Entrega liposomal dirigida y sensible al pH de morina mediante conjugados de nanopartículas de oro-aptámero para terapia contra el cáncer

Resumen

Este estudio propone la síntesis de un tipo de nanopartícula anticancerígena: liposomas sensibles al pH modificados con morina y conjugados de aptámero-nanopartículas de oro (Apt-Au@MSL), que exhiben propiedades de direccionamiento tumoral. Los tumores son difíciles de curar porque su microambiente difiere del tejido normal; su pH es más bajo, lo que generalmente obstaculiza la eficacia de los fármacos. Por ello, los fármacos sensibles al pH han atraído gran atención. Las nanopartículas de oro (AuNPs) muestran potencial como transportadoras de fármacos debido a su pequeño tamaño, buena biocompatibilidad, fácil modificación superficial y fuerte penetración celular. El Apt-Au@MSL exhibe excelente monodispersidad y propiedades de direccionamiento tumoral, pudiendo liberarse en entornos parcialmente ácidos mediante diálisis. Mediante ensayo MTT, se cribaron líneas celulares cancerosas modelo, encontrando que las células SGC-7901 pueden suprimir eficazmente la proliferación. Los resultados in vivo demuestran que la administración de Apt-Au@MSL inhibe el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto murino. La tinción H&E y el ensayo TUNEL confirman además que Apt-Au@MSL promueve la apoptosis tumoral. Este sistema puede inducir apoptosis mediante la sobreproducción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y la regulación de múltiples vías de señalización. Tanto los análisis bioquímicos sanguíneos como la tinción H&E sugieren que estos materiales exhiben toxicidad aguda insignificante y buena biocompatibilidad in vivo. Con su potente función, Apt-Au@MSL puede utilizarse como material anticancerígeno basado en direccionamiento para futuros tratamientos clínicos del cáncer.

Introducción

El cáncer, una de las causas de muerte más prevalentes, genera pérdidas económicas sustanciales y daño a los humanos. Se han dirigido esfuerzos considerables hacia el desarrollo de fármacos inteligentes para el tratamiento del cáncer. Debido a su capacidad para proteger los fármacos hasta que alcanzan el sitio diana, las nanopartículas poliméricas pueden mejorar potencialmente la administración de agentes terapéuticos. Para asegurar la entrega del agente terapéutico al sitio activo, se emplean nanopartículas altamente reactivas, diseñadas para variar sus propiedades materiales bajo diferentes estímulos biológicos. Estas nanopartículas reactivas se diseñan utilizando diversos estímulos, incluyendo estímulos externos (temperatura, luz) y biológicos (pH, condiciones redox). Las nanopartículas sensibles al pH han atraído interés investigativo debido a los cambios de pH tras la endocitosis. Los materiales sensibles al pH también llaman la atención porque esta función puede integrarse fácilmente en diversas estructuras poliméricas. Las nanopartículas pueden responder al pH mediante alteración de la química superficial, cambio de tamaño o forma, y descomposición o liberación de sustancias. Este cambio en las propiedades nanoparticuladas puede regular la captación celular y la liberación controlada, proporcionando una estrategia poderosa para el diseño de sistemas de administración terapéutica.

La morina hidratada (3,5,7,2′,4′-pentahidroxiflavona) es una sustancia activa natural aislada de medicinas herbales chinas o plantas. Es un compuesto de progesterona y un metabolito secundario fenólico en plantas. La morina está ampliamente distribuida en la naturaleza y ejerce buenos efectos antioxidantes, anticancerígenos y antiinflamatorios significativos. Su potencial para diversas aplicaciones ha atraído considerable interés, pero se ve limitado significativamente por su baja solubilidad en agua y biodisponibilidad.

Los liposomas (huecos), compuestos de lecitina y ceramida entre otros, poseen una estructura bicapa de moléculas lipídicas anfifílicas. Proporcionan características deseables como biocompatibilidad, funcionalidad, reducción de efectos secundarios y capacidad para encapsular grandes cantidades de fármaco. Pueden transportar eficientemente agentes hidrofílicos e hidrofóbicos, protegiéndolos de condiciones externas y transportándolos exitosamente a regiones tisulares diana. La eficacia mejorada se incorpora en el diseño para facilitar la liberación desencadenada por pH del material anticancerígeno dentro del intersticio tumoral mediante liposomas sensibles al pH. Estos son liposomas especiales que liberan fármaco en entornos tisulares y se desestabilizan rápidamente en ambientes ácidos, como los endosomas del tejido canceroso.

