactorio en sensibilización a quimioterapia. Nuestro trabajo previo demostró que la combinación Tet y CDDP sí tiene marcada actividad anticancerígena sinérgica inhibiendo expresión de genes asociados a agentes quimioterapéuticos, incluyendo grupo complementario de reparación de escisión 1 (ERCC1), Timidilato Sintasa (TS), β-tubulina III, etc [8]. Sin embargo, la aplicación clínica de Tet sufre su pobre solubilidad en agua y baja biodisponibilidad oral [7]. Además, el CDDP hidrofílico se distribuye más fácilmente en la matriz extracelular (MEC), mientras que el Tet hidrofóbico penetra membranas lipídicas y puede transportarse a través de células, por lo que los dos fármacos no pueden realmente actuar juntos. Por tanto, es esencial encontrar una forma que pueda administrar eficazmente los dos fármacos simultáneamente, mejorando el efecto antineoplásico con efectos secundarios reducidos.

Los avances recientes en nanotecnología gestionan nuevos enfoques para diagnóstico y tratamiento de cáncer [9, 10]. Las nanopartículas (NP) construidas con copolímeros anfifílicos, especialmente polietilenglicol (PEG), son conocidas por sus capacidades para reducir adherencia de proteínas séricas y prevenir captación por el sistema reticuloendotelial (RES) [11]. Si se usan para transportar fármacos hidrofóbicos, los nanotransportadores aumentan la solubilidad tacticamente y prolongan e incrementan la residencia del fármaco en circulación sanguínea y tumor [12]. Con el uso clínico de NP copoliméricas, la biocompatibilidad de las NP atrae cada vez más atención. Por ejemplo, hallazgos recientes revelaron que algunas NP inyectadas de dióxido de titanio, sílice y oro aceleran la intravasación y extravasación de células cancerosas en modelos animales [13]. Las NP preparadas a partir de nanomateriales con buena biocompatibilidad y seguridad, especialmente las aprobadas por FDA, son mejores candidatos para transportadores de fármacos.

Preliminarmente, hemos logrado construir NP cargadas con CDDP [14, 15] y NP cargadas con Tet usando polietilenglicol-poli(caprolactona) (PCL-PEG) [16], cuyos efectos antitumoral in vivo han sido demostrados ambos. En este estudio, usamos PEG-PCL para la co-administración de CDDP y Tet. Con carga casi neutra, PEG forma la capa hidrofílica de una nanopartícula, que oculta epítopos antigénicos y previene reacción inmunológica [14]. Imágenes de microscopio de fluorescencia demostraron que la célula puede captar tanto agentes hidrofílicos como hidrofóbicos administrados por las NP. Los resultados de estudios in vitro, no solo en diferentes líneas celulares tumorales, sino también en tejidos tumorales, revelaron que NP CDDP-Tet inhiben crecimiento tumoral más eficazmente que fármacos libres. Cuando se investigó in vivo, se observaron mayor eficacia antitumoral y menores efectos secundarios en grupo NP. Además, la imagen ¹⁸FDG-PET/CT mostró la tasa metabólica más pobre del tumor en grupo NP, indicando así la capacidad de NP CDDP-Tet para retardar crecimiento tumoral.

Métodos

Materiales

Reactivos y células

CDDP (fórmula molecular PtCl₂(NH₃)₂) se compró de Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China) [15]. Tetrandrina (fórmula molecular C₃₈H₄₂N₂O₆) se obtuvo como polvo con pureza > 98% de Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16]. Metoxipolietilenglicol [MePEG; peso molecular promedio (Mw = 4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] se deshidrató por destilación azeotrópica con tolueno y luego se secó al vacío a 50 °C 12 h antes de uso. ε-Caprolactona (ε-CL; Aldrich, EE. UU.) se purificó secando sobre CaH₂ a temperatura ambiente seguido de destilación bajo presión reducida. Alcohol polivinílico (PVA; grado polimerización = 500, grado alcoholización = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) y octoato de estaño (fórmula molecular SnCl₂) (Sigma) se usaron tal como se recibieron. Medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.), suero sanguíneo bovino (Lanzhou Minhai Bioengineering, China), y bromuro de dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Amersco, EE. UU.) se usaron tal como se recibieron.

