Nanopartículas biodegradables, sensibles a tumores, para imagen dual de cáncer de mama

Resumen

Los agentes de contraste de ultrasonido (US) llenos de gas colapsan fácilmente en el cuerpo, y el gas puede desbordarse fácilmente, lo que limita la efectividad de la imagen US. Para abordar este problema, se desarrolló un sistema multi-modo inyectable generador de gas que lleva el agente de contraste negativo MR Fe₃O₄, el colorante fluorescente Cy5.5, y el donante liberador de CO₂ (Na₂CO₃). Las nanopartículas pueden generar continuamente gas dióxido de carbono (CO₂) en tejido tumoral ácido en el cuerpo, dando al tumor una fuerte señal de eco bajo imagen ultrasónica. Además, las nanopartículas confieren excelentes efectos para imagen MR y fluorescencia del tejido tumoral. Los resultados indican que este sistema NP sensible a pH proporciona buenos efectos en imagen MR/US/fluorescencia. Este estudio proporciona una referencia útil para imagen tumoral multi-modo.

Introducción

En práctica clínica, las microburbujas se aplican principalmente como agentes de contraste de ultrasonido para imagen en tiempo real de varios órganos y vasos sanguíneos [1,2,3]. Los agentes de contraste de ultrasonido tradicionales típicamente consisten en materiales como lípidos o proteínas que encierran aire o gases perfluorocarbono. Las especies de gas encapsuladas en las microesferas tienen baja estabilidad en la sangre y vida media corta debido a la rápida difusión de defectos de microburbujas [4,5,6]. Además, dado que el tamaño de partícula de microburbujas llenas de gas es usualmente grande (aproximadamente 1 a 8 μm), es difícil que las microburbujas penetren en el ambiente tumoral huésped por extravasación tisular. Por tanto, la aplicación actual de burbujas de tamaño micrónico en imagen intravascular es limitada [7]. Los agentes de contraste de ultrasonido ideales deberían exhibir generalmente tamaño óptimo para transporte a través del espacio vascular tisular, duración adecuada de efecto acústico, buen dirigido y biocompatibilidad, y fácil excreción del cuerpo [8, 9]. El concepto de "nanopartículas generadoras de gas" fue propuesto en investigación previa, y tales nanopartículas tienen potencial para uso en imagen de contraste ultrasónico [10,11,12]. Estas nanopartículas generadoras de gas son superiores a las microburbujas llenas de gas actuales en rendimiento, y el gas generado continuamente permite imagen ultrasónica intensa. Las nanopartículas generadoras de gas pueden mejorar permeación y retención, y pueden circular establemente en la sangre y acumularse efectivamente en tejido tumoral [13, 14].

Sigue siendo un desafío detectar tumores diminutos y ocultos por métodos de imagen tradicionales, como imagen por resonancia magnética (MRI), tomografía computarizada (CT) y ultrasonido, limitados por largos tiempos de adquisición, alta dosis de radiación y pobre sensibilidad [15, 16]. Es necesario integrar diferentes métodos de imagen y desarrollar tecnología de imagen multi-modal para lograr sinergia integrada para detección temprana de cáncer [17,18,19]. Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (Fe₃O₄) pueden usarse como agentes de contraste negativo MRI en imagen ponderada T2 [20, 21]. Fe₃O₄ tiene propiedades generales atractivas, incluyendo tamaño de partícula pequeño, fuerte penetrabilidad, alta magnetización, buen metabolismo y toxicidad relativamente baja [22, 23]. Agentes de contraste Fe₃O₄ para diagnóstico MRI de cáncer en etapa temprana han sido extensamente estudiados debido a su alta relajación y contraste [24,25,26]. Además, imagen de fluorescencia en tiempo real tiene excelente resolución y puede ser método valioso para definir estadificación tumoral, guiar resección tumoral y monitorear efectos de tratamiento [27, 28].