Para una selectividad y eficacia mejoradas del tratamiento tumoral, los liposomas sensibles al pH deben modificarse para formar nanopartículas dirigidas al tumor. Los aptámeros de ADN se han desarrollado recientemente como biosensores e imágenes altamente selectivos y sensibles, así como agentes potenciales para terapéuticos dirigidos al cáncer. El aptámero monocatenario AS1411 ha demostrado funcionar como agente quimioterapéutico debido a su alta afinidad de unión a núcleos de células cancerosas. Este aptámero (Apt) se combinó con AuNPs para fabricar una nanoestructura de dos componentes de AuNPs cargados con Apt que pueden interactuar con núcleos de células cancerosas. Algunos estudios también han demostrado que el diseño de híbridos liposoma-nanopartícula proporciona una caja de herramientas rica para la fabricación de modalidades multifuncionales. Se ha diseñado un sistema vesicular híbrido liposoma-Au NP consistente en liposomas catiónicos y AuNPs para mejorar la penetración del fármaco dentro del intersticio tumoral y aumentar la actividad anticancerígena.

Las nanopartículas de oro (AuNPs) han sido consideradas buenas transportadoras de fármacos y pueden modificarse con moléculas bio-relacionadas para mejorar la especificidad dirigida al cáncer. Con la modificación superficial de AuNPs, el aptámero del grupo sulfhidrilo puede usarse para modificar la superficie de AuNPs, dirigido por el enlace covalente Au-S, y el grupo sulfhidrilo apropiado en la superficie del nanogold puede unirse a esta. Desde una perspectiva de ingeniería y aplicación, los nanomateriales de oro ligados a ligandos proporcionan una plataforma poderosa para facilitar la identificación, detección y tratamiento dirigidos.

En el estudio actual, se utilizaron liposomas sensibles al pH encapsulando morina y se ensambló Au-Apt modificado en la superficie de los liposomas (Apt-Au@MSL). La morina, caracterizada por baja solubilidad en agua y biodisponibilidad, fue transformada. Se caracterizaron la morfología, tamaño y otras propiedades del Apt-Au@MSL preparado. La nueva nanopartícula mostró propiedades de direccionamiento tumoral y alta actividad anticancerígena. La actividad anticancerígena de Apt-Au@MSL se exploró in vitro e in vivo.

Materiales y Métodos

Materiales

L-α-Fosfatidilcolina (PC), colesterol (Chol), hemisuccinato de colesterilo (CHEMS), morina (≥ 99,99 %), citrato de sodio (99,9 %), HAuCl₄·3H₂O (≥ 99,9 %), polivinilpirrolidona (PVP, pm 40.000), NaOH (≥ 98,0 %) y HCl (37 %) se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (EE. UU.). El aptámero AS1411 con modificación de disulfuro fue sintetizado por TaKaRa (Dalian, China) con la secuencia: 5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′. Bromuro de tiazolilo azul tetrazolio (MTT), yoduro de propidio (PI), calceína y Alexa Fluor 488 Annexin V se compraron en Sigma-Aldrich Chemical. Todas las soluciones acuosas se prepararon en agua bidestilada. Los demás reactivos fueron de la mejor calidad comercial disponible.

Síntesis de AuNPs

Hasta 1 mL de HAuCl₄·4H₂O (1 %) se disolvió en 25 mL de agua Milli-Q (pH = 5,5), y se añadieron 50 mg de PVP. La solución resultante se vertió en un matraz de tres cuellos (150 mL) y se trató con irradiación de microondas (MW) durante 5 min con agitación mecánica. Posteriormente, se añadieron rápidamente 1,5 mL de solución de citrato de sodio (1 %) y se irradiaron con MW durante 3 min. La solución se recogió por centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min.

Síntesis de Apt-AuNPs

El enlace de disulfuro de los aptámeros se clivó usando tris(2-carboxietil)fosfina. Tras 30 min, la solución de aptámero (100 μL, 100 μM) se añadió a 10 mL de solución de AuNPs 5 nM y se incubó durante 24 h para formar Au-Apt NPs. Tras un día, la mezcla se salinizó con 2,5 mL de solución 500 mM de NaCl dos veces, separadas por 4 h.

Preparación de liposomas sensibles al pH

Liposomas compuestos de PC de huevo:CHEMS:Chol en proporción molar 33:13:5 y 5 % de morina se prepararon por hidratación de película. PC de huevo, CHEMS, Chol y 2 mg de morina se disolvieron en 8 mL de CHCl₃, y los disolventes orgánicos se eliminaron a 40 °C con evaporador rotatorio. Para liposomas de morina, la película lipídica resultante se hidrató usando PBS 2 % (p/v) y se sonificó con sonda en baño de hielo durante 15 min. El liposoma final se sintetizó y estabilizó en sistema coloidal. Para Apt-Au@MSL, la película lipídica se hidrató con 475 μg/mL de Au-Apt NPs en dextrosa al 5 % seguido de sonicación.