Línea celular cáncer gástrico humano bien diferenciado MKN₂₈, línea adenocarcinoma colorrectal humano LoVo, línea cáncer cervical humano Hela, y línea hepatoma murino H₂₂ se obtuvieron de Instituto de Biología Celular de Shanghai (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se propagaron en medio RPMI 1640, suplementado con 10% suero bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 g/mL), piruvato, glutamina, e insulina a 37 °C en atmósfera saturada de agua con 5% CO₂.

Síntesis de copolímeros

Como describimos previamente [16, 17], copolímeros mPEG-PCL y HO-PCL se sintetizaron por copolimerización por apertura de anillo. Brevemente, cantidad predeterminada de ε-CL se añadió a tubo polimerización conteniendo PEG y pequeña cantidad octoato estaño (0,1% p/p). El tubo se conectó a sistema vacío, selló, y colocó en baño aceite a 130 °C 48 h. Para síntesis copolímeros HO-PCL, cantidad predeterminada ε-CL y octoato estaño se añadieron a tubo polimerización sin secar. Tras completar polimerización, copolímeros crudos se disolvieron con cloroformo y precipitaron en exceso metanol frío para eliminar monómero y oligómero no reaccionados. Los precipitados se filtraron y lavaron con agua varias veces antes de secar completamente a presión reducida.

Preparación nanopartículas cargadas CDDP-Tet

Cantidad predeterminada CDDP y Tet-NP se prepararon por método doble emulsión (DE) [14, 18]. CDDP y Tet se emulsionaron con 1 mL solución diclorometano (DCM) conteniendo 5 mg mPEG-PCL y 15 mg HO-PCL, por sonicación 15 s (15 W) en baño hielo (solución W1). Luego, 4 mL solución 3% (p/v) PVA W2 se añadió y sonicó 30 s para hacer emulsión W1/O/W2. La doble emulsión se diluyó en 50 mL solución acuosa 0,3% (p/v) PVA y DCM se evaporó al vacío. Las NP obtenidas se recogieron, lavaron y liofilizaron (Fig. 1).

Eficacia antitumoral mejorada de terapia Cisplatino-Tetrandrina mediante administración con nanopartículas biocompatibles — Esquema de preparación NP CDDP-Tet

Contenido carga fármaco y eficiencia encapsulación

Para determinar contenido carga fármaco, polvo NP liofilizado cargado CDDP-Tet se disolvió en dimetilformamida (DMF), y 30 L esta solución se mezcló con 30 L HCl 2 mmol/L seguido adición 2,94 mL solución SnCl₂ 0,2 mmol/L en HCl 2 mmol/L. La absorbancia a 403 nm se midió tras 1 h con referencia a curva calibración usando espectrofotómetro Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Japón). La cantidad total fármaco en NP pudo calcularse. El contenido carga fármaco y eficiencia encapsulación se obtuvieron respectivamente por Eqs. (1) y (2):

Contenido carga fármaco (%) = Peso fármaco en nanopartículas / Peso nanopartículas × 100 (%) (1)

Eficiencia encapsulación (%) = Peso fármaco en nanopartículas / Peso fármaco alimentado × 100 (%) (2)

Citotoxicidad in vitro de nanopartículas y estudio biocompatibilidad

Estudios captación celular

Basándonos en nuestro trabajo previo [15], células LoVo se colocaron en tapa placa 6 pocillos con ~5 × 10⁵ células cada pocillo e incubaron 24 h (37 °C, 5% CO₂). NP con rodamina B (21 µg/mL) se añadieron en pocillos. Tras incubación 2 h, la placa se lavó con PBS 4 °C y 37 °C 3-4 veces cada una. Células LoVo en cubreobjetos se sometieron a microscopio fluorescencia.

