Síntesis de ADN

Antecedentes

La síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) es un proceso mediante el cual se hacen copias de cadenas de ácido nucleico. En la naturaleza, la síntesis de ADN tiene lugar en las células mediante un mecanismo conocido como replicación del ADN. Usando ingeniería genética y química enzimática, los científicos han desarrollado métodos artificiales para sintetizar ADN. El más importante de ellos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Desarrollada por primera vez a principios de la década de 1980, la PCR se ha convertido en una industria de miles de millones de dólares y la patente original se vende por 300 millones de dólares.

Historial

El ADN fue descubierto en 1951 por Francis Crick, James Watson y Maurice Wilkins. Usando datos de cristalografía de rayos X generados por Rosalind Franklin, Watson y Crick determinaron que la estructura del ADN era la de una doble hélice. Por este trabajo, Watson, Crick y Wilkins recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962. A lo largo de los años, los científicos trabajaron con el ADN tratando de descifrar el "código de la vida". Descubrieron que el ADN servía como código de instrucción para las secuencias de proteínas. También encontraron que cada organismo tiene una secuencia de ADN única y podría usarse con fines de detección, diagnóstico e identificación. Una cosa que resultó ser limitante en estos estudios fue la cantidad de ADN disponible de una sola fuente.

Una vez que se determinó la naturaleza del ADN, los científicos pudieron examinar la composición de los genes celulares. Un gen es una secuencia específica de pares de bases de ADN que proporcionan el código para la construcción de una proteína. Estas proteínas determinan los rasgos de un organismo, como el color de ojos o el tipo de sangre. Cuando se aisló un determinado gen, se hizo deseable sintetizar copias de esa molécula. Una de las primeras formas en que se sintetizó una gran cantidad de ADN específico fue mediante la ingeniería genética.

La ingeniería genética comienza combinando un gen de interés con un plásmido bacteriano. Un plásmido es una pequeña porción de ADN que se encuentra en muchas bacterias. El ADN híbrido resultante se llama ADN recombinante. Este nuevo plásmido de ADN recombinante se inyecta luego en células bacterianas. Luego, las células se clonan dejándolas crecer y multiplicarse en un cultivo. A medida que las células se multiplican, también lo hacen las copias del gen insertado. Cuando la bacteria se ha multiplicado lo suficiente, se pueden aislar las múltiples copias del gen insertado. Este método de síntesis de ADN puede producir miles de millones de copias de un gen en un par de semanas.

En 1983, el tiempo necesario para producir copias de ADN se redujo significativamente cuando Kary Mullis desarrolló un proceso para sintetizar ADN llamado reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este método es mucho más rápido que los métodos conocidos anteriores que producen miles de millones de copias de una hebra de ADN en solo unas pocas horas. Comienza poniendo una pequeña sección de ADN de doble hebra en una solución que contiene ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores. La solución se calienta para separar las hebras de ADN. Cuando se enfría, la polimerasa crea una copia de cada hebra. El proceso se repite cada cinco minutos hasta que se produce la cantidad deseada de ADN. En 1993, el desarrollo de PCR de Mullis le valió el Premio Nobel de Química. En la actualidad, la PCR ha revolucionado los campos del diagnóstico médico, la ciencia forense y la microbiología. Se dice que es uno de los avances más importantes en la investigación genética.

Antecedentes

La clave para comprender la síntesis de ADN es comprender su estructura. El ADN es un polímero de cadena larga formado por unidades químicas llamadas nucleótidos. También conocido como material genético, el ADN es la molécula que transporta la información que dicta la síntesis de proteínas en la mayoría de los organismos vivos. Normalmente, el ADN existe como dos cadenas de nucleótidos unidos químicamente. Estos enlaces siguen patrones específicos dictados por las reglas de emparejamiento base. Cada nucleótido está formado por una molécula de azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato y una de las cuatro bases que contienen nitrógeno. Las bases incluyen las pirimidinas timina (T) y citosina (C) y las purinas adenina (A) y guanina (G). En el ADN, la adenina generalmente se une a la timina y la guanina a la citosina. La molécula está dispuesta en una estructura llamada doble hélice que se puede imaginar imaginando una escalera retorcida o una escalera de caracol. Las bases forman los peldaños de la escalera, mientras que las porciones de azúcar y fosfato forman los lados de la escalera. El orden en el que se enlazan los nucleótidos, llamado secuencia, se determina mediante un proceso conocido como secuenciación del ADN.