Caracterización

Se realizó espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Corea) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR, Nicolet iS50, EE. UU., Thermo Fisher Scientific). La morfología del Apt-Au@MSL se examinó por microscopía electrónica de transmisión (TEM, HT7700, Tokio, Japón, Hitachi). El porcentaje de liberación de morina se detectó por espectroscopía UV-Vis. La morfología de los liposomas de morina y Apt-Au@MSL también se observó por microscopía electrónica de barrido (SEM, S-4800, Hitachi, Japón). La dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones de potencial zeta se usaron para caracterizar propiedades ópticas y tamaños en un analizador Brookhaven ZetaPALS.

Cultivo celular

Las líneas celulares cancerosas humanas SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 y Hs68 se adquirieron de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en RPMI con 10 % suero fetal bovino a 37 °C y 5 % CO₂.

Estudio de actividad anticancerígena in vitro

Las células SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 y Hs68 se sembraron en placas de 96 pozos (2,0 × 10³ células/pozo) y se cultivaron con Apt-Au@MSL a concentraciones variables (0, 5, 10, 15, 20 y 30 μg/mL). AuNPs y morina se asignaron como grupos control. El grupo blanco consistió en células no tratadas. Las placas se incubaron en incubadora humificada. Tras incubación, se añadieron 9,6 mL de solución MTT (5 mg/mL) a cada pozo e incubaron 2 h más. Cada grupo se probó por triplicado, y los valores IC₅₀ se derivaron de las curvas de valores OD medios versus concentración de fármaco. El brillo de cada grupo se obtuvo por microscopía de fluorescencia confocal.

La adhesión celular se monitorizó usando un sistema de detección electrónica celular en tiempo real (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) cada 10 min durante 75 h. Para determinar adhesión, cada pozo se sembró con células (1,0 × 10⁴ células/pozo) con medio fresco a volumen final 200 μL y luego incubó en solución Apt-Au@MSL a concentraciones variables (10, 20 y 30 μg/mL) a 10 h incubado por 12 h. El grupo blanco consistió en células no tratadas, y los grupos control consistieron en grupos de morina y liposomas de morina.

Microscopía de fluorescencia

Las células SGC-7901 se cultivaron en placas de 48 pozos durante la noche a 37 °C, 5 % CO₂. Luego se trataron con soluciones Apt-Au@MSL (10 y 30 μg/mL) a diferentes concentraciones durante 12 h. Los grupos control consistieron en morina y liposomas de morina. Posteriormente, se retiró el medio. El grupo blanco consistió en células no tratadas. Las células se lavaron con PBS tres veces. Se tiñeron y midieron por co-tinción de células vivas y muertas (ensayo LIVE/DEAD). Tras co-tinción con Calceína-AM/PI durante 30 min, las células se lavaron con PBS dos veces para eliminar exceso de tinte, y se obtuvieron imágenes de fluorescencia por microscopía láser de barrido confocal (CLSM) (para calceína-AM, Ex = 488 nm y Em = 515 nm; PI Ex = 535 nm y Em = 615 nm).

Análisis de muerte celular apoptótica

Para medir efectos anticancerígenos de Apt-Au@MSL, cada pozo en placa de seis pozos se sembró con células SGC-7901 (1,0 × 10⁵ células/pozo) y luego incubó en soluciones Apt-Au@MSL a concentraciones variables (5, 10, 20 y 30 μg/mL) durante 12 h. El grupo blanco consistió en células no tratadas, y los grupos control en morina y liposomas de morina. Tras tratamiento, las células se recogieron y lavaron con PBS dos veces. Se tiñeron con PI y Annexin V-FITC y analizaron usando analizador CytoFLEX (Beckman Coulter) (para PI, Ex = 535 nm y Em = 615 nm; Annexin V-FITC, Ex = 488 nm y Em = 525 nm).

