Control de la translocación del ADN a través de nanoporos de estado sólido

Resolución temporal

La velocidad de translocación del ADN a través de un nanoporo de estado sólido es muy rápida, de hasta 0,01-1 μs / base [30], lo que lleva a muy pocos datos efectivos recopilados por los parches de sujeción comerciales. Como tal, no es posible distinguir todas las bases en función de la señal de corriente de bloqueo. Las velocidades de translocación del ADN de nanoporos de estado sólido de materiales 2D, como el grafeno, MoS ₂ , WS ₂ , y h-BN, se muestran en la Fig. 1. Idealmente, la velocidad de translocación del ADN en un nanoporo debe ser de 1 a 100 pb / ms para permitir un registro satisfactorio de la señal de cada nucleótido [32].

Velocidad de translocación del ADN de nanoporos de estado sólido 2D [18, 20,21,22,23, 25, 27, 31]. La línea roja punteada indica una tasa de translocación de ADN de 100 pb / ms

En este contexto, ralentizar la velocidad de translocación del ADN es un objetivo importante perseguido por muchos investigadores. Se han desarrollado varios métodos para ralentizar la translocación del ADN y mejorar la resolución temporal de la detección de nanoporos en estado sólido. El método habitual consiste en cambiar la influencia de factores experimentales como la temperatura [33], la viscosidad del electrolito [27], el voltaje de activación [34], la concentración de iones [35] y la densidad de carga superficial de un nanoporo [36] cambiando el ADN translocación a través de él. Wanunu y col. [33] se concentró en ralentizar la translocación del dsDNA a través de nanoporos de estado sólido cambiando la temperatura, el voltaje y la longitud del ADN. Además, Feng et al. [27] mostró que un sistema de gradiente de viscosidad, basado en líquidos iónicos a temperatura ambiente, se puede utilizar para controlar la dinámica de la translocación del ADN a través de MoS ₂ nanoporos, y demostró que la alta viscosidad de los líquidos iónicos a temperatura ambiente proporciona velocidades óptimas de translocación de un solo nucleótido de 373 bp / ms.

Aunque muchos enfoques tienen el potencial de reducir la velocidad de translocación del ADN y facilitar la detección de corriente iónica, todavía no pueden cumplir con los requisitos para la secuenciación del ADN. Por tanto, es necesario desarrollar métodos más radicales para controlar el paso del ADN a través de los nanoporos. Aquí, discutimos los métodos para controlar la estructura de nanoporos y el movimiento cuantitativo del ADN para mejorar la resolución temporal.

Sistema de dos nanoporos

Los investigadores han utilizado sistemas de dos nanoporos para manipular las translocaciones de moléculas de ADN, que pueden detectar de forma controlable la misma molécula muchas veces. Dos nanoporos apilados, separados por un compartimento de cavidad del tamaño de un micrómetro [37] (Fig. 2a), pueden atrapar moléculas de ADN durante un cierto período de tiempo y liberarlas de forma controlada. La dinámica de las moléculas de ADN se puede deducir de las señales de los dos poros mediante un análisis de correlación, que proporciona una prueba eléctrica directa de la translocación. Además, debido a las barreras de entropía del sistema de nanoporos de dos capas, el movimiento browniano de las moléculas de ADN puede limitarse, lo que puede mejorar la precisión de la secuenciación del ADN con nanoporos. En comparación con las técnicas de detección de una sola molécula, las moléculas de ADN se pueden medir varias veces en sistemas de nanoporos de dos capas colocando en serie varios poros en lugar de pasarlos de un lado a otro a través de un solo poro [39].

un Esquema del sistema de nanoporos de dos capas utilizado para la detección de ADN de nanoporos [37]. b Esquema del sistema de nanoporos dobles utilizado para la detección de ADN de nanoporos [38]