En una célula eucariota, la síntesis de ADN ocurre justo antes de la división celular a través de un proceso llamado replicación. Cuando comienza la replicación, las dos cadenas de ADN están separadas por una variedad de enzimas. Así abierta, cada hebra sirve como plantilla para producir nuevas hebras. Todo este proceso está catalizado por una enzima llamada ADN polimerasa. Esta molécula pone los nucleótidos correspondientes o complementarios en línea con cada una de las cadenas de ADN. Luego, los nucleótidos se unen químicamente para formar nuevas hebras de ADN que son copias exactas de la hebra original. Estas copias, llamadas hebras hijas, contienen la mitad de la molécula de ADN original y la mitad de una molécula completamente nueva. La replicación mediante este método se conoce como replicación semiconservadora. El proceso de replicación es importante porque proporciona un método para que las células transfieran un duplicado exacto de su material genético de una generación de células a la siguiente.

Materias primas

Las materias primas principales utilizadas para la síntesis de ADN incluyen materiales de partida de ADN, ADN polimerasa taq, cebadores, nucleótidos y la solución tampón. Cada uno de estos juega un papel importante en la producción de millones de moléculas de ADN.

La síntesis de ADN controlada comienza identificando un pequeño segmento de ADN para copiar. Por lo general, se trata de una secuencia específica de ADN que contiene el código de una proteína deseada. Este material, denominado ADN molde, se necesita en concentraciones de aproximadamente 0,1 a 1 microgramos. Debe estar altamente purificado porque incluso pequeñas cantidades de los compuestos utilizados en la purificación del ADN pueden inhibir el proceso de PCR. Un método para purificar una hebra de ADN es tratarla con etanol al 70%.

Si bien el proceso de replicación del ADN se conocía antes de 1980, la PCR no era posible porque no se conocían ADN polimerasas termoestables. La ADN polimerasa es la enzima que cataliza las reacciones involucradas en la síntesis de ADN. A principios de la década de 1980, los científicos encontraron bacterias que vivían alrededor de los respiraderos de vapor naturales. Resultó que estos organismos, llamados thermus aquaticus, tenía una ADN polimerasa que era estable y funcional a niveles extremos de calor. Este taq La ADN polimerasa se convirtió en la piedra angular de las técnicas modernas de síntesis de ADN. Durante un proceso de PCR típico, 2-3 microgramos de taq Se necesita ADN polimerasa. Sin embargo, si se usa demasiado, pueden producirse secuencias de ADN inespecíficas no deseadas.

La polimerasa construye las cadenas de ADN combinando los nucleótidos correspondientes en cada cadena de ADN. Químicamente hablando, los nucleótidos se componen de tres tipos de grupos moleculares que incluyen una estructura de azúcar, un grupo de fosfato y una base cíclica. La porción de azúcar proporciona la estructura primaria de todos los nucleótidos. En general, los azúcares están compuestos por cinco átomos de carbono con varios grupos hidroxi (-OH) unidos. Para el ADN, el azúcar es 2-desoxi-D-ribosa. La parte definitoria de un nucleótido es la base heterocíclica que está unida covalentemente al azúcar. Estas bases son grupos pirimidina o purina y forman la base del código de ácido nucleico. Se encuentran dos tipos de bases de purina que incluyen adenina y guanina. En el ADN, están presentes dos tipos de bases de pirimidina, timina y citosina. Un grupo fosfato constituye la porción final de un nucleótido. Este grupo se deriva del ácido fosfórico y está unido covalentemente a la estructura del azúcar en el quinto carbono.