Estudios de destrucción de pared celular

Para estudiar destrucción de pared celular en ensayo anticancerígeno, células SGC-7901 se cultivaron en placas de seis pozos a 37 °C y 5 % CO₂. Las células cultivadas sin material se usaron como grupo blanco. Tras cultivo con Apt-Au@MSL a concentraciones variables (5, 10, 20 y 30 μg/mL) durante 12 h, se trataron con solución tripsina-EDTA 0,25 %. Todas las células (incluyendo flotantes en medio) se recogieron a 2000 r/min durante 5 min. Las células recogidas se post-fijaron en solución 2,5 % glutaraldehído durante 4 h. Las células fijadas se deshidrataron en serie gradiente de acetona durante 20 min. Finalmente, se sometieron a serie de procedimientos, montaron en rejillas de cobre y observaron por TEM (HT-7700, Hitachi, Japón).

Ensayo Western Blot

La expresión proteica de células SGC-7901 se detectó por análisis Western blot. Células SGC-7901 (4,0 × 10⁵ células/pozo) se inocularon en placa de cultivo de 9 cm y 20 μg/mL Apt-Au@MSL durante 1, 6, 12 y 24 h. Las células se recogieron tras tratamiento y suspendieron en tampón de lisis celular en hielo durante 1 h. La mezcla se centrifugó a 11.000g a 4 °C durante 10 min, y el sobrenadante conteniendo proteína celular total se recogió. La concentración proteica total se determinó por método BCA. La proteína se resuspendió en tampón de carga y hirvió a 100 °C durante 10 min. Muestras con cantidades iguales de proteína (40 μg/carril) se sometieron a SDS-PAGE (geles 10 % tricina). Luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (NC) a 100 V durante 1,5 h y bloquearon con leche descremada 5 % en salina tamponada con Tris con 0,1 % Tween-20 (TBST) durante 1 h. Luego, la membrana NC se incubó con anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente. Bandas de proteínas diana se visualizaron usando reactivos de detección ECL. β-actina se usó como control interno de carga y transferencia iguales. La expresión proteica se cuantificó con software Quantity-One, y la tasa de expresión se etiquetó bajo la banda.

Modelo animal

Ratones nu/nu machos BALB/c (~ 17 g) se adquirieron del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing y criaron en ambiente axénico (animales libres de patógenos específicos). Los modelos tumorales se establecieron por inyección subcutánea de suspensión celular (células SGC-7901, 100 μL, 1 × 10⁶/mL) en el hombro de ratones nu/nu. Imágenes brillantes del tumor se generaron 15 días tras inyección subcutánea de células tumorales. Todos los experimentos con animales se realizaron según protocolos aprobados por el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Agrícola de Anhui (Número de permiso: SYXK 2016-007). Un calibre vernier se usó para determinar el diámetro longitudinal máximo (longitud) y transversal máximo (ancho) de cada tumor. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula longitud × ancho² × 0,5.

Estudio anticancerígeno in vivo

Las pruebas de seguimiento se realizaron cuando el volumen tumoral alcanzó 50 mm³. Ratones divididos aleatoriamente en cinco grupos recibieron tratamientos intravenosos: PBS (100 μL), morina, liposomas de morina, Au-Apt y Apt-Au@MSL. Los ratones se inyectaron por vía intravenosa en la cola a dosis de 2 mg/kg del material para tratamiento. Los tamaños tumorales se midieron tras 24 días. El peso corporal y supervivencia de los ratones también se determinaron. Los ratones fueron eutanasiados, y tejidos tumorales y de órganos se recogieron para tinción H&E.

Tras bloqueo y permeabilización, las láminas tumorales se lavaron con PBS, tiñeron con ensayo TUNEL y se sometieron a contra-tinción DAPI. Imágenes de fluorescencia se obtuvieron por CLSM. Para imágenes DAPI, Ex = 358 nm y Em = 461 nm, y para ensayo TUNEL, Ex = 450-500 nm y Em = 515-565 nm.

Ensayo de evaluación de toxicidad

Para evaluar toxicidad del tratamiento Apt-Au@MSL en órganos vitales, los ratones en los cuatro grupos de tratamiento fueron sacrificados tras 30 días. Los órganos importantes (hígado, bazo, riñones, corazón, pulmones y tumor) de ratones de todos los grupos se recogieron y tiñeron con H&E. También se recogieron muestras sanguíneas y se midió glucosa en sangre. Además, se determinaron los pesos de los ratones.