Los sistemas de nanoporos dobles proporcionan otro método para controlar el transporte molecular y unir moléculas de manera eficiente entre dos poros; son un enfoque mecanicista sin etiquetas para la manipulación del ADN [40]. En un sistema de nanoporos dobles, hay dos nanoporos adyacentes y direccionables de forma independiente dentro de la misma membrana de estado sólido. Durante el paso electroforético de una molécula de ADN a través de uno de los nanoporos, se puede capturar una sola molécula de ADN en ambos poros, lo que lleva a un "tira y afloja" entre los dos nanoporos [38] (Fig. 2b). Por lo tanto, se aplican fuerzas a los diferentes extremos de una molécula de ADN, lo que ralentiza e incluso detiene por completo su movimiento. El sistema de doble nanoporo abre un nuevo camino hacia la captura mecánica de ADN en nanoporos de estado sólido, y es una técnica prometedora para medir una amplia gama de biomoléculas con las ventajas de no tener etiquetas y tener una alta señal. relación ruido y bajo costo. Puede confinar y atrapar de manera eficiente las moléculas de ADN para ralentizar la translocación del ADN y también se puede utilizar para estudiar la física de este tira y afloja a nanoescala del ADN [41].

Nanopore de trampa óptica

Los nanoporos de trampa óptica permiten que las pinzas ópticas atrapen partículas de menos de decenas de nanómetros de tamaño. Hace posible la captura óptica de proteínas [42], fragmentos de ADN [43] y otras biomoléculas [44], así como pequeños virus [45]. La teoría básica detrás de los nanoporos de trampas ópticas es una trampa óptica de acción inversa autoinducida [46]. El rayo láser enfocado en la región de la matriz de nanoporos formará un campo de luz local de alta densidad de potencia en el borde de la capa de metal en el agujero. A medida que una partícula se mueve entre el campo de luz local, puede provocar un gran cambio en la transmisión óptica local, que a su vez producirá una gran fuerza óptica y dieléctrica sobre la partícula. Se utiliza una estructura de doble nanoagujero para romper el cuello de botella de tamaño de las partículas capturadas. Muhammad y col. [47] demostró el uso potencial de nanoporos trampa óptica con nanopartículas de sílice y Au de 20 nm. La forma de mancuerna del nanoagujero doble se molió en la película de Au y se perforó un nanoporo de 25 nm a través del Si _x suspendido N _y membrana en el medio del doble nanoagujero, como se muestra en la Fig. 3a. La fuerza electroforética que impulsa las nanopartículas a través del nanoporo, al pasar por el borde del agujero, la fuerza plasmónica de acción inversa autoinducida existente entre las puntas del nanoagujero doble se opuso a la fuerza electroforética, reduciendo la velocidad de las nanopartículas. Los resultados mostraron que el atrapamiento óptico extendió el tiempo de translocación electroforética en cuatro órdenes de magnitud. Kim y col. [43] realizó la captura óptica de ADN plasmídico y ADN lambda mediante el uso de estructuras nanoplásmicas de nanoporos individuales. La tecnología tiene aplicaciones potenciales para la detección de ADN y se pueden configurar múltiples campos de luz local para realizar una detección en paralelo. Sin embargo, la oscilación de la corriente de iones de alta frecuencia puede afectar los resultados de detección de corriente del ADN. Esto puede deberse a la competencia entre las fuerzas de retroacción electroforéticas y autoinducidas que hacen que las nanopartículas floten hacia arriba y hacia abajo a través de la boca del nanoporo.

un Esquema del chip de nanoporos de trampa óptica [47]. b Esquema del sistema de retroacción autoinducido