Aquí, estas nanopartículas están principalmente encapsuladas por ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para uso como material biosafe [29, 30]. Las partículas PLGA se modifican con péptido RGD para permitir unión a integrina αvβ3 en superficie de células de cáncer de mama y con Cy5.5 como colorante fluorescente para imagen in vivo, y se encapsulan con Fe₃O₄ para actuar como agente de contraste negativo T2 en MRI (Esquema 1a). Debido a la glucólisis upregulada en tejido tumoral, que podría producir más ácido láctico y protones en ambiente extracelular, el pH de tejidos tumorales (6,8–7,2) es menor que el de tejidos normales (pH 7,4) [31,32,33]. Así, diseñamos carbonato de sodio (Na₂CO₃) en PLGA para producir burbujas CO₂ en el pH menor de tejidos tumorales para imagen ultrasónica. Para verificar su prometedora aplicación en imagen tumoral, las propiedades comprehensivas de estas nanopartículas multi-modo para imagen in vitro se caracterizaron sistemáticamente, incluyendo su citotoxicidad, especificidad de dirigido y biodistribución en tejido tumoral, por tres modos de imagen.

Nanopartículas biodegradables, sensibles a tumores, para imagen dual de cáncer de mama

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se diseñaron como agentes de contraste multi-modo dirigidos por RGD encapsulando polímero biocompatible PLGA con Fe₃O₄ y Na₂CO₃ y agente dirigido a integrina via enlace químico biodegradable (Esquema 1b).

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión mostraron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD eran esferas claras con partículas de óxido de hierro dispersas uniformemente visibles en la cáscara (Fig. 1a). El tamaño hidrodinámico promedio de NPs se midió como 117,6 nm por dispersión dinámica de luz, y el índice de polidispersidad promedio fue 0,234 (Fig. 1b). La carga superficial de NPs se confirmó por mediciones de potencial zeta como −21,7 mV (Fig. 1c). Medición de espectro de fluorescencia reveló que Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD tenía longitud de onda de emisión máxima a 685 nm, indicando que Cy5.5 se encapsuló exitosamente en núcleo PLGA (Fig. 1d). Los valores de magnetización de saturación para NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD y NPs libres Fe₃O₄ fueron 32,6 y 42,5 emu/g, respectivamente (Fig. 1e). Estos hallazgos indicaron característica superparamagnética de las nanopartículas a temperatura ambiente. El espectro FITR de Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD mostró que vibración de estiramiento N-H y pico de absorción –OH aparecieron alrededor de 3432 cm⁻¹. Además, encontramos una realce (1628 cm⁻¹) de vibración de estiramiento C=O. Comparado con NPs no dirigidas, el pico característico (carboxilo) a 1735 cm⁻¹ de NPs dirigidas se redujo significativamente. Los resultados mostraron el enlace entre grupo carboxilo en superficie de microesfera y grupo amino en péptido RGD. La unión in vitro de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se muestra en Fig. 1f.

Unión in vitro de NPs Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD

La integrina αvβ3 se expresa generalmente alta en células endoteliales de tumor de cáncer de mama y puede promover metástasis tumoral [33,34,35,36]. La inmunofluorescencia celular para expresión de αv integrina en células MDA-MB-231 fue mucho mayor que en células MCF-7; células A549 sirvieron como controles positivos (Fig. 2a). La captación celular de NPs se estudió por CLSM (Fig. 2b). Las NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD mostraron tasa de unión mucho mayor a células MD-MB-231 que NPs no dirigidas. Las imágenes de fluorescencia también revelaron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se unieron al citoplasma celular, e imágenes fusionadas mostraron mismas ubicaciones que expresión de αv integrina [37, 38].