La primera fase de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica la desnaturalización del ADN. Esta "apertura" de la molécula de ADN proporciona la plantilla para la siguiente molécula de ADN a partir de la cual se producirá. Con el ADN dividido en hebras separadas, la temperatura se reduce, el paso de hibridación del cebador. Durante la siguiente fase, la ADN polimerasa interactúa con las hebras y agrega nucleótidos complementarios a lo largo de toda su longitud. El tiempo necesario en esta fase es de aproximadamente un minuto por cada 1000 pares de bases.

Para iniciar la síntesis de ADN, se deben utilizar secciones de cebador cortas de ADN. Estas secciones del cebador, llamadas fragmentos de oligonucleótidos, tienen una longitud aproximada de 18-25 nucleótidos y corresponden a una sección del ADN molde. Por lo general, tienen una concentración de nucleótidos C y G de aproximadamente el 60% con una distribución uniforme. Esto proporciona la máxima eficiencia en el proceso de síntesis.

La solución tampón proporciona el medio en el que puede producirse la síntesis de ADN. Esta es una solución acuosa que contiene MgCl2, HCl, EDTA y KCI. La concentración de MgCl2 es importante porque los iones Mg2 + interactúan con el ADN y los cebadores creando complejos cruciales para la síntesis de ADN. La concentración recomendada es de uno a cuatro micromoles. El pH de este sistema es crítico, por lo que también se puede tamponar con sulfato de amonio. Para energizar la reacción, se agregan varias moléculas de energía como ATP, GTP y NTP. Estos compuestos son los mismos que utilizan los organismos vivos para impulsar reacciones metabólicas.

Otros materiales que pueden usarse en el proceso incluyen aceite mineral o cera de parafina. Una vez que se completa la síntesis de ADN, el ADN generalmente se aísla y se purifica. Algunos reactivos comunes que se utilizan en este proceso incluyen fenol, EDTA y proteinasa K.

El proceso de fabricación

La síntesis de ADN generalmente se realiza a pequeña escala en laboratorios. Implica tres procesos distintos que incluyen la preparación de muestras, el ciclo de reacción de síntesis de ADN y el aislamiento de ADN. Estos pasos de fabricación generalmente se realizan en áreas separadas para evitar la contaminación. Siguiendo estos procedimientos, los científicos pueden convertir algunas hebras de ADN en millones y millones de copias exactas.

Preparación de las muestras

• 1 Para comenzar la síntesis de ADN, se preparan las distintas soluciones. Por lo general, esto se hace en una cabina de flujo laminar equipada con una lámpara UV para minimizar la contaminación. Los científicos usan guantes nuevos durante cada paso de producción por razones similares. Normalmente, todas las soluciones de partida, excepto los cebadores, las polimerasas y los dNTP, se colocan en un autoclave para eliminar cualquier organismo contaminante. Se hacen dos soluciones separadas. Uno contiene el tampón, los cebadores y la polimerasa. El otro contiene el MgCl2 y la plantilla de ADN. Todas estas soluciones se colocan en pequeños tubos para comenzar la reacción.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis nació en Lenoir, Carolina del Norte, en 1944. Después de graduarse de Georgia Tech en 1966 con un B.S. En química, Muilis ingresó al programa de doctorado en bioquímica de la Universidad de California, Berkeley. Obtener su Ph.D. en 1973, aceptó un puesto de profesor en la Facultad de Medicina de la Universidad de Kansas en Kansas City. En 1977, asumió una beca postdoctoral en la Universidad de California, San Francisco.

Muilis aceptó un puesto como científico investigador en 1979 con una empresa de biotecnología en crecimiento, Cetus Corporation, en Emeryville, California, que sintetizaba sustancias químicas utilizadas por otros científicos en la clonación genética. Mientras estuvo allí, diseñó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica rápida y eficaz para reproducir genes específicos o fragmentos de ADN (ácido desoxirribonucleico) que pueden crear miles de millones de copias en unas pocas horas. La forma más eficaz de reproducir el ADN era mediante la clonación, pero era problemática. Llevó tiempo convencer a los colegas de Mullis de la importancia de este descubrimiento, pero pronto la PCR se convirtió en el foco de una intensa investigación. Los científicos de Cetus desarrollaron una versión comercial del proceso y una máquina llamada Thermal Cycler (con la adición de los componentes químicos del ADN [nucleótidos] y un catalizador bioquímico [polimerasa], la máquina realizaría el proceso automáticamente en una pieza objetivo de ADN).