Pinzas ópticas

Las pinzas ópticas se pueden utilizar para controlar la translocación molecular a través de nanoporos y se han utilizado comúnmente en los últimos años. En 2006, Keyser et al. [48] ​​demostró por primera vez un tira y afloja molecular entre las fuerzas electroforéticas y mecánicas mediante la aplicación de pinzas ópticas para controlar la translocación del ADN a través de SiN _x nanoporos. Este sistema actúa como un simple resorte Hooke, y la fuerza de tensión en el cordón se puede calcular según la ley de Hooke: F _ot =−k _trampa Z , donde F _ot es la fuerza óptica, k _trampa es la rigidez de la trampa a lo largo de la dirección de desplazamiento, y Z es la deformación lineal del cordón [48]. El método de pinzas ópticas, que atrapa una perla de poliestireno atada al ADN en el cruce de un rayo láser enfocado, puede manipular la perla de poliestireno atada al ADN en tres dimensiones y tiene un rango de pico-newton de sensibilidad a la fuerza, como se muestra en la Fig. 4a . Para atrapar el ADN translocado dentro del nanoporo, la fuerza de tensión se ajustó para equilibrar la fuerza del campo eléctrico ( F _el ) en el ADN. Por lo tanto, la tensión se puede utilizar tanto para reducir la velocidad de translocación del ADN como para extraer la molécula de ADN de un nanoporo [52]. Este sistema permite un muestreo espacial simultáneo y mediciones de fuerza de alta resolución de ácidos nucleicos y proteínas, lo que ha logrado un progreso significativo en la secuenciación del ADN. Sin embargo, la técnica de las pinzas ópticas adolece de varias dificultades fundamentales. Primero, es difícil escalar hasta una gran cantidad de nanoporos. En segundo lugar, el calentamiento causado por el láser en las pinzas ópticas impacta fuertemente en la corriente iónica a través de un nanoporo y el nivel de ruido, lo que requiere que la perla atrapada ópticamente esté a varios micrómetros de distancia del nanoporo [53].

un Esquema de pinzas ópticas utilizadas para la detección de ADN por nanoporos [48]. Cuando el sistema de pinzas ópticas está en equilibrio, la fuerza óptica (F _ot ) es igual a la fuerza del campo eléctrico (F _el ). b Esquema de pinzas magnéticas utilizadas para la detección de ADN por nanoporos [49]. Cuando el sistema de pinzas magnéticas está en equilibrio, la fuerza magnética (F _Mt ) es igual a la fuerza del campo eléctrico (F _el ). c Esquema de AFM utilizado para la detección de ADN de nanoporos [50]. d Esquema de TFFS utilizado para la detección de ADN de nanoporos [51]

Pinzas magnéticas

Las pinzas magnéticas proporcionan otra forma de controlar la translocación del ADN mediante la fuerza de tensión, y se ha demostrado que la técnica de las pinzas magnéticas es eficaz para ralentizar la translocación del ADN [49]. En este sistema, como se muestra en la Fig. 4b, las moléculas de ADN se pueden unir a una perla magnética del tamaño de un micrómetro utilizando una fuerte interacción oro-tiol [54] o estreptavidina-biotina [49]. Luego, el extremo libre del ADN se puede capturar en el nanoporo mediante un campo eléctrico aplicado. Posteriormente, se pueden usar dos imanes con un pequeño espacio para crear un gradiente de campo magnético. Esta técnica puede equilibrar la fuerza eléctrica sobre el ADN atrapado para reducir las velocidades de translocación e incluso la electroforesis inversa. En comparación con las pinzas ópticas, las pinzas magnéticas son un candidato prometedor para la espectroscopia de fuerza masivamente paralela. En este sistema, cientos de perlas y, por lo tanto, moléculas de ADN se pueden controlar simultáneamente dentro de cientos de nanoporos, que es fácilmente escalable a muchos nanoporos direccionables. Esto puede acelerar el proceso analítico en órdenes de magnitud. Sin embargo, en comparación con las pinzas ópticas, una desventaja obvia del enfoque de las pinzas magnéticas es la falta de control tridimensional de las moléculas [55].

Sonda de detección de fuerza

Aunque se ha logrado un progreso significativo en el control de la velocidad de translocación del ADN mediante pinzas ópticas y pinzas magnéticas, los métodos de atrapamiento de perlas tienen un problema con el movimiento browniano que dificulta el control del movimiento de la perla con una resolución de menos de 10 nm [51] . Para superar esto, se ha utilizado AFM para controlar la velocidad de translocación del ADN [50], y también puede medir simultáneamente la fuerza y ​​la corriente de bloqueo. En un estudio que utilizó este sistema, como se muestra en la Fig. 4c, el ADN se ató a la punta de una sonda AFM y luego se fijó en el soporte de la sonda. Controlando el movimiento de la sonda, la translocación del ADN podría controlarse para reducir su velocidad e incluso invertir la electroforesis. Además, al retraer la punta a una altura por encima de la superficie correspondiente a la longitud de la molécula, se pueden repetir las mediciones. Con la ayuda de AFM, la detección de ADN ha avanzado en la práctica y la teoría porque la resolución de detección puede mejorarse en gran medida mediante las señales combinadas de la corriente de bloqueo y las mediciones de fuerza de AFM [56]. Sin embargo, todavía existe un obstáculo en la aplicación de técnicas de nanoporos en la detección de ADN, a saber, la ocurrencia intermitente de fluctuaciones regulares en la fuerza (y la corriente) cada 0.35-0.72 nm cuando una molécula de ADN se desliza de una manera relativamente sin fricción a través de un nanoporo. Estas fluctuaciones se atribuyen a los nucleótidos individuales que se trasladan a través del nanoporo en un movimiento similar a un torniquete [50].

