Nanohidrogel Basado en ADN con Potente Actividad Inmunoestimulante Antitumor

Resumen

Los oligodesoxinucleótidos CpG no metilados (CpG-ODN) son potentes activadores de inmunidad innata y adaptativa, sin embargo su rápida degradación en suero limita utilidad clínica. Diseñamos nanohidrogeles CpG-MCA por amplificación de cadena multi-primada (MCA), generando hidrogeles ricos en repeticiones CpG en tándem. Los geles CpG-MCA resultantes resisten degradación nucleasa, son internalizados eficientemente por macrófagos RAW264.7 y desencadenan secreción robusta de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6). En co-cultivo con células glioma humano U251, geles CpG-MCA suprimieron marcadamente proliferación tumoral, superando CpG-ODN convencional y geles CpG-RCA. Estos hallazgos demuestran que nanohidrogeles CpG-MCA son un inmunoestimulante potente, biocompatible con fuerte actividad antitumoral.

Introducción

ADN bacteriano conteniendo motivos CpG no metilados sirve como adyuvante y agente anticancerígeno efectivo al involucrar receptor Toll-like 9 (TLR9) en células dendríticas, macrófagos y otras células inmunes. Sin embargo, CpG-ODN es propenso a adsorción proteica y digestión nucleasa, comprometiendo su estabilidad y potencia in vivo. Encapsulación en vehículos de entrega o autoensamblaje en nanoestructuras ADN de orden superior ha mejorado estabilidad y captación celular, pero desafíos como citotoxicidad y carga limitada permanecen.

Nanomateriales ADN —tetraedros, redes en forma X y redes hidrogel— han mostrado internalización celular mejorada e inducción citoquina comparado con oligonucleótidos lineales. Amplificación por círculo rodante (RCA) produce hidrogeles nanoflor que protegen motivos CpG y potencian señalización inmune. Basándonos en este concepto, empleamos amplificación de cadena multi-primada (MCA) para producir hidrogeles CpG-MCA, que contienen miles de repeticiones CpG y forman estructuras nanoflor. Hipotetizamos que estos hidrogeles proveerán estabilidad, captación e inmunoestimulación superiores, inhibiendo así crecimiento tumoral sólido.

Materiales y Métodos

Materiales

Todos los oligonucleótidos se sintetizaron (Sangon Biotech, Shanghai) y purificaron por HPLC. Reactivos para MCA y RCA, incluyendo polimerasa ADN phi29, ligasa T4 ADN, dNTPs y buffers, se obtuvieron de Thermo Fisher y New England Biolabs. Líneas celulares RAW264.7 (macrófago ratón) y U251 (glioma humano) provinieron de Academia China Ciencias. Kits ELISA (R&D Systems) y CCK-8 (Dojindo) se usaron para cuantificación citoquinas y ensayos viabilidad.

Preparación Plantillas ADN Circulares

ADN monocatenario fosforilado (SS-DNA) conteniendo primers CpG se recoció a 95 °C 5 min y enfrió a 4 °C. Ligasa se añadió overnight a 4 °C para formar plantillas circulares; enzimas se inactivaron a 75 °C 10 min.

Construcción Hidrogeles CpG-MCA y CpG-RCA

Alícuota 10 µL plantilla circular se mezcló con 1× buffer phi29, 4 mM dNTPs y 5 U polimerasa phi29 a volumen 50 µL. Incubación 30 °C 12 h produjo gel RCA (R12). Para MCA, tras 4 h RCA, 500 pM primers 2 y 3 se añadieron y mezcla incubó tiempo restante (R4M4 y R4M8). Polímeros se inactivaron calor 65 °C y purificaron por ultrafiltración.

Caracterización

Electroforesis gel agarosa confirmó formación hidrogel. TEM y SEM revelaron morfologías nanoflor 100 nm a varios micrómetros. Citotoxicidad se evaluó por CCK-8; captación se visualizó con marcado Cy5 y microscopía confocal; secreción citoquinas se midió por ELISA; expresión génica se cuantificó por qRT-PCR.

Ensayo Estabilidad

Hidrogeles se incubaron en 10% FBS-DMEM o PBS a 37 °C; ADN residual se cuantificó por NanoDrop, y patrones degradación se monitorearon por electroforesis gel agarosa.

Co-cultivo con Células U251

Células RAW264.7 se sembraron en cámara superior Transwell; células U251 en cámara inferior. Tras 24 h tratamiento con CpG-ODN, CpG-RCA o geles CpG-MCA, proliferación U251 se evaluó por ensayo clonogénico.

Resultados y Discusión

Formación plantillas circulares y amplificación exitosa confirmada por gel agarosa: producto MCA (R4M4/R4M8) y producto RCA (R12) mostraron retención alto peso molecular y apariencia nanoflor en TEM/SEM.

Imagen confocal demostró geles CpG-MCA internalizados eficientemente por células RAW264.7, con intensidad fluorescencia media >10× que CpG-ODN lineal (p < 0.0001), indicando captación superior debido arquitectura nanoflor.

Estudios estabilidad mostraron geles CpG-MCA retuvieron ~85% contenido ADN tras 24 h en 10% FBS-DMEM, mientras CpG-ODN lineal degradó >90% dentro 12 h, subrayando efecto protector matriz hidrogel.

Ensayo inmunoestimulación in vitro reveló geles CpG-MCA indujeron secreción TNF-α e IL-6 a niveles 3-27× mayores que CpG-ODN (p < 0.0001). Notablemente, R4M8 produjo respuesta citoquina más fuerte, correlacionando con mayor número copias CpG.

Análisis expresión génica mostró regulación al alza significativa transcritos TLR9, TNF-α e IL-6 en células tratadas CpG-MCA, junto con aumento CD86 y disminución marcadores superficie CD206, indicando cambio hacia fenotipo pro-inflamatorio M1.

Ensayo migración (Transwell y herida por rascado) revelaron geles CpG-MCA estimularon migración RAW264.7 más que CpG-ODN, mejorando potencial infiltración células inmunes en tumores.

Co-cultivo con células glioma U251 demostró reducción pronunciada formación clon: R4M8 logró 12% tasa formación clon relativo control CpG-ODN (p < 0.001), confirmando potente actividad antitumoral mediada por liberación citoquinas inducida CpG-MCA.

Conclusiones

Hemos diseñado exitosamente nanohidrogeles CpG-MCA que incorporan miles de motivos CpG, confiriendo resistencia nucleasa, captación eficiente macrófagos e inducción robusta citoquinas tipo Th1. Estos hidrogeles suprimen efectivamente proliferación células glioma in vitro, destacando su promesa como inmunoestimulante biocompatible para terapia cáncer.

Disponibilidad Datos y Materiales

Conjuntos datos que respaldan este estudio disponibles del autor correspondiente bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

CpG-MCA gels

Hidrogel ADN generado por amplificación cadena multi-primada

CpG-RCA gel

Hidrogel ADN generado por amplificación círculo rodante

MCA

Amplificación cadena multi-primada

R12

Gel CpG derivado RCA

R4M4, R4M8

Hidrogeles CpG-MCA con 4 u 8 extensiones primer

R12-C, R4M4-C, R4M8-C

Hidrogeles careciendo motivos CpG