Ensayo citotoxicidad

La citotoxicidad in vitro de fármacos se determinó por ensayos MTT estándar usando líneas celulares MKN28 y H₂₂. Brevemente, células se sembraron en placa 96 pocillos a densidad 5000 células por pocillo 24 h antes del ensayo. Luego células se expusieron a serie dosis CDDP libre, Tet libre, CDDP libre más Tet y NP cargadas CDDP-Tet. Tras incubación, 20 µL solución MTT 5 mg/mL se añadió cada pocillo e incubó placa 4 h, permitiendo células viables transformar MTT amarillo en cristales formazán azul oscuro, que se disolvieron en 200 µL dimetilsulfóxido (DMSO). La densidad óptica (DO) cada pocillo se midió por lector ELISA (ELX800 Biotek, EE. UU.) usando longitudes onda prueba y referencia 490 y 630 nm, respectivamente. La viabilidad celular se determinó por fórmula:

Viabilidad celular (%) = DO (pocillo prueba) / DO (pocillo referencia) × 100 (%) (3)

La compatibilidad in vitro de NP en blanco también se determinó por ensayos MTT usando líneas celulares MKN₂₈ y H₂₂. Todos los resultados obtenidos de ensayos MTT se confirmaron repitiendo experimento al menos tres ocasiones independientes y probando triplicado cada vez.

Ensayo apoptosis

Kit Annexin V-FITC (Bender MedSystem, EE. UU.) se adoptó para examinar alteración tasas apoptosis celular. Células MKN₂₈ se sometieron a plato cultivo 6 cm 24 h. Medios cultivo se reemplazaron con 1 µg/mL CDDP libre, 1 µg/mL NP cargadas CDDP, y 200 µg/mL NP en blanco, respectivamente. Grupo control se reemplazó con medios cultivo sin fármacos. Enzima se añadió tras 48 h cultivo. Las células se recogieron, lavaron 2 veces con PBS, y resuspendieron en 100 µL buffer. Annexin V 5 µL y PI 1 µL se añadieron turnos, mezclaron, y reposaron 15 min temperatura ambiente sin exposición luz. 400 mL buffer se añadió y se sometió proceso FCM (BD FACS CantoTM, EE. UU.) para análisis tasas apoptosis celular.

Ensayo respuesta fármaco histocultivo (HDRA)

El HDRA se realizó según nuestros estudios previos [14, 19]. Brevemente, ratones ICR macho se inyectaron subcutáneamente en ambos espacios axilares con 4-6 × 10⁶ células H₂₂ en salino. Cuando tumores alcanzaron 400-600 mm³ volumen, ratones se sacrificaron por dislocación cervical, y especímenes frescos se muestrearon, lavaron dos veces en salino, sumergieron en solución Hank, y dividieron en piezas pesos ~15 mg. Las muestras tisulares se colocaron en placa 24 pocillos en la que esponjas gelatina cuadradas dimensiones 1 cm se sumergieron en medio RPMI 1640 suplementado 20% suero fetal bovino y sulfato amikacina (100 UI/mL) conteniendo CDDP libre o NP cargadas CDDP a dos concentraciones diferentes. Cuatro especímenes tumorales se incubaron sin fármaco como control. Los tejidos se cultivaron 7 días a 37 °C 5% CO₂. Una solución mixta colagenasa Tipo I (100 L, 0,6 mg/mL) y MTT (100 L, 5 mg/mL) en 100 mg/mL succinato sódico se añadió. Tras incubación otras 24 h, formazán MTT se extrajo 1 mL DMSO, y 100 L solución cada pocillo se transfirió a pocillos placa 96 pocillos. El DO cada pocillo en microplaca se midió usando lector ELISA con longitudes onda prueba y referencia 490 y 630 nm, respectivamente. Las viabilidades tejidos se calcularon según fórmula (4):

Viabilidad tejido (%) = (DO (prueba) / Peso (prueba)/mg) / (DO (control) / Peso (control)/mg) × 100 (%) (4)

Eficacia antitumoral in vivo

Medición volumen tumoral

Ratones ICR macho peso entre 18 y 20 g se implantaron con línea hepatoma murino H₂₂ y usaron para calificar eficacia relativa NP cargadas CDDP-Tet. Criados bajo circunstancias libre patógenos específicos (SPF), ratones se realizaron cumpliendo directrices aprobadas por Comité Cuidado Animales Hospital Torre Tambor. 0,2 mL suspensión celular conteniendo 4-6 × 10⁶ células H₂₂ se inyectó subcutáneamente en espacio axilar izquierdo ratones. Ratones se dividieron en 6 grupos: grupo control (salino), grupo NP en blanco, grupo CDDP libre (3 mg/kg), grupo CDDP libre más Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), y grupo NP cargadas CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg). Cada grupo comprendía 6 ratones. Tratamientos empezaron tras 7-8 días implantación, y el día se designó "Día 0". Cada animal se pesó al momento tratamiento para que dosis pudieran ajustarse para lograr dosis mg/kg reportadas. Animales también se pesaron cada dos días durante experimento.