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad in vitro de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se estimó en células MDA-MB-231 usando ensayo CCK8, mientras células A549 y MCF-7 tratadas con NPs se usaron como controles (Fig. 2c). En rango de concentraciones de Fe de 5–80 μg/mL, la viabilidad celular de A549 y MB231 no se redujo significativamente, y ambas estuvieron por encima de 70 %. En contraste, células MCF-7 mostraron disminución significativa en viabilidad celular a aproximadamente 50 % a concentraciones de Fe superiores a 40 μg/mL. Los resultados CCK8 demostraron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD mostraron citotoxicidad significativamente menor en células MDA-MB-231 sobre rango de concentración dado.

Imagen de contraste in vitro

Usamos un fantasma de gel agar para estudiar el rendimiento de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD in vitro a diferentes valores pH (Fig. 3a). Las imágenes de contraste ultrasónico de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD fueron significativamente realzadas a pH ligeramente ácido (pH 6,8) comparado con pH 7,2, probablemente porque pH 7,2 no produce suficientes burbujas CO₂ para imagen ultrasónica. En contraste, cuando NPs estaban en ambiente ligeramente ácido, suficientes burbujas podían generarse para imagen ultrasónica. Esta característica es relevante a tumores, que exhiben alta heterogeneidad tisular y diversos niveles pH (pH 6,8–7,2) in vivo [32, 39, 40]. La intensidad de señal de imagen ultrasónica se analizó luego (Fig. 3b). Las razones de intensidad de señal de NP no dirigida (pH = 7), NP no dirigida (pH = 5), NP dirigida (pH = 7), y NP dirigida (pH = 5) relativas a intensidad de señal del grupo blanco fueron 112 %, 145 %, 167 %, y 178 ± 4 %, respectivamente, indicando claramente que grupo NP dirigida (pH = 5) tuvo la señal US más fuerte.

Para estudio MRI in vitro, a medida que concentración de Fe en NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD aumentaba, la intensidad de señal ponderada T2 mostró disminución significativa, indicando posibilidad de estos NPs para uso como agentes de contraste T2 MR (Fig. 3c). La tasa de relajación transversal (r2) de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se calculó en 19,597 mM⁻¹ s⁻¹. Aunque la tasa de relajación transversal (r2) de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD es menor que muchos otros agentes superparamagnéticos MRI, la composición de Fe₃O₄ puede aumentar r2, que fue 2,94 veces mayor que r2 de partículas SPIO usadas clínicamente.

Imagen de contraste ultrasónico de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

Para demostrar el potencial de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD para imagen ultrasónica en tumores, administramos inyección en vena cola de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a ratones nu con xenoinjertos de cáncer de mama y monitoreamos imágenes ultrasónicas como función de tiempo (Fig. 4a). Antes de inyección, se registraron imágenes de tumor, hígado y área subcutánea. Inmediatamente tras inyección, el área de tejidos tumorales no mostró ningún realce de contraste. Realce del área tumoral se observó a partir de 30 min tras inyección y duró 90 min. Los resultados ultrasónicos in vivo mostraron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD generaron suficientes burbujas en tejidos tumorales ácidos para producir reflectividad ecogénica para imagen ultrasónica. Como control, también obtuvimos imágenes de hígado y tejidos subcutáneos a diferentes tiempos tras inyección de NPs dirigidas. Durante todo el período de observación, no se encontró realce significativo en área de inyección subcutánea, y el realce en hígado, que disminuyó con el tiempo, fue significativamente menor que en tumores (Fig. 4b). Este resultado indica que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD circulando en el cuerpo a pH fisiológico no producen cantidad sustancial de burbujas CO₂ para realce de contraste ultrasónico.