Resultados y Discusión

Caracterización

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo liposoma que posea las ventajas de nanopartículas (NPs cargadas con Apt) y pueda usarse eficazmente como agente anticancerígeno. Las propiedades básicas de los nuevos liposomas son importantes para estudios posteriores. Apt-Au@MSL se sintetizó como se describe en estudio previo, con modificaciones menores, y luego se caracterizó mediante diversos métodos. La Figura 3b presenta resultados de espectroscopía UV-Vis, que muestra el pico característico y puede monitorizar la formación de AuNPs. Picos característicos se observaron en espectro UV-Vis de AuNPs aproximadamente a 530 nm. Específicamente, el análisis de espectros UV-Vis exhibió fuerte absorbancia UV, influenciada por modificación superficial de Apt. Se observaron mismos resultados. Picos característicos se desplazaron tras recubrir liposomas sensibles al pH con morina. El pico característico del Apt-Au@MSL fabricado se ubicó en 362 y 550 nm. Estos resultados indicaron síntesis exitosa. Para mayor caracterización, se realizó espectroscopía FT-IR para verificar resultados de síntesis. Los picos característicos de desplazamiento al rojo de liposomas de morina y Apt-Au@MSL indicaron además modificación exitosa de morina (Fig. 3c). Se realizó ensayo de liberación de morina en PBS a diferentes niveles de pH para determinar sensibilidad al pH de Apt-Au@MSL. Estos tres valores de pH simulan el entorno neutro de circulación sanguínea, el entorno ligeramente ácido del tumor y el entorno ácido del cuerpo intracelular. El porcentaje de liberación de morina se detectó por espectroscopía UV-Vis. A pH 5,0, aproximadamente 54 % de morina se liberó en 24 h, observándose liberación continua en las siguientes 96 h; mientras que a pH 7,4, solo aproximadamente 10 % de morina se liberó en 24 h. Estos resultados muestran que Apt-Au@MSL exhibe buena estabilidad bajo condiciones fisiológicas normales, previniendo fuga de fármaco; sin embargo, el fármaco se libera rápidamente en el cuerpo nuclear. Este comportamiento de liberación puede mejorar eficazmente el efecto terapéutico (Fig. 3d). Se realizaron TEM y SEM para elucidar estructuras del liposoma y Apt-Au@MSL (Fig. 3f). TEM se realizó para elucidar estructuras de AuNPs. Como se muestra en Fig. 3g, AuNPs tienen tamaño de partícula ~10 nm, consistente con tamaño de modificación en liposomas (Fig. 3g). Resultados SEM en Fig. 3e indican que liposomas crudos forman únicamente vesículas unilamelares con diámetro no uniforme ~120 nm, consistente con tamaño determinado por DLS. Por el contrario, Apt-Au@MSL muestra que la morfología de vesículas híbridas se atribuye a modificación Au-Apt. El diámetro de 150 nm también fue consistente con tamaño determinado por DLS (Fig. 3i). Notablemente, investigación TEM de interacciones entre liposomas sensibles al pH y Au-Apt reveló que AuNPs se asociaban casi exclusivamente con la bicapa lipídica vesicular y se localizaban en la periferia de las vesículas (Fig. 3h). Las mediciones de potencial ζ se presentan en Fig. 3j, y los potenciales zeta de AuNPs y Au-Apt son negativos. El resultado muestra que tanto AuNPs (−57,1 ± 0,3 mV) como Au-Apt están cargados negativamente (−31,7 ± 0,2 mV). Apt-Au@MSL se modificó con liposomas de morina cargados positivamente, y el potencial cambió a 36,4 ± 0,3 mV. La adsorción de cargas positivas y negativas es el mecanismo por el cual Au-Apt y liposomas de morina se unen. Además, Fig. 3k representa cambio en tasa de encapsulación de partícula en el tiempo, indicando estabilidad de partícula durante un período. Como se muestra en Fig. 3k, la tasa de encapsulación apenas cambia en 24 h, indicando buena estabilidad temporal. La curva estándar de concentración de morina versus absorbancia UV-Vis de morina se preparó para estudiar tasa de encapsulación de liposoma de morina y Apt-Au@MSL. Los resultados revelaron que la eficiencia de atrapamiento de liposoma de morina y Apt-Au@MSL puede alcanzar 90,2 % y 89,6 %, como se muestra en Tabla S1 y Fig. S1.