Cetus otorgó a Muilis $ 10,000 por desarrollar la patente de PCR y luego la vendió por $ 300 millones. Dejando Cetus en 1986, Muilis se convirtió en consultor privado de investigación bioquímica y fue galardonado con el Premio Nobel en 1993.

ciclo de síntesis de ADN

• 2 Una vez preparadas las soluciones de reacción, se inicia el ciclo de PCR. La primera fase implica la desnaturalización del ADN. Uno de los pasos iniciales más importantes es la desnaturalización completa de la plantilla de ADN. La desnaturalización del ADN significa esencialmente romper la cadena de doble enlace. Esta "apertura" de la molécula de ADN proporciona la plantilla para la siguiente molécula de ADN a partir de la cual se producirá. Una desnaturalización incompleta dará como resultado una copia ineficaz en el primer ciclo que impacta negativamente en cada ciclo subsiguiente. La desnaturalización inicial se realiza calentando la solución de la plantilla de ADN a 203 ° F (95 ° C) durante uno a tres minutos. El tiempo total depende de la composición de la plantilla. En ciclos repetidos, el paso de desnaturalización dura aproximadamente dos minutos e implica calentar la solución a 201PF (94 ° C). Pueden añadirse materiales adicionales a la solución para facilitar la desnaturalización del ADN, como glicerol, DMSO o formamida.
• 3 Con el ADN dividido en hebras separadas, la temperatura se reduce a 122-149 ° F (50-65 ° C). Esto se conoce como el paso de recocido de la imprimación y dura aproximadamente dos minutos. En este punto, los cebadores izquierdo y derecho coinciden y se unen químicamente con sus bases complementarias en la plantilla de ADN.
• 4 La siguiente fase implica el paso de extensión. Esta parte de la reacción es cuando se copia la mayor parte de la cadena de ADN. La temperatura del sistema se calienta a aproximadamente 162 ° F (72 ° C) y se mantiene allí dependiendo de la longitud del ADN a copiar. En esta etapa, la ADN polimerasa interactúa con las hebras y agrega nucleótidos complementarios a lo largo de toda su longitud. El tiempo necesario en esta fase es de aproximadamente un minuto por cada 1000 pares de bases.
• 5 Después de este primer ciclo, se repite el ciclo de síntesis de ADN. El número de ciclos depende de la cantidad de ADN inicial y la cantidad de ADN deseada. Si están disponibles menos de 10 copias del ADN molde, se necesitan 40 ciclos. Con más ADN inicial, 25-30 ciclos son suficientes.
• 6 Durante el último ciclo, la muestra se mantiene a 162 ° F (72 ° C) durante unos 15 minutos. Esto permite rellenar (con nucleótidos) cualquier extremo que sobresalga de una nueva hebra de ADN. En esta etapa, la polimerasa agrega nucleótidos A adicionales en un extremo de las cadenas de ADN.

aislamiento de ADN

• 7 Cuando se completan las reacciones, el ADN se aísla de los materiales que reaccionan a la PCR, como la ADN polimerasa, el MgCl2 y los cebadores. Esto se hace agregando compuestos como fenol, EDTA y proteinasa K. La centrifugación también es útil en este sentido.

El futuro

Si bien los científicos usan la PCR para la síntesis de ADN de manera regular, todavía hay mucho que no se comprende sobre la replicación del ADN. En el futuro, la investigación debe dilucidar los detalles de varios pasos importantes del proceso, como los componentes y los intermediarios involucrados. Además, se pueden desarrollar polimerasas mejoradas, lo que hace posible crear más ADN a partir de muestras iniciales más pequeñas. Se espera que algún día la síntesis de ADN ayude a descubrir algunos de los aspectos clave de los organismos vivos y conduzca al desarrollo de medicamentos que curen varios cánceres, infecciones virales y bacterianas.