Los estudios han demostrado que un diapasón, que puede utilizarse como sensor de detección de fuerza, puede controlar el ADN para que pase a través de un nanoporo a una velocidad subnanométrica [51, 57]. En un estudio que utilizó este aparato integrado, como se muestra en la Fig. 4d, se unió una molécula de ADN a la punta de una sonda que estaba pegada a una de las puntas de un diapasón. Se utilizó un sistema de nanoposicionamiento, que posee una precisión subnanométrica, para sujetar el diapasón [51]. La posición de la punta de la sonda puede detectarse mediante el sensor de fuerza de retroalimentación basado en el diapasón y controlarse manipulando el sistema de posicionamiento nanométrico. Esta velocidad de movimiento es 10 veces más lenta que la del ADN manipulado con pinzas ópticas y 1000 veces más lenta que el ADN que pasa libremente a través de nanoporos de estado sólido [57]. En comparación con el AFM convencional, un diapasón puede proporcionar un movimiento de exploración más rápido y poseer una alta sensibilidad a la fuerza cuando se sumerge en el líquido. Al incorporar TFFS con un nanoporo, la corriente iónica a través de un nanoporo, la posición de la punta y la amplitud vibratoria de la punta se pueden medir simultáneamente durante el paso de una molécula de ADN a través del nanoporo.

Sonda Si

Todos los métodos anteriores, a saber, pinzas magnéticas, pinzas ópticas, AFM y TFFS, necesitan escanear la posición del nanoporo. Tienen que ubicar el nanoporo dentro de la longitud efectiva del ADN para asegurarse de que el ADN pueda pasar a través del nanoporo. El direccionamiento de nanoporos es una parte importante de estos métodos, pero es difícil [32] conectar el ADN a una gran superficie de una sonda de silicio (Fig. 5), más grande que el área del chip, lo que significaba que podían insertar fácilmente el ADN inmovilizado en un nanoporo sin escanear la ubicación del nanoporo en la membrana. Se ha demostrado la viabilidad de utilizar una sonda de Si con ADN inmovilizado y un controlador de posición para controlar el movimiento del ADN dentro y fuera de los nanoporos. La dificultad de este método es que la sonda de Si se sumerge en la solución y se conecta al ADN mediante el acoplamiento de péptidos. La densidad del ADN en la superficie de la sonda es difícil de controlar, por lo que es probable que ocurran varios ADN que atraviesan un nanoporo al mismo tiempo, lo que afecta la corriente de detección.

Esquema del sistema de sonda de Si inmovilizado con ADN utilizado para la detección de ADN con nanoporos [32]

Pinzas ópticas, pinzas magnéticas, microscopía de fuerza atómica (AFM) y detección de fuerza basada en diapasón (TFFS) pueden detectar las fuerzas reales y la posición de la molécula en el nanoporo, que promete controlar el paso del ADN a través de los nanoporos con la velocidad adecuada. La dificultad de abordar los nanoporos se evita mediante el uso de una sonda de Si. Además, el uso de un sistema de dos nanoporos es un método factible para controlar y ralentizar el paso del ADN a través de los nanoporos. Además, un nanoporo de trampa óptica tiene potencial para la detección de ADN en el futuro. Aquí, resumimos la velocidad de translocación del ADN de un nanoporo de estado sólido integrado con algunos métodos de control de ADN, como un sistema de dos nanoporos, un nanoporo de trampa óptica, pinzas ópticas, pinzas magnéticas, AFM, TFFS y sonda de Si (Tabla 1) .