Nanopartículas Teranósticas Foto-Quimio Dirigidas a Tumor de Alta Eficiencia: Artesunato-Cargado, ICG-Conjugado Albúmina Sérica Humana

Resumen

Reportamos una plataforma teranóstica tumor-específica que combina cuatro agentes clínicamente aprobados—artesunato (Arte), albúmina sérica humana (HSA), ácido fólico (FA), y verde indocianina (ICG)—en una sola nanopartícula (FA-IHA NPs). Estas nanopartículas exhiben excepcional estabilidad foto- y fisicoquímica. ICG imparte fluorescencia infrarrojo cercano (NIR) para imagen y confiere capacidades fototérmicas (PTT) y fotodinámicas (PDT) terapéuticas bajo láser único 808 nm. Concurrentemente, irradiación 808 nm desencadena liberación controlada Arte, amplificando eficacia quimioterapéutica. Estudios in vitro e in vivo demuestran captación celular rápida y acumulación tumoral selectiva, verificada por microscopía confocal e imagen NIR en ratones xenoinjertos HepG2. Una sola sesión irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm²) combinada con FA-IHA NPs suprime completamente crecimiento tumoral sin recurrencia. Estos hallazgos establecen FA-IHA NPs como plataforma prometedora para traducción clínica de terapia foto-quimio guiada por imagen.

Antecedentes

Terapia foto-quimio guiada por imagen (IGPC) ha emergido como estrategia convincente para oncología personalizada, uniendo localización tumoral precisa con tratamiento multimodal mientras minimiza daño colateral (1-4). Una plataforma IGPC exitosa debe ser: (i) multifuncional, integrando modalidades diagnósticas y terapéuticas; (ii) biocompatible, estable, y tumor-selectiva (5-8). Imagen fluorescencia, por su alta sensibilidad y resolución temporal favorable, se emplea comúnmente para guía tiempo real (9-16).

Terapia fototérmica (PTT) y fotodinámica (PDT) pueden unificarse bajo irradiación NIR, entregando tanto calor como especies reactivas oxígeno (ROS) para ablatar células tumorales (17-19). Sin embargo, monoterapia a menudo falla erradicar enfermedad residual, llevando a recaída (17-19). Quimioterapia convencional ofrece citotoxicidad sistémica pero sufre no-especificidad y toxicidades asociadas (20-22). Así, IGPC, que combina fototerapia localizada con quimioterapia dirigida, promete superar estas limitaciones.

Nanomedicina ha producido variedad teranósticos IGPC, incluyendo verde indocianina (ICG), nanopartículas basadas metal, nanomateriales carbónicos, y sistemas poliméricos (23-27). ICG, tinte NIR aprobado FDA, ampliamente usado clínicamente para gasto cardíaco, función hepática, y angiografía oftálmica (28-29). Su fuerte absorción 800 nm facilita PTT-PDT eficiente. Sin embargo, ICG libre inestable, se elimina rápido circulación, auto-blanquea, y carece especificidad tumoral (31-32). Encapsulación en portadores como micelas, polímeros, o nanoestructuras proteicas ha mejorado su rendimiento, pero necesidad de compuestos basados ICG más biocompatibles, dirigidos persiste (33-34).

Aquí, diseñamos agente IGPC tumor-dirigido vinculando covalentemente FA e ICG a nanopartículas HSA, encapsulando simultáneamente Arte—compuesto antimalárico natural con actividad anticancerígena probada contra cáncer hígado, pulmón, mama (35). Resultantes FA-IHA NPs aprovechan captación mediada receptor FA, excelente biocompatibilidad HSA, y doble poder terapéutico ICG y Arte. Este constructo multifuncional ofrece imagen NIR, PTT-PDT, y quimio-entrega controlada, posicionándolo como plataforma versátil para traducción clínica.

Métodos

Materiales

Reactivos incluyeron EDC, NHS, Arte (≥99%) Sigma-Aldrich; DAPI y CCK-8 Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH y NH₂-PEG₂₀₀₀-FA Xi'an Ruixi; DMEM y PBS Gibco; ICG-NHS Dojindo. Todos químicos usados tal cual recibidos.

