Nanopartículas de Donepezilo Emulsionadas con Polisorbato-80 Dirigidas al Cerebro: Una Nueva Estrategia Neuroprotectora

Resumen

Los tratamientos para la enfermedad de Alzheimer (EA) a menudo fallan al alcanzar concentraciones terapéuticas en el cerebro debido a la barrera hematoencefálica (BHE). Diseñamos una nanopartícula de pululano modificado con colesterol (CHP) cargada con el inhibidor de acetilcolinesterasa donepezilo (DZP) y recubrimos su superficie con polisorbato 80 (PS) para lograr transcitosis activa a través de la BHE. Usando dispersión dinámica de luz y calorimetría de titulación isotérmica, identificamos una proporción 1:5 (p/p) DZP:CHP como óptima, logrando alta encapsulación de fármaco (86,5 %) y carga (13,4 %). Estudios de liberación in vitro demostraron liberación sostenida de DZP durante 72 h. Imágenes de fluorescencia in vivo en ratones confirmaron que las nanopartículas recubiertas con PS se acumulan preferentemente en tejido cerebral, con depósito mínimo en órganos no diana. Ensayos funcionales en células PC12 y SH-SY5Y pretratadas con Aβ25–35 revelaron que las nanopartículas DZP-CHP restauraron la viabilidad celular, redujeron fuga de lactato deshidrogenasa (LDH), preservaron potencial de membrana mitocondrial (MMP) e inhibieron apoptosis más efectivamente que DZP libre. Micro-termoforesis mostró unión fuerte a ApoE (K_D = 3,6 µM), indicando transporte mediado por receptores a través de la BHE. Estos resultados apoyan el potencial clínico de nanopartículas DZP-CHP recubiertas con PS para neuroprotección dirigida en EA.

Introducción

La EA se caracteriza por declive cognitivo progresivo y depósito de amiloide-β (Aβ). El donepezilo oral convencional sufre de pobre solubilidad acuosa, baja biodisponibilidad oral y limitada penetración de la BHE, necesitando dosificación diaria y comprometiendo adherencia del paciente. Los sistemas de administración de fármacos basados en nanopartículas (nano-DDS) ofrecen una plataforma prometedora para superar estos obstáculos facilitando difusión pasiva y transporte mediado por receptores a través de la BHE. El polisorbato 80, un surfactante no iónico, ha demostrado adsorber apolipoproteínas séricas (ApoE, ApoB), imitando partículas de lipoproteínas de baja densidad que pueden secuestrar receptores LDL en células endoteliales y atravesar la BHE. El pululano modificado con colesterol (CHP) se autoensambla en nanopartículas anfifílicas con un núcleo hidrofóbico adecuado para encapsular fármacos lipofílicos y una cubierta hidrofílica que reduce opsonización.

En este estudio, combinamos CHP y PS para crear una nanopartícula de doble función que encapsula DZP, promueve cruce de la BHE y entrega niveles terapéuticos sostenidos al cerebro mientras mitiga toxicidad por Aβ in vitro.

Materiales y Métodos

Materiales

CHP (preparado en casa), donepezilo (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.), polisorbato 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute), tinte verde indocianina (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.), ratones negros C57BL/6, Aβ25–35 (US Sigma), reactivo MTT (US Sigma), kit lactato deshidrogenasa (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), kit tinción AO/EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.), líneas celulares PC12 (feocromocitoma suprarrenal de rata) y SH-SY5Y (neuroblastoma humano) (ATCC).

Preparación de Nanopartículas

Tres proporciones DZP:CHP (10:20, 4:20, 2:20 p/p) se disolvieron en medios acuosos y dializaron (PMCO 1 kDa) para formar nanopartículas. PS (0,7 mM) se añadió a 10 mL de cada suspensión de nanopartículas, agitó 1 h y sonicó (100 W, pulsos de 2 s) hasta homogeneidad. Las nanopartículas PS-DZP-CHP recubiertas con PS se filtraron para eliminar impurezas.

Caracterización

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) confirmaron morfología esférica. Dispersión dinámica de luz (DLS) midió tamaño y potencial zeta. Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) evaluó afinidad de unión y cobertura de PS. Liberación in vitro se evaluó mediante diálisis contra PBS pH 7,4 a 37 °C, muestreando hasta 72 h y cuantificando DZP por UV-vis (312 nm) contra curva estándar.

Direccionamiento Cerebral In Vivo

Nanopartículas DZP-CHP marcadas con ICG se prepararon por diálisis de 400 mg CHP-DZP con 20 mg ICG, seguido de sonicación. Nanopartículas PS-ICG-DZP-CHP se formularon como arriba. Diez ratones negros recibieron inyecciones en vena cola de 200 µL (200 µg/mL) de PS-ICG-DZP-CHP o ICG-DZP-CHP. Imágenes de fluorescencia (excitación 765–815 nm, emisión 815–845 nm) capturaron distribución corporal y de órganos 30 min post-inyección.