Prueba de actividad anticancerígena de Apt-Au@MSL

In vitro

La morina exhibe actividad antitumoral superior pero tiene baja biodisponibilidad por su baja solubilidad en agua. Tras encapsular morina en liposomas sensibles al pH y transformarla en material soluble en agua, la superficie del liposoma se modificó usando Au-Apt para obtener efecto antitumoral dirigido. La Figura 4a muestra actividad anticancerígena de Apt-Au@MSL por ensayo MTT in vitro. La concentración de fármaco se define por concentración de morina. El grupo tratado con morina no mostró actividad anticancerígena aparente comparado con grupo blanco. Sin embargo, el grupo tratado con morina encapsulada por liposomas sensibles al pH exhibió actividad anticancerígena mejorada. El resultado sugiere que actividad antitumoral de liposomas de morina fue superior a morina cruda. Simultáneamente, se encontró que actividad antitumoral del liposoma modificado por Apt (Apt-Au@MSL) mejoró. La Tabla 1 lista valores IC₅₀ de morina, liposomas de morina, Apt-Au@MSL y cisplatino. Morina, liposomas de morina y Apt-Au@MSL exhibieron amplio rango de actividad anticancerígena en células tumorales. Mostraron preferencia distinta por células SGC-7901 con alta potencia y baja toxicidad hacia células humanas normales. El valor IC₅₀ de Apt-Au@MSL fue 15,6 ± 1,5 μg/mL para células SGC-7901. Estos resultados se confirmaron además por pruebas RTCA. Las células SGC-7901 se cultivaron con Apt-Au@MSL a diferentes concentraciones; grupo blanco tratado con PBS, y grupo control consistió en morina y liposomas de morina. Adhesión y dispersión se monitorizaron usando iCELLigence (Fig. 4b). Resultados fueron largely similares a los obtenidos por MTT. La actividad antitumoral de Apt-Au@MSL fue significativamente mayor que morina y liposomas de morina. Apt-Au@MSL pudo inhibir proliferación de células SGC-7901 con aumento de concentración. Cambios en morfología celular tras tratamiento con Apt-Au@MSL también se observaron por microscopía de fluorescencia. Como se muestra en Fig. 4c, células SGC-7901 sin Apt-Au@MSL mantienen integridad estructural celular. Por el contrario, integridad celular se compromete tras tratamiento con Apt-Au@MSL a diferentes concentraciones.

Análisis de muerte celular apoptótica

Análisis cuantitativo de apoptosis se realizó por citometría de flujo usando tinción Annexin-FITC. Las células se tiñeron con PI y Annexin V-FITC y analizaron usando citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter). Annexin V detectó células apoptóticas tempranas unidas a fosfatidilserina expuesta, y marcado PI teñió células apoptóticas tardías. La ratio de apoptosis fue 1,57 % para grupos blancos. Células tratadas con morina mostraron ratio de apoptosis 3,51 %. Apt-Au@MSL a diferentes concentraciones exhibió mayor capacidad inductora con ratios de apoptosis 7,44 %, 10,75 %, 15,53 % y 40,77 % (Fig. 5). La apoptosis mejorada confirmó también la destacada actividad anticancerígena inducida por Apt-Au@MSL. La ratio de apoptosis de células SGC-7901 aumentó con concentración creciente de Apt-Au@MSL.

Estudio de actividad anticancerígena por ensayo de fluorescencia

El efecto antitumoral en células SGC-7901 inducido por Apt-Au@MSL se evaluó intuitivamente por ensayos de fluorescencia LIVE/DEAD. Tras incubar células con morina, liposomas de morina y Apt-Au@MSL a diferentes concentraciones, se co-tiñeron con kit LIVE/DEAD durante 30 min en oscuridad. En Fig. 6, células del grupo blanco muestran que todas las células de fluorescencia verde representan células vivas. Los grupos control, incluyendo morina y liposomas de morina, muestran número de células con fluorescencia roja. Sin embargo, células tratadas con Apt-Au@MSL a diferentes concentraciones exhibieron claramente gran número de células apoptóticas. Con aumento de concentración, células vivas disminuyeron gradualmente. El porcentaje de células muertas aumentó predominantemente, y densidad celular disminuyó. El resultado confirmó que Apt-Au@MSL puede promover eficazmente apoptosis tumoral.

Estudio de integridad celular

Para confirmar influencia de captación y transporte de Apt-Au@MSL a células SGC-7901, se realizó ensayo TEM. El cambio en morfología celular se observó por TEM. Imágenes TEM se realizaron para observar estructura interna de células y proporcionar referencia para mecanismos anticancerígenos. Como se muestra en Fig. 7, imágenes blancas de células SGC-7901 sin tratamiento exhibieron cambios significativos en morfología y apariencia de paredes celulares claras. En grupo control (morina y liposomas de morina), morfología celular mostró daño parcial y región nuclear se contrajo. Sin embargo, cambios significativos en pared celular y estructura interna también se observaron tras exposición a Apt-Au@MSL. El citoplasma filtró, y estructura nuclear se volvió poco clara. Muchos fragmentos celulares se formaron alrededor de células huecas. Además, paredes celulares se desintegraron o destruyeron. Perfiles completos se volvieron poco claros, células se dañaron y citoplasma filtró. Las flechas rojas representaron área de AuNPs. A medida que concentración de Apt-Au@MSL aumentó, más regiones de AuNPs aparecieron en el núcleo. Esto sugirió liberación de morina tras entrada de Apt-Au@MSL al interior celular, de ahí aparición de gran cantidad de AuNPs. Estos resultados sugieren que actividad antitumoral se asoció con integridad celular y estructura nuclear comprometidas.