Síntesis y Caracterización FA-IHA NPs

Arte disuelto en DMSO, luego agregado a 15 mL agua. HSA (10 mg) introducido y agitado 3 h temperatura ambiente, seguido entrecruzamiento con 150 µL 0.5% glutaraldehído. Mezcla dializada contra agua destilada (MWCO 8-12 kDa) 24 h para obtener Arte-cargado HSA (Arte-HSA). Activación grupos carboxilo HSA con EDC/NHS seguida conjugación con NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 h, 4 °C) y posterior unión ICG-NHS (30 min, TA). Finales FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NPs) purificados por diálisis 24 h agua desionizada. Eficiencias carga Arte e ICG cuantificadas por espectroscopía UV-vis (carga % = W₁/W₂ × 100%).

Morfología evaluada por TEM (Hitachi). Tamaño hidrodinámico y ζ-potencial medidos por DLS (Malvern Zetasizer). Espectros absorbancia registrados en espectrofotómetro UV-vis Shimadzu. Respuestas fototérmicas medidas usando láser CW 808 nm (1 W/cm²) con temperatura monitorizada por termopar Fluke. Fotostabilidad y longevidad fluorescencia evaluadas 5 ciclos y 30 días, respectivamente.

Liberación Arte Desencadenada Térmica y pH

FA-IHA NPs (50 µg/mL) incubados pH 6.5, pH 7.4, y pH 6.5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², pulso 1 min) por 36 h. Liberación Arte cuantificada por UV-vis a 287 nm en sobrenadante.

Detección Producción Oxígeno Singlete

DPBF (15 µL) mezclado con 1 mL 10 µg/mL ICG o FA-IHA NPs e irradiado (808 nm, 1 W/cm², 5 min). Disminución absorbancia 410 nm tiempo reflejó generación oxígeno singlete.

Cultivo Celular y Captación Celular

Células HepG2 (ATCC) cultivadas DMEM 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C, 5% CO₂. Para estudios captación, células incubadas con ICG libre, IHA NPs, o FA-IHA NPs (0.05 mg/mL ICG) 6 h, lavadas, fijadas, teñidas DAPI, e imagenadas microscopía confocal. Citometría flujo cuantificó tasas internalización.

Generación ROS Intracelular

Células HepG2 (2 × 10⁵ células/mL) tratadas PBS, Arte, FA-HA-NPs, ICG libre, IHA-NPs, o FA-IHA NPs 12 h, luego irradiadas (808 nm, 1 W/cm², 5 min). DCFH-DA (5 µg/mL) agregado 30 min, seguido citometría flujo y microscopía fluorescencia evaluar niveles ROS.

Terapia Foto-Quimio Combinacional In Vitro

Células HepG2 (2 × 10⁴ células/pozo) tratadas ICG libre, Arte, IHA NPs, o FA-IHA NPs (Arte 0-30 µg/mL) 6 h, luego irradiadas (808 nm, 1 W/cm², 5 min) o sin tratar. Viabilidad celular medida CCK-8 tras 24 h. Tinción vivo/muerto (calceína-AM/PI) confirmó citotoxicidad via imagen confocal.

Modelo Animal e Imagen Fluorescencia In Vivo

Ratones Balb/c desnudos (n=5) inyectados subcutáneamente 1 × 10⁶ células HepG2. Imagen IVIS Spectrum (Caliper) rastreó fluorescencia NIR 10 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h post-inyección vena cola ICG libre, IHA NPs, o FA-IHA NPs.

Terapia Foto-Quimio Combinacional In Vivo

Ratones aleatorizados seis grupos (n=5): PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA + NIR, FA-IHA + NIR (dosis Arte igual). Irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 min) aplicada 24 h y 48 h. Volúmenes tumor registrados cada 4 días y expresados relativos a baseline. Post-tratamiento, órganos mayores cosechados para histología H&E.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización FA-IHA NPs

Figura 1 esquemáticamente representa diseño FA-IHA NPs y flujo terapéutico. Nanopartículas ensamblaron vía método simple, biocompatible, integrando ICG para imagen NIR y fototerapia, y Arte para acción quimioterapéutica.