Ensayo inmunofluorescencia

Los tejidos tumorales de ratones en grupo control y que recibieron CDDP libre más Tet y NP CDDP-Tet se seleccionaron para observación histología día 21 tras tratamiento. Los tumores se disecaron y fijaron en formaldehído neutro tamponado 10%, procesaron rutinariamente en parafina, seccionaron espesor 5 mm. Las secciones tisulares se observaron bajo microscopio confocal Zeiss LSM510 Meta tras teñir muestras con (40,6-diamidino-2-fenilindol) (DAPI, azul) y etiquetado extremo desoxinucleotidil transferasa dUTP nick (TUNEL, verde) [20].

Imagen ¹⁸FDG-PET/CT

Ratones grupo CDDP libre más Tet y grupo NP cargadas CDDP-Tet recibieron entonces imagen PET/CT día 6 tras tratamiento. 4 h ayuno se realizaron antes inyección trazador. 14,8 MBq (400 µCi) ¹⁸F-FDG se inyectó vía vena cola como trazador radiactivo. Las imágenes se produjeron con escáner PET/CT combinado (Jemini JXL, Philips, EE. UU.). Imágenes PET alta resolución y mismo campo vista CT se adquirieron con ratones 45 min tras administración ¹⁸F-FDG. Imágenes PET se corrigieron atenuación y dispersión base datos CT. La fusión imagen se realizó por sistema automático fusión imagen, usando software proveedor. Valores máximos captación FDG en tumor se obtuvieron para cálculos valor captación estandarizado (SUV), aplicando correcciones peso corporal e inyectada actividad.

Métodos estadísticos

Análisis estadísticos datos se hicieron usando prueba t Student. Los datos se listan como media ± DE, y valores P < 0,05 se aceptaron como diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Síntesis y caracterización copolímeros

Según nuestro estudio previo, sintetizamos NP con PEG-PCL y HO-PCL (ratio óptimo 1:3) [14]. El diámetro, polidispersidad, peso molecular promedio numérico (Mn), y peso molecular promedio ponderal (Mw) de NP copoliméricas PEG-PCL óptimas se muestran en Archivo adicional 1: Tabla S1. Cuando se cargaron CDDP y Tet, contenido carga fármaco y eficiencia encapsulación también se midieron (Archivo adicional 1: Tabla S2), similares a NP cargadas CDDP copoliméricas PEG-PCL. Sin embargo, contenido carga fármaco y eficiencia carga Tet son menores que NP cargadas Tet copoliméricas PEG-PCL, lo que puede tener que ver con componentes HO-PCL.

Mediante dispersión luz dinámica (DLS), el diámetro NP cargadas CDDP-Tet copoliméricas PEG-PCL fue 359,1 ± 5,3 nm con polidispersidad ~0,231. Cuando se observaron por MET y AFM (Archivo adicional 1: Fig S1a y S1b), las NP presentaron forma esférica regular y tamaños similares coincidentes con datos DLS. También, pequeñas gotas se dispersan en nanopartículas, confirmando que NP son estructura doble emulsión.

Captación celular NP cargadas CDDP-Tet

Partículas cargadas colorantes fluorescentes se aplicaron como método común explorar captación celular, que realizan detección visual y tiempo real. Hemos demostrado que NP cargadas colorante pueden entrar células por endocitosis. En este estudio, rodamina-B es hidrofílica y puede detectarse en canal fluorescencia PI, usadas para simular CDDP. Como simulación Tet, cumarina-6 es hidrofóbica, cuya señal puede recibirse en canal fluorescencia FITC. Tras co-incubación 2 h con NP cargadas cumarina-6 y rodamina-B, células LoVo detectadas microscopía fluorescencia y lente óptica (200×). Como ve Fig. 2, señales fluorescencia pueden detectarse canal fluorescencia PI, canal fluorescencia FITC, y canal dual fluorescencia PI/FITC. Resultados confirmaron NP pueden transportar tanto cumarina-6 como rodamina-B a células tumorales simultáneamente, basándonos en lo cual inferimos CDDP y Tet pueden cargarse en NP y absorberse por células tumorales simultáneamente.