Mecanismo molecular inducido por Apt-Au@MSL

Para explorar mecanismo molecular de apoptosis inducida por Apt-Au@MSL, se detectaron niveles de expresión de caspasas y PARP. La activación de caspasa-3, -8 y -9 se detectó primero con sustratos específicos. Como se muestra en Fig. 8a, tratamiento con Apt-Au@MSL induce activación dependiente de dosis de caspasa-3, -8 y -9. La caspasa-9 promueve apoptosis mediada por mitocondrias más que caspasa-8, indicando que la vía de señalización de apoptosis mediada por mitocondrias es dominante. El análisis Western blot confirmó además existencia de apoptosis inducida por Apt-Au@MSL a nivel proteico. Figuras 8b y c muestran que tras tratamiento con Apt-Au@MSL, activación de caspasas y clivaje de PARP muestran dependencia temporal y de dosis (Figs. 8b, c). En Fig. 8d, e, el análisis Western blot confirmó nuestros resultados. En conclusión, Apt-Au@MSL inhibe crecimiento de células SGC-7901 principalmente induciendo apoptosis.

Apt-Au@MSL inhibe crecimiento tumoral

In vivo

Las actividades antitumorales in vivo de Apt-Au@MSL se evaluaron usando modelo de xenoinjerto tumoral SGC-7901. La comparación de imágenes de tumores con grupo control (morina y liposomas de morina) mostró que ratones tratados con Apt-Au@MSL redujeron marcadamente peso y tamaño del tumor (Fig. 9a). Las curvas de volumen tumoral relativo y peso de ratones indican que Apt-Au@MSL in vivo exhibe mayor eficiencia anticancerígena (Fig. 9b) que otros grupos de tratamiento. No se indicó diferencia significativa en volumen tumoral promedio entre grupo control (morina y liposomas de morina) y grupo blanco. El volumen tumoral del grupo Apt-Au@MSL fue solo casi una décima parte del grupo blanco y casi una sexta parte del grupo control. El resultado indicó que morina cruda y liposomas de morina a 40 mg/kg no ejercieron efecto en tasa de crecimiento tumoral. Sin embargo, Apt-Au@MSL pudo inhibir crecimiento tumoral. El peso corporal de ratones en diferentes grupos (PBS, morina, liposomas de morina y Au-Apt) no mostró fluctuación marcada (Fig. 9c) durante período de tratamiento. Este resultado sugirió que tratamiento fue tolerado y no causó efectos secundarios agudos. Notablemente, ratones con tratamiento Apt-Au@MSL mostraron supervivencia marcadamente prolongada (Fig. 9d). Los ratones supervivientes en este grupo se comportaron normalmente, sin signos aparentes de condición no saludable. Estos resultados demostraron que administración de Apt-Au@MSL pudo inhibir crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto murino.

Análisis histológico de actividad anticancerígena

La tinción H&E de tejidos tumorales y de órganos se realizó tras fijación y tratamiento. La eficacia del tratamiento respecto a muerte celular tumoral se evaluó también por tinción H&E de tejido tumoral de diferentes grupos. En Fig. 10a, ratones tratados con Au-Apt, morina y liposomas de morina muestran mismo grado de daño térmico que ratones del grupo blanco. No se observó apoptosis aparente en grupo blanco. Las secciones de tejido tumoral consistían en células tumorales densamente empaquetadas. Sin embargo, tratamiento con Apt-Au@MSL exhibió daño más significativo en tejido tumoral, con apoptosis celular moderada en el tumor. El resultado sugirió actividad anticancerígena en modelos murinos tratados con Apt-Au@MSL. Para investigarさらに ratio de células apoptóticas en tejido tumoral in vivo, se realizó ensayo TUNEL para detección de células apoptóticas. Como se muestra en Fig. 10b, células apoptóticas en tumores pueden teñirse con fluorescencia verde para indicar apoptosis. Las imágenes fusionadas muestran menos regiones fluorescentes verdes en grupo blanco y grupo control (morina y Au-Apt), indicando presencia de menos células apoptóticas. Las células de ratones tratados con liposomas de morina aparecen parcialmente apoptóticas. Además, gran número de regiones fluorescentes verdes se observaron en grupo tratado con Apt-Au@MSL, indicando gran cantidad de células apoptóticas. Los resultados fueron consistentes con tinción H&E, confirmando que Apt-Au@MSL puede promover apoptosis tumoral in vivo.