Representación esquemática uso FA-IHA NPs para terapia foto-quimio combinacional guiada imagen tumor-dirigida in vitro e in vivo

Microscopía electrónica transmisión reveló partículas monodispersas, esféricas (~131.2 nm). Dispersión luz dinámica confirmó diámetro hidrodinámico 131 ± 2.3 nm en agua, PBS, y medio celular, con ζ-potencial estable -29.2 ± 1.13 mV. Tamaño inalterado 7 días, indicando robusta estabilidad coloidal conferida por recubrimiento PEG y HSA. Espectros UV-vis mostraron picos característicos Arte e ICG, confirmando carga exitosa (Arte 98.6 ± 3.1%, ICG 56.9 ± 2.4%). Espectros fluorescencia coincidieron ICG libre, confirmando propiedades fotofísicas preservadas.

a Imagen TEM FA-IHA NPs. b, c Distribución tamaño y ζ-potencial FA-IHA NPs en agua, medio celular, y PBS. d Cambio tamaño FA-IHA NPs en agua, medio celular, y PBS. e Espectros absorbancia ICG libre, Arte, y FA-IHA NPs. f Espectros fluorescencia ICG libre y FA-IHA NPs

Evaluación fototérmica mostró FA-IHA NPs (contenido ICG igual) elevaron temperatura ~36 °C en 5 min bajo irradiación 808 nm (1 W/cm²), mientras ICG libre mostró subida similar y agua apenas aumentó (<4 °C). Pruebas fotostabilidad revelaron FA-IHA NPs mantuvieron absorbancia cinco ciclos irradiación, mientras ICG libre perdió intensidad, subrayando efecto protector conjugación covalente y encapsulación HSA/PEG. Longevidad fluorescencia 30 días a 4 °C mostró reducción 28% FA-IHA NPs versus 88% caída ICG libre, destacando superior fotostabilidad.

a Curvas calentamiento fototérmico agua, ICG, y FA-IHA NPs bajo 5 min láser 808 nm (1 W/cm²). b Variaciones temperatura ICG y FA-IHA NPs tras cinco ciclos irradiación 5-min continuos. c Cambio absorbancia FA-IHA NPs a 780 nm antes y después cinco ciclos irradiación. d Cambio fluorescencia ICG y FA-IHA NPs 30 días

Ensayos DPBF demostraron FA-IHA NPs produjeron 58% rendimiento oxígeno singlete estándar en 5 min exposición NIR, superando ICG libre (35%). Esta mejora refleja efecto sinérgico fototerapia dual.

a Absorbancia DPBF normalizada en presencia ICG, FA-IHA NPs, y muestra blanco bajo irradiación láser 808 nm (1 W/cm²). b Cinética liberación Arte desde FA-IHA NPs bajo pH 7.4 y pH 6.5 con o sin irradiación láser NIR, respectivamente

Bajo condiciones ácidas (pH 6.5) e irradiación NIR, liberación Arte desde FA-IHA NPs aumentó 11.6% (pH 7.4) a 68.4% (pH 6.5 + NIR). Los disparadores duales—expansión térmica HSA y alteración carga superficial mediada protones—facilitan liberación fármaco controlada (37-38).

Captación Celular y Detección ROS Intracelular

Imagen confocal reveló pronunciada fluorescencia roja ICG en células HepG2 tratadas FA-IHA NPs, superando ICG libre e IHA NPs. Citometría flujo cuantificó tasa captación 52.3% FA-IHA NPs, marcadamente mayor IHA NPs (25.2%) e ICG libre (3.9%)—clara indicación dirigido receptor mediado FA (39-41).

a Imágenes confocal fluorescentes células HepG2 tras incubación ICG libre, IHA NPs, y FA-IHA NPs. Colores rojo y azul representan fluorescencia ICG y núcleos teñidos DAPI, respectivamente. b Medición citometría flujo intensidades fluorescencia ICG en células HepG2 tras incubación ICG libre, IHA NPs, y FA-IHA NPs

Producción ROS, evaluada con DCFH-DA, fue significativamente mayor en células tratadas FA-IHA NPs tras 5 min irradiación NIR comparado todos otros grupos, confirmando actividad fotodinámica mejorada (Figura 6a,b).

a Imágenes fluorescencia producción ROS en células cáncer tratadas varios fármacos, y b intensidades fluorescentes correspondientes: (1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA NPs, (4) ICG libre + NIR, (5) IHA NPs + NIR, y (6) FA-IHA NPs + NIR

Terapia Foto-Quimio Combinacional In Vitro

FA-IHA NPs lograron mayor aumento temperatura (~31 °C) entre todos tratamientos tras 5 min exposición NIR, correlacionando con superior rendimiento fototérmico (Figura 7a). Sin irradiación, Arte, IHA NPs, y FA-IHA NPs mostraron citotoxicidad dependiente concentración, mientras ICG libre permaneció inerte. Post-irradiación, viabilidad celular cayó drásticamente grupo FA-IHA NPs, atribuible a efectos sinérgicos quimio-fototérmicos. Tinción calceína-AM/PI confirmó muerte celular casi completa FA-IHA NPs + NIR, mientras otros grupos retuvieron células viables (Figura 7d).