Citotoxicidad in vitro nanopartículas

La citotoxicidad CDDP libre, Tet libre, CDDP libre más Tet, y NP cargadas CDDP-Tet se compararon en línea celular gástrica MKN28. La concentración Tet fue 2,4 veces concentración CDDP. Como muestra Fig. 3, la citotoxicidad NP cargadas CDDP-Tet fue más potente entre cuatro grupos. La diferencia citotoxicidad entre Tet libre y grupo NP y tres otros grupos fármacos libres se volvió prominente con concentración aumentada. Resultados similares observados en células cáncer cervical humano Hela y carcinoma hepatocelular H₂₂ (Archivo adicional 1: Fig S2a, S2b).

Estudio toxicidad NP en blanco se realizó en nuestro trabajo previo. En estudio previo, NP en blanco tuvieron poca toxicidad líneas celulares tumorales, indicando NP en blanco son biocompatibilidad satisfactoria [14, 16].

Análisis apoptosis in vitro NP cargadas CDDP-Tet

Medimos impacto 1 µg/mL CDDP libre, 2,4 µg/mL Tet libre, CDDP libre más Tet (1 µg/mL + 2,4 µg/mL), y NP cargadas CDDP-Tet (1 µg/mL + 2,4 µg/mL) en tasa apoptosis células MKN28 tras co-cultivo 48 h. Tasa apoptosis celular se calculó como Q2 + Q4 (mostrado Fig. 4). La alteración tasas apoptosis celular fue similar entre grupos CDDP libre más Tet, CDDP libre, y Tet libre (Fig. 4a-c). Sin embargo, la tasa apoptosis células MKN28 inducida por NP cargadas CDDP-Tet fue significativamente mayor que tres otros grupos (Fig. 4d).

Ensayo respuesta fármaco histocultivo (HDRA)

Para evaluar efectividad antitumoral NP más comprensivamente, evaluamos efectos antitumoral CDDP libre, CDDP libre más Tet, y NP cargadas CDDP-Tet en líneas celulares H₂₂ usando HDRA. Como método clínico predecir quimiosensibilidad, HDRA simula condiciones prácticas tejidos tumorales más autenticamente que experimento citológico [19], cuyos resultados pueden influenciarse por microambiente y microestructura tejido tumoral como penetración fármaco, valores pH extracelulares, presión fluido intersticial, etc.

La concentración Tet es 2,4 veces concentración CDDP. Como muestra Fig. 5, en concentración más baja, efecto antitumoral grupo CDDP libre y Tet fue mejor que CDDP sin embargo efectos fueron similares con aumento concentración fármaco. De acuerdo con análisis apoptosis, NP cargadas CDDP-Tet tuvieron efecto antitumoral considerablemente mejor entre tres grupos en todas las concentraciones probadas.

Análisis eficacia antitumoral in vivo

Evaluación eficacia y efecto secundario

Modelos murinos formados por injerto línea celular H₂₂ se trataron con 3 mg/kg CDDP libre, CDDP libre junto Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), NP cargadas CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), respectivamente. Tumores se obtuvieron 12 días tras tratamiento fármaco. Tamaños tumorales se detectaron cada 2 días determinar contenido óptimo administración fármaco. Como muestra curva crecimiento tumoral (Fig. 6), la tendencia crecimiento tumoral grupo control y grupo NP en blanco fueron similares pero existía inhibición prominente tumor en otros tres grupos con administración fármaco. Comparado con grupo CDDP libre, grupo CDDP libre más Tet mostró mejor eficacia antitumoral durante primeros 6 días. Sin embargo, tras 6 días, la diferencia tasa inhibición tumor entre dos grupos comenzó estrecharse y tras 10 días, CDDP libre más Tet tuvo incluso peor efecto antitumoral.

Durante primeros 6 días, efectos antitumoral grupo CDDP libre más Tet y grupo NP CDDP-Tet fueron similares. Por tanto, ratones recibieron NP cargadas CDDP-Tet mostraron mejor eficacia antitumoral desde día 6 tras tratamiento. Archivo adicional 1: Figura S3a muestra diferentes tamaños tumorales cada grupo. El volumen tumoral grupo NP cargadas CDDP-Tet fue menor, considerado reflexión directa efecto antitumoral prominente. Además capacidad inhibición tumoral, comparado con grupo CDDP libre o CDDP libre más Tet, había menos vasos sanguíneos en superficie tumor). Similarmente, como muestra Archivo adicional 1: Figura S3b, la densidad vascular fue menor grupo NP relativo grupo control y grupo CDDP libre más Tet.