MRI de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

Para MRI in vivo, para demostrar que NPs pueden usarse para imagen tumor-específica, NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se inyectaron directamente en tumores y músculos. Resultados mostraron que área tumoral exhibió disminución significativa en contraste T2-MR tras inyección de NPs dirigidas, y la intensidad de señal disminuyó significativamente de 8875 a 0 min a 5972 a 120 min tras inyección (Fig. 5a, b). Sin embargo, con misma cantidad de nanopartículas inyectadas, el área de músculo subcutáneo mostró disminución de señal T2 mucho menor. Este hallazgo demuestra la efectividad de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD con agentes de contraste T2-MR hiper-sensibles dirigidos por integrina para uso en imagen tumor-dirigida. En grupo de inyección vena cola, imagen T2-MR también mostró disminución obvia de contraste en tumor a 24 h post-inyección, demostrando alta acumulación tumoral de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD (Fig. 5c, d). Además, se observaron señales T2 disminuidas en hígado y riñones, indicando que iones de hierro en NPs podrían eliminarse rápidamente del cuerpo. Por tanto, MRI reveló que nanopartículas Fe₃O₄ envueltas en PLGA exhibieron dirigido tumoral pasivo eficiente via efecto permeabilidad y retención mejorada (EPR), especialmente dirigido mediado por RGD, pero pudieron descomponerse y excretarse rápidamente in vivo.

Imagen de fluorescencia e histología

Doscientos microlitros de NPs se inyectaron intravenosamente en ratones para imagen de fluorescencia in vivo. En grupo inyectado con NPs dirigidas por RGD, la señal de fluorescencia de Cy5.5 aumentó gradualmente en área tumoral y alcanzó pico a 4 h tras inyección, indicando que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD pueden acumularse efectivamente en tumor. En grupo no dirigido, NPs se distribuyeron por todo el cuerpo tras inyección y se eliminaron rápidamente, y no se acumularon en tumor por largo período (Fig. 6a). Los ratones fueron luego diseccionados, y órganos principales y tumores se recolectaron para imagen de fluorescencia in vitro, revelando alta captación tumoral de NPs dirigidas (Fig. 6b, c). La intensidad de fluorescencia de Cy5.5 en tumores de ratones inyectados con NPs dirigidas fue 1,5 veces la de ratones inyectados con NPs no dirigidas.

Además, el dirigido tumor-específico de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se verificó por imagen de fluorescencia de secciones tumorales congeladas (Fig. 7a). La tinción de inmunofluorescencia de secciones tumorales con anticuerpos contra integrinas αv y β3 reveló expresión significativa de integrina αvβ3 en tejidos tumorales. La fluorescencia de αv y β3 integrina se fusionó con fluorescencia Cy5.5 de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD para obtener imagen de inmunotinción revelando colocalización. Los resultados de inmunofluorescencia en tejidos tumorales indicaron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se unen específicamente a integrina αvβ3 en cáncer de mama maligno MB231. Además, tinción H&E de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD comparado con grupo no dirigido mostró que todas las secciones de tejidos orgánicos tenían morfología patológica normal y ninguna respuesta de daño histopatológico (Fig. 7b). Todos los resultados de los análisis de citotoxicidad e histológicos anteriores indicaron que NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD no indujeron toxicidad significativa a tejidos de órganos principales in vivo, y su buena biocompatibilidad puede atribuirse razonablemente a PLGA.

Conclusiones

En conclusión, los resultados anteriores demuestran un enfoque creativo y exitoso para MRI de cáncer de mama mediante un sistema de dirigido magnético y generador de gas activado en microambiente tumoral. NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD exhiben excelente rendimiento de imagen y buena biocompatibilidad en modos de imagen MR/ultrasonido/fluorescencia. Nuestro trabajo muestra fuerte potencial para diagnóstico tumoral con imagen multi-modal mejorada.

Materiales y métodos

Materiales

Ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) (lactida:glicolida = 75:25, Mw = 20.000), colorante Cyanine5.5, y alcohol polivinílico (PVA) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). El péptido RGD fue sintetizado a medida por GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China). Nanopartículas Fe₃O₄ y carbonato de sodio (Na₂CO₃) fueron adquiridos de Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Diclorometano (CH₂Cl₂) y dimetil sulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Solarbio Company (Beijing, China). Todos los químicos fueron de grado analítico.