a Curvas cambio temperatura PBS, ICG libre, IHA NPs, y FA-IHA NPs-células tratadas en placas 96-pozos tras 5 min irradiación NIR. b, c Viabilidad células tratadas ICG libre, Arte, IHA NPs, y FA-IHA NPs sin o con irradiación láser 808 nm (5 min, 1 W/cm²), respectivamente. d Imágenes tinción dual calceína-AM/PI células tras tratamiento PBS (control), PBS + NIR, FA-IHA NPs, y FA-IHA NPs + NIR, respectivamente

Imagen Fluorescencia In Vivo

Imagen IVIS reveló fuerte fluorescencia cuerpo entero 10 min post-inyección todas formulaciones. Fluorescencia tumor pico 24 h, con FA-IHA NPs exhibiendo mayor señal cada punto tiempo, confirmando acumulación tumoral impulsada FA (Figura 8b). Análisis ex vivo órganos 24 h mostró captación hepática predominante todos grupos, consistente vías clearance hepáticas (Figura 8c).

a Imágenes fluorescencia representativas ratones portadores tumor tras inyección vena cola ICG libre, IHA NPs, y FA-IHA NPs. Círculos negros discontinuos indican región tumor. b Análisis cuantitativo in vivo señal fluorescencia regiones tumor ratones tratados ICG libre, IHA NPs, y FA-IHA NPs función tiempo inyección. c Señal fluorescencia órganos mayores incluyendo corazón, hígado, bazo, pulmones, y riñón

Terapia Foto-Quimio Combinacional In Vivo

Imagen térmica 24 h post-inyección bajo irradiación NIR mostró mayor aumento temperatura (~22.1 °C) FA-IHA NPs, confirmando potente conversión fototérmica (Figura 9a,b). Dos sesiones irradiación (día 0 y día 2) llevaron regresión tumoral completa grupo FA-IHA + NIR, sin recaída 90 días y tasa supervivencia 100%, mientras todos otros grupos fallaron lograr supresión sostenida (Figura 9c,d). Examen histológico reveló sin patología órgano significativa grupo FA-IHA + NIR, subrayando toxicidad sistémica insignificante (Figura 10).

a Temperaturas región tumor ratones portadores tumor tras inyección vena cola PBS, ICG, IHA NPs, y FA-IHA NPs a 24 h bajo 5 min irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm²). b Imágenes térmicas ratones portadores tumor tras inyección vena cola PBS, ICG, IHA NPs, y FA-IHA NPs a 24 h bajo 5 min irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm²). c Perfil crecimiento xenoinjerto HepG2 tras inyección intravenosa PBS, Arte, ICG, IHA NPs, y FA-IHA NPs con o sin 5 min irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm²). d Tasa supervivencia ratones portadores tumor tras inyección vena cola PBS, Arte libre, ICG, IHA NPs, y FA-IHA NPs con o sin 5 min irradiación NIR (808 nm, 1 W/cm²)

Secciones tejido H&E teñidas órganos mayores, incluyendo corazón, hígado, bazo, pulmones, y riñón ratones tratados PBS y FA-IHA NPs

Conclusiones

Hemos diseñado nanopartícula teranóstica multifuncional que conjuga covalentemente FA e ICG mientras encapsula Arte dentro HSA. FA-IHA NPs demuestran robusta estabilidad coloidal y fototérmica, preservan fluorescencia NIR, y liberan Arte bajo irradiación NIR. Captación mediada receptor FA produce alta captación celular y acumulación tumoral, permitiendo asalto sinérgico fototérmico-fotodinámico-quimioterapéutico que erradica tumores in vitro e in vivo sin recurrencia. Estos resultados posicionan FA-IHA NPs como plataforma altamente prometedora para traducción clínica de terapia foto-quimio guiada imagen, tumor-dirigida.

Abreviaturas

Arte:

Artesunato

FA:

Ácido fólico

HSA:

Albúmina sérica humana

ICG:

Verde indocianina

NIR:

Infrarrojo cercano

PDT:

Terapia fotodinámica

PEG:

Polietilenglicol

PTT:

Terapia fototérmica