Evaluación de toxicidad in vivo

La potencial toxicidad in vivo es a menudo preocupación significativa para aplicación clínica de medicamentos anticancerígenos. Para verificar aplicabilidad de Apt-Au@MSL in vivo, los ratones se evaluaron bajo diferentes tratamientos (morina, liposomas de morina, Au-Apt y Apt-Au@MSL). También se realizaron ensayos bioquímicos sanguíneos para examinar posibles cambios en bioquímica de ratones tras tratamiento. Como se muestra en Fig. 11a, el índice de glucosa sanguínea para función sanguínea de grupos Apt-Au@MSL fue similar a grupos blanco y control. No se encontró diferencia en peso corporal en cada grupo. Se observó aumento constante, indicando que fármaco exhibió no toxicidad (Fig. 11b). La tinción H&E de secciones de órganos (Fig. 11c) no mostró signo de daño o inflamación en grupo tratado con Apt-Au@MSL, comparado con grupos blanco y control. Este hallazgo indicó que PBS, morina, liposomas de morina, Au-Apt y Apt-Au@MSL tuvieron efectos secundarios insignificantes in vivo. Estos resultados, así como los de tinción H&E, indican además seguridad en uso de Apt-Au@MSL para tratamiento tumoral.

Conclusiones

En conclusión, este estudio presenta la síntesis de un nanomaterial antitumoral, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibió excelente monodispersidad y propiedades de direccionamiento tumoral. La polaridad de morina se modificó y la actividad antitumoral se mejoró. El pH de la solución fue 5,0, y la tasa de liberación de morina desde Apt-Au@MSL fue máxima en experimentos de caracterización. Apt-Au@MSL mostró que morfología de vesículas híbridas era atribuible a modificación Au-Apt. El diámetro de 150 nm fue consistente con tamaño determinado por DLS. Se cribaron células cancerosas modelo por ensayo MTT y se encontró que células SGC-7901 pudieron suprimir eficazmente proliferación. El IC₅₀ de Apt-Au@MSL fue 15,6 ± 1,5 μg/mL para células SGC-7901. Ensayos citométricos de fluorescencia confirmaron que Apt-Au@MSL puede usarse como material anticancerígeno eficaz e indujo apoptosis in vitro. El Apt-Au@MSL encontrado en célula interna, como muestran imágenes TEM, sugirió que Apt-Au@MSL pudo dirigir células cancerosas. La administración de Apt-Au@MSL pudo inhibir crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto murino, determinado por pruebas de peso tumoral. Tinción H&E y ensayo TUNEL confirmaron además que Apt-Au@MSL pudo promover apoptosis tumoral in vivo. Tanto pruebas bioquímicas sanguíneas como tinción H&E sugirieron que estos materiales exhiben toxicidad aguda insignificante y buena biocompatibilidad in vivo.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los autores declaran que los materiales, datos y protocolos asociados están disponibles puntualmente para los lectores sin calificaciones indebidas en acuerdos de transferencia de materiales. Todos los datos generados y analizados durante este estudio están incluidos en este artículo.

Abreviaturas

Apt:

Aptámeros

Apt-Au:

Aptámeros y nanopartícula de Au

MSL:

Liposoma sensible al pH de morina

AuNPs:

Nanopartículas de oro

ROS:

Especies reactivas del oxígeno

Apt-Au@MSL:

Liposoma sensible al pH de morina modificado con aptámeros y nanopartícula de Au

PC:

L-α-Fosfatidilcolina

Chol:

Colesterol

CHEMS:

Hemisuccinato de colesterilo

PVP:

Polivinilpirrolidona

PI:

Yoduro de propidio

FT-IR:

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

UV-Vis:

Espectroscopía ultravioleta-visible

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

DLS:

Dispersión dinámica de luz

PDI:

Índice de polidispersidad

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Microscopía láser de barrido confocal

TUNEL:

Marcado de extremos de nick mediado por TdT-dUTP

H&E:

Tinción hematoxilina-eosina

RTCA:

Análisis celular en tiempo real sin marcadores

Micoesferas de fosfato cálcico yema-cáscara de alta área superficial a partir de fuentes orgánicas de fósforo y calcio para adsorción mejorada de LHE Análisis atomístico del rebote de nanopartículas de sílice en superficies hidroxiladas usando potenciales REAX