Síntesis de nanopartículas Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD

Primero, 12,5 mg de PLGA y 0,25 mL de cloroformo se mezclaron. Luego, 5 μL de Cy5.5, 15 μL de nanopartículas magnéticas modificadas con ácido oleico dispersadas en cloroformo (OA@Fe₃O₄, 10 mg/mL), 5 μL de carbonato de sodio (Na₂CO₃), y 1,5 mL de solución PVA 1 % se agregaron en secuencia y emulsionaron con procesador ultrasónico durante 2 min. Luego, 12,5 mL de solución PVA 0,3 % se agregó y agitó durante 3–4 h a temperatura ambiente, y 12,5 mL de solución PVA 0,4 % se agregó para agitar (500 rpm/min) toda la noche para eliminar solvente orgánico residual. La solución anterior se sometió a varios lavados de ultrafiltración con ddH₂O y luego se diluyó con buffer PB (pH = 7,4) a volumen final de 1,25 mL. Luego, 0,25 mg de EDC y 1,25 mg de NHS se agregaron a la solución mixta anterior. La mezcla se agitó durante 30 min a 25 °C y luego se lavó tres veces con ultrafiltración y resuspendió en solución buffer PB (pH = 7,4). Luego, 1,25 mg de cRGD se agregó a la solución y se agitó a 4 °C toda la noche. Para eliminar EDC, NHS y cualquier cRGD residual, la solución transparente se filtró por tubo de ultrafiltración. Finalmente, NPs Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD se resuspendieron en 1,25 mL de agua desionizada y almacenaron a 4 °C.

Caracterización de nanopartículas

Los diámetros dinámicos y potencial zeta de nanopartículas se midieron por Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). La morfología de nanopartículas se obtuvo usando microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai F20. La carga de Cy5.5 se registró por espectrómetro de fluorescencia Hitachi F-7000. FTIR se realizó usando espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (Alpha II, Bruker, Suiza). Un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM, Lake Shore 7410) se aplicó para determinar curva de histéresis de nanopartículas y Fe₃O₄ libre.

Células y animales

Células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231 fueron proporcionadas amablemente por Banco de Células Madre, Academia China de Ciencias. Las células se mantuvieron a 37 °C en 95 % aire y 5 % CO₂. Ratones hembra BALB/c (4 semanas) se adquirieron de Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. y se mantuvieron según protocolos aprobados por Centro de Animales de Laboratorio, Universidad Médica de Guangxi. Los experimentos con animales siguieron la Guía para Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por Comité de Ética de Animales de Centro de Animales de Laboratorio, Universidad Médica de Guangxi. Células de cáncer de mama MDA-MB-231 se trasplantaron en flanco derecho de ratones BALB/c (2 × 10⁶ en 200 μl células por ratón) y se permitieron crecer 10–14 días (diámetro medio 5 mm) antes de imagen.

Expresión celular de αv integrina

Inmunofluorescencia celular se realizó para confirmar alta expresión de αv integrina en células MDA-MB-231. Células A549 y MCF-7 se usaron como controles. Las células se sembraron en platos de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, USA) a 2 × 10⁴ células mL⁻¹ por 24 h. Tras incubación, las células se fijaron 20 min a temperatura ambiente con paraformaldehído 4 %. Luego, se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-integrina αv de conejo (ab179475, Abcam) a 4 °C toda la noche y anticuerpo anti-IgG de conejo 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, las células se tiñeron con DAPI. Las imágenes se adquirieron por microscopía confocal de barrido láser (TCS SP8, Leica, Alemania).

Para evaluar eficacia de dirigido de nanopartículas, se realizó estudio de captación celular usando microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Las células se sembraron en platos de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, USA) a 2 × 10⁴ células mL⁻¹ por 24 h. Luego, las células se incubaron con NPs dirigidas por RGD (30 μg mL⁻¹, 0,5 mL) a pH 7,4 por 2 h, y NPs no dirigidas se usaron como controles. Tras incubación, las células se fijaron con paraformaldehído 4 % por 20 min y luego se incubaron con anticuerpo αv. Mediante colocalización, verificamos la unión dirigida de nanopartículas a integrina en las células.