Distribución en Tejidos

Cuarenta y cinco ratones C57BL/6 se asignaron a grupos de DZP libre, DZP-CHP y PS-DZP-CHP (0,25 mg/kg, IV). Sangre y órganos (cerebro, corazón, hígado, riñón) se recolectaron a 1, 3, 6 h. Homogenizados se extrajeron con metanol, centrifugaron y analizaron por LC-MS/MS (fase móvil: agua con 0,1 % ácido fórmico / metanol 70:30, flujo 0,3 mL/min). Cuantificación usó monitoreo de reacción múltiple (MRM) con ionización electrospray positiva.

Modelos Celulares y Ensayos de Neuroprotección

Células PC12 y SH-SY5Y se cultivaron en DMEM + 10 % FBS, sembradas a 1×10⁴ células/mL (placas 96 pozos) o 2–3×10⁵ células/mL (otros ensayos). Aβ25–35 (20 µM) indujo neurotoxicidad. Viabilidad celular se midió por MTT (490 nm). Liberación LDH (450 nm) evaluó integridad de membrana. MMP se evaluó con fluorescencia de Rodamina 123. Morfología apoptosis se visualizó vía tinción AO/EB.

Resultados

Caracterización de Nanopartículas

CHP solo formó esferas ~257 nm (zeta –2,8 mV). La carga de DZP aumentó ligeramente el tamaño a 260–274 nm y desplazó zeta a –5 a –9 mV, dependiendo de la proporción de fármaco. La formulación 1:5 DZP:CHP (DCN2) alcanzó la mayor encapsulación de fármaco (86,5 %) y carga (13,4 %). El recubrimiento con PS aumentó el tamaño a 335 nm y zeta a –2,2 mV, confirmando modificación superficial exitosa.

Afinidad de Unión de PS

ITC reveló afinidades de unión de PS de 1,47×10⁵, 2,98×10⁵ y 3,67×10⁵ M⁻¹ para DCN1, DCN2, DCN3, respectivamente, con ratios de cobertura de 2,65, 2,70 y 1,49 mol PS por mol nanopartícula. Interacciones endotérmicas, impulsadas por entropía sugieren asociación hidrofóbica.

Liberación In Vitro

DZP libre se disolvió rápidamente. PS-DZP-CHP liberó 35 % en 6 h, 70 % a 24 h y 90 % a 72 h, indicando liberación sostenida. DZP-CHP sin recubrir liberó más rápido, probablemente debido a blindaje PS más débil.

Direccionamiento Cerebral

Imágenes de fluorescencia mostraron señal insignificante en controles de ICG libre. PS-ICG-DZP-CHP produjo fluorescencia cerebral brillante 30 min post-inyección, con señal mínima en órganos periféricos. Cuantificación tisular confirmó concentración cerebral de DZP 3-4 veces mayor para PS-DZP-CHP versus DZP libre, y pico retardado (6 h vs 1 h) indicativo de liberación sostenida.

Unión a ApoE

MST arrojó K_D de 3,63 µM para interacción PS-ICG-CHP–ApoE, apoyando transcitosis mediada por receptores a través de BHE.

Neuroprotección en Modelos Celulares

Aβ25–35 a 20 µM redujo viabilidad de PC12 a 49,5 % y SH-SY5Y a 49,7 %. Pretratamiento con DZP-CHP (5 µM, 10 µM) restauró viabilidad a 68-75 % (vs 48 % con DZP libre). Liberación LDH disminuyó 30 % con DZP-CHP, y MMP permaneció >80 % de control, mientras DZP libre solo alcanzó ~70 %. Tinción AO/EB reveló morfología apoptótica reducida en grupos DZP-CHP.

Discusión

Nuestras nanopartículas DZP-CHP recubiertas con PS lograron entrega cerebral dirigida, liberación sostenida de fármaco y eficacia neuroprotectora superior in vitro. La alta afinidad de PS y adsorción de ApoE facilitan transcitosis mediada por receptor LDL a través de la BHE, mientras el núcleo CHP proporciona un reservorio lipofílico que reduce agregación de Aβ. Comparado con DZP libre convencional, la plataforma de nanopartículas extiende intervalos de dosificación, potencialmente mejorando adherencia del paciente y reduciendo efectos secundarios. Futuros estudios in vivo se centrarán en farmacocinética, toxicidad y eficacia terapéutica en modelos animales de EA.

Conclusión

Nanopartículas de pululano modificado con colesterol cargadas con donepezilo y recubiertas superficialmente con polisorbato 80 demuestran carga óptima de fármaco (1:5 DZP:CHP), liberación sostenida, cruce eficiente de la BHE y neuroprotección mejorada contra toxicidad inducida por Aβ. Estos hallazgos respaldan a PS-DZP-CHP como nanomedicina prometedora para tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.