Para investigar further ratio células apoptóticas tejido tumoral in vivo, ensayo TUNEL se realizó para detección células apoptóticas. Como muestra Fig. 7, células apoptóticas tumores pueden teñirse fluorescencia verde indicar apoptosis. Imágenes fusionadas muestran menos regiones fluorescencia verde grupo control y grupo CDDP libre más Tet, indicando presencia menos células apoptóticas. Además, gran número regiones fluorescencia verde observadas grupo tratado NP CDDP-Tet, indicando gran cantidad células apoptóticas. Resultados confirmaron NP CDDP-Tet pueden promover apoptosis tumoral in vivo.

Además mejor eficacia antitumoral que grupo CDDP libre y CDDP libre más Tet, NP cargadas CDDP-Tet también mostraron menos efectos secundarios. Como muestra Fig. 8a, CDDP libre y CDDP libre más Tet causaron pérdida peso significativa comparado grupo control, indicando toxicidad administración fármaco directo. Curva cambio peso grupo NP en blanco similar grupo control, sugiriendo toxicidad NP en blanco puede despreciarse. Pérdida peso causada NP cargadas CDDP-Tet y grupos control fueron comparables durante primeros 6 días. Día 6 a día 12, niveles peso ratones grupo NP ligeramente menores que grupo control, pero mayores que grupo CDDP libre o CDDP libre más Tet. Cabe destacar que grupo CDDP libre más Tet contribuyó pérdida peso obvia y disminuyó apetito ratones durante primeros 4 días, indicando absorción fármacos fue dañina cuerpo entero. Por contraste, NP cargadas CDDP-Tet pueden liberarse lentamente tejidos y mantener concentración grado estable; por tanto, efectos secundarios fueron obviamente reducidos comparado administración fármaco directo. Luego, efectos secundarios tratamiento también evaluados biopsia hepática (Fig. 8b). Comparado grupo control, límite entre células hepáticas grupo fármaco doble desnudo es borroso, algunas células hepáticas tienen cambios globosos, cuerpos celulares se encogen, picnosis nuclear, y eosinofilia aumentada (flecha amarilla), mientras grupo NP doble fármaco. La estructura células madre es normal, espacio intercelular claro, y no hay cambio patológico obvio. Estos resultados sugirieron poca deterioro causado administración NP.

PET-CT

Para comparar mejor efecto terapéutico in vivo cada grupo, ratones se sometieron TC, PET/CT día 6 tras tratamiento. Las imágenes fusión TC y PET se muestran Fig. 9. PET/CT es método eficiente reflexión cambios metabólicos mediante detección captación ¹⁸FDG [21]. Como muestra TC (Fig. 9), volumen tumoral grupo CDDP libre más Tet y grupo NP cargadas CDDP-Tet fueron comparables (Fig. 9a) pero tasa metabólica tumoral grupo CDDP libre más Tet fue significativamente mayor que grupo NP (Fig. 9b). La intensidad disminuida en sitio tumoral ratones recibieron NP cargadas CDDP-Tet simbolizó tasa metabólica pobre tumor, indicando así capacidad NP retardar crecimiento tumoral.

Discusión

Considerando heterogeneidad y complejidad tumor, terapia combinada se ha convertido estrategia estándar en tratamiento clínico tumor [22]. No obstante, simple combinación dos terapéuticos individuales no necesariamente alcanza efecto anticipado debido a diferentes propiedades fisicoquímicas y farmacocinéticas dos fármacos [23]. Para administrar diferentes fármacos a células tumorales en ratio sinérgico, un vehículo terapia combinada se diseñó en este estudio. CDDP es hidrofílico mientras Tet es hidrofóbico, lo que causa problemas método carga. En este estudio, usamos copolímero anfifílico con PCL como núcleo hidrofóbico y PEG como corona hidrofílica [14]. Por método doble emulsión mejorado, Tet localizó en capa aceite y CDDP en capa agua, la estructura única imparte NP capacidad encapsulación simultánea Tet y CDDP formar NP. CDDP y Tet localizan en diferentes capas NP, resultando bajo efecto interferente y alta estabilidad [24].