Ensayo CCK8

La biocompatibilidad de nanopartículas Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se evaluó por estudio de citotoxicidad. Células MDA-MB-231, A549 y MCF-7 se sembraron en placas de 96 pozos a 5 × 10³ células mL⁻¹ por 24 h. Luego, 0,1 mL de suspensión de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a concentraciones de Fe de 5, 10, 20, 40 y 80 μg/mL se agregó a cada pozo e incubó 24 h. Finalmente, 10 μL de solución CCK8 se agregó, y la suspensión se incubó otra 1 h. Los resultados se determinaron por lector de microplacas (Thermo Scientific, USA) a 450 nm.

Imagen ultrasónica con contraste mejorado

La imagen ultrasónica de nanopartículas se realizó usando sistema Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canadá). Las NPs dirigidas por RGD y no dirigidas se agregaron al modelo de agarosa, y PBS se usó como control. Las imágenes se registraron en modo B y modo CEUS con diferentes buffers pH de 7,2 y 6,8. El área de interés se dibujó, y el valor gris promedio se midió en imágenes modo B.

Para imagen ultrasónica in vivo, los ratones se anestesiaron con isoflurano 2 % (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China), y temperatura corporal se mantuvo a 37 °C con almohadilla calentada. Un total de 200 μL de NPs dirigidas por RGD se inyectó vía vena cola. Animales control recibieron inyección subcutánea con misma cantidad de NPs. Imágenes ultrasónicas se registraron usando transductor 7 MHz para adquirir continuamente imágenes ultrasónicas de tumores, hígados y áreas subcutáneas. La zona de foco acústico se colocó en centro de tumor con mayor sección transversal, y se obtuvo campo de visión conteniendo tumor y tejido adyacente.

Imagen por resonancia magnética

Exámenes MRI de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se realizaron usando MR 3,0 T (GE Healthcare, USA) y bobina animal (RF TECH LIMITED, China). NPs con diferentes concentraciones de Fe de 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mM se escanearon en tubos Eppendorf de 1 mL, y PBS se usó como control. MRI T2 se realizó para cada tubo usando secuencia FSE ponderada T2 (espesor de corte 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, FOV 8 × 8 cm, matriz 320 × 256). Las relajividades (r2) se calcularon por ajuste lineal del tiempo de relajación inverso como función de concentración de Fe.

Para MRI in vivo, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 3) para escaneo MR que recibieron (1) inyección local de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD dentro de tejidos musculares y tumorales subcutáneos o (2) inyección vena cola de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD. Imágenes base de ratones se tomaron antes de inyección de nanopartículas. Para grupo uno, misma cantidad de NPs se inyectó en tejidos subcutáneos y tumorales, y escaneo MRI se realizó cada 30 min para registrar transición de señal de tejidos. Para grupo dos, imagen tumoral se realizó en posiciones axial y coronal, y parámetros MR fueron mismos que para imagen in vitro. La intensidad de señal (SI) en región de interés (ROI) se midió y comparó a señales de tejidos a diferentes tiempos antes y tras inyección.

Imagen de fluorescencia tumoral

Para imagen de fluorescencia in vivo, se usó sistema de imagen de fluorescencia in vivo (FX PRO, Bruker, Suiza) para escaneo, y los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 3): (1) NPs dirigidas por RGD y (2) NPs no dirigidas. Las imágenes se capturaron cada 30 min por período de 4 h tras inyección. Posteriormente, órganos importantes y tumores se recolectaron e imaginaron, y se observó distribución de fluorescencia en órganos del cuerpo. Análisis cuantitativo de intensidad de fluorescencia se realizó usando software de imagen molecular (Bruker, Suiza). Estos órganos importantes luego se sometieron a tinción H&E para evaluar toxicidad tisular. Secciones tumorales congeladas también se sometieron a inmunotinción fluorescente con anticuerpos contra integrinas αv y β3.