El vehículo terapia combinada cargado CDDP y Tet puede mejorar eficacia combinación CDDP-Tet. No solo en experimentos celulares, NP CDDP-Tet también inhiben significativamente viabilidades tejido tumoral ensayos HDRA, validando efecto anti-tumor NP en modelo que tiene en cuenta microambiente tumoral [19]. En estudio in vivo, eficacia antitumoral observada cambio volumen tumoral, demostró NP CDDP-Tet suprimen eficazmente crecimiento tumoral con menor nivel proliferación. Imagen ¹⁸FDG-PET/CT reveló metabolismo glucosa tumores grupo CDDP-Tet inhibido más prominentemente y temprano induciendo mayor nivel apoptosis tumores, confirmado ensayos inmunofluorescencia [21]. Comparado CDDP libre más Tet, NP CDDP-Tet son más rápidas y seguras hacer efecto, explicable por tres mecanismos:

Primero, como fármaco liposoluble, Tet difícilmente distribuye MEC y por tanto rara vez difunde alrededor células tumorales [9]. Localizado en fase aceite NP, Tet dota mejor solubilidad y biodisponibilidad, alcanzando sitios tumorales misma ratio sinérgica CDDP. Además, CDDP, que solía tener efecto secundario sistémico, una vez transportado nanopartícula, puede alcanzar fácilmente intersticio tejidos tumorales desde vasos sanguíneos tumorales permeables y retenerse dentro tumor debido presión por drenaje linfático deficiente [25]. Más CDDP tejidos tumorales retienen, menos daño órganos normales. Como resultado estrategias direccionamiento pasivo, NP CDDP-Tet son mucho más seguras CDDP libre más Tet, observable cambios peso corporal ratones y biopsias hepáticas.

Resistencia fármacos considerada uno mayores desafíos tratamiento cáncer, no solo por cambios genéticos nivel célula individual, sino también tejidos tumorales y microambiente [26]. Por un lado, Tet es alcalino, por lo que se protonará en microambiente tumoral ácido y así no puede cruzar citomembranas tumorales electronegativas, lo que se llama resistencia fisiológica fármaco inducida pH [27]. Por otro lado, grandes distancias entre vasos sanguíneos tumores sólidos y alta presión fluido intersticial contribuyen distribución limitada CDDP y Tet [28]. Transportado nanovehículo, Tet puede entrar células tumorales vía endocitosis sin influencia microambiente tumoral, superando resistencia fisiológica fármaco inducida pH. Pequeño tamaño nanotransportadores permite entrar vasculatura tumoral y acumularse preferentemente sitio tumoral in vivo [29, 30].

En resumen, este estudio representa ejemplo administrar fármaco quimioterapéutico junto quimiosensibilizador simultáneamente. Transportado NP, ambos fármacos dirigidos sitio tumoral pasivamente, reduciendo toxicidad sistémica. Además, NP ofrecen solución resistencia fisiológica fármaco ayudando quimiosensibilizador entrar células tumorales más y más rápido, juegan papel importante mejorar eficacia quimioterapia tumoral. Por tanto, creemos PEG-PCL copolímero en bloque NP podría ser portador prometedor quimioterapia combinada.

Conclusiones

Basado en nuestros estudios previos [8, 14, 16], este artículo investigó aplicación NP PEG-PCL/HO-PCL para administración combinación dos fármacos diferentes propiedades fisicoquímicas. Para estudios in vitro, NP exhibieron efecto antitumoral superior gran biocompatibilidad. Eficacia antitumoral mejorada observada cambio volumen tumoral e imagen ¹⁸FDG-PET/CT en estudio in vivo modelo murino. Ratones grupo NP también exhibieron efectos secundarios reducidos. Adicionalmente, tasa apoptosis células tumorales promovida NP tanto estudios in vitro in vivo. En resumen, estas NP copolímero en bloque podrían ser portador prometedor administración combinaciones Cisplatino-Tetrandrina y otras combinaciones, con efecto antitumoral mejorado y toxicidad reducida, para tratamiento cáncer.