Nanopartículas de curcumina dirigidas activadas por ultrasonido focalizado de baja intensidad para teranóstica pH-responsiva en cáncer de ovario

Resumen

Se ha desarrollado una nanoplataforma simple y versátil usando nanocajas de ferritina sensibles al pH, co-cargadas con el fármaco anticancerígeno curcumina (Cur) y perfluorohexano líquido (PFH) en el núcleo, y conjugadas con molécula diana tumoral ácido fólico (FA) en la capa externa (FA-FCP). Las FA-FCP sintetizadas presentan diámetro medio de 47 nm, propiedades fisicoquímicas estables y favorables en diferentes medios, y alta biocompatibilidad y bioseguridad in vivo e in vitro. Bajo ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU) y a pH 5,0, FA-FCP libera gran cantidad de fármaco (53,2 %) en 24 h. Tras 4 min de LIFU (7 W), FA-FCP a pH 5,0 proporciona capacidades de imagen por ultrasonido con contraste mejorado. Gracias a la endocitosis mediada por receptor de FA, FA-FCP entra eficientemente en las células y se reubica en lisosomas. A las 18 h post-inyección, la estimulación del tumor con LIFU genera imagen de ultrasonido con contraste. Experimentos in vivo e in vitro muestran que la combinación FA-FCP + LIFU tiene efectos significativos de tratamiento tumoral. Se concluye que FA-FCP combinada con LIFU externo y el ambiente ácido endógeno ofrece potentes funciones teranósticas, proporcionando una nueva opción no invasiva e integrada de teranóstica tumoral.

Introducción

El cáncer de ovario es una enfermedad altamente metastásica y letal con alta mortalidad. Al no presentar síntomas tempranos evidentes, la mayoría de pacientes son diagnosticados en estadio avanzado con células altamente metastásicas. Los tratamientos habituales son cirugía citorreductora y quimioterapia, con una supervivencia a 5 años muy baja en enfermedad avanzada. Es urgente desarrollar nuevas estrategias de diagnóstico y tratamiento para mejorar la supervivencia global. Recientemente, nanoplataformas que combinan terapia dirigida e imagen diagnóstica ofrecen una alternativa para el tratamiento efectivo de tumores.

En los últimos años, las nanoplataformas de respuesta acústica (ARN) se usan ampliamente en investigación de diagnóstico y tratamiento tumoral. Suelen diseñarse como microburbujas (MB) o nanopartículas (NP). Frente a las MB, las NP ofrecen menor tamaño, mayor permeabilidad, ciclo farmacocinético más largo, mejor estabilidad y mayor facilidad de modificación superficial. Diversos fluorocarbonos líquidos de transformación de fase (perfluoropentano PFP, perfluorohexano PFH, perfluorooctil bromuro PFOB) se usan para lograr respuesta acústica. Estos pueden producir burbujas, e incluso estallar, mediante vaporización de gotas acústica (ADV) bajo ultrasonido focalizado externo, proporcionando a la ARN capacidades de contraste de ultrasonido mejoradas. Entre ellos, PFP tiene bajo punto de ebullición (29,2 °C) y riesgo de embolismo gaseoso; PFOB requiere ultrasonido de ultra-alta intensidad (punto de ebullición 144 °C). PFH (punto de ebullición 56 °C) se considera ideal. Al ser hidrofóbico, es conveniente encapsularlo en nanopartículas para hacerlo hidrosoluble. Diversos materiales (liposomas, PLGA, mesoporosos orgánicos, polímeros orgánicos) se han reportado para encapsular fluorocarbonos líquidos, pudiendo también cargar fármacos anticancerígenos para dotar a la ARN de función quimioterapéutica y liberación de fármaco controlada acústicamente. Aunque estas ARN muestran buenas capacidades integradas de diagnóstico y tratamiento, la biocompatibilidad de los nanotransportadores sigue siendo una preocupación para la traducción clínica. Recientemente, nanocajas de ferritina libres de hierro se usan ampliamente como vehículos de fármacos por ser proteínas endógenas y tener alta sensibilidad al pH: se desensamblan en ambientes ácidos y reensamblan en alcalinos, lo que confiere alta biocompatibilidad y capacidad controlada de carga y liberación de fármacos.

En este estudio, se usó ferritina como transportador para cargar PFH y curcumina (Cur), y se modificó la superficie con molécula diana FA para obtener una nanoplataforma multifuncional (FA-FCP). La curcumina, polifenol natural extraído de la cúrcuma, tiene efectos anticancerígenos favorables pero mala solubilidad acuosa. FA-FCP mejora la solubilidad de PFH y Cur, tiene alta estabilidad fisiológica en diferentes medios, y biocompatibilidad y bioseguridad favorables in vivo e in vitro. Bajo LIFU y pH 5,0, libera gran cantidad de fármaco en 24 h (53,2 %). Tras 4 min de LIFU (7 W) a pH 5,0, proporciona imagen de ultrasonido con contraste. Por endocitosis mediada por receptor FA, FA-FCP entra fácilmente en células y se reubica en lisosomas. A las 18 h post-inyección, la estimulación del tumor con LIFU genera imagen con contraste. Experimentos in vivo e in vitro muestran efecto significativo en el tratamiento tumoral. Estas ventajas (no invasiva, dirigida por ligando/receptor, transición de fase/estallido desencadenada por LIFU, liberación precisa de fármaco) convierten a FA-FCP en una prometedora nanoplataforma teranóstica tumoral.

Materiales y métodos

Materiales

Ferritina (FRT), ácido fólico (FA), perfluorohexano (PFH) de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Curcumina (Cur) de Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA y NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH de Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd (China). EDC y NHS de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Kit CCK-8 de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japón). DMEM, PBS, penicilina-estreptomicina, tripsina-EDTA, suero fetal bovino (FBS) de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.).

Preparación de FA-FCP

Primero, 10 mg FRT en 10 ml agua. 10 mg Cur en 0,3 ml DMSO. Ambas soluciones y 1 ml PFH se mezclaron a pH 5,0 con ultrasonidos en baño de hielo 30 min. Luego, pH ajustado a 7,4 para obtener FRT cargado con Cur y PFH (FCP). Segundo, FA se conjugó covalentemente a FCP mediante método de carbodiimida: 5 mg NH₂-PEG₂₀₀₀-FA añadidos a solución FCP con EDC (5 mg/ml) y NHS (20 mg/ml). Reacción 3 h a temperatura ambiente con agitación suave. Purificación por diálisis contra agua destilada (corte MW 12 kDa) 24 h, obteniendo FA-FCP. Ratio de carga de Cur detectado por espectrofotómetro UV-Vis a 426 nm.

Caracterizaciones

Tamaño y potencial zeta por Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, Reino Unido). Morfología por microscopía electrónica de transmisión (TEM, Hitachi, Japón) y microscopía de fuerza atómica (AFM, Agilent 5500LS). Captación celular por microscopía confocal de barrido láser (LEXT OLS4100, Olympus, Japón) y citometría de flujo (BD, Franklin Lakes, NJ). Espectros de absorción por espectrofotómetro UV-Vis (UV1800, Shimadzu, Japón).

Cultivo celular y modelo animal

Línea celular humana de cáncer de ovario SK-OV-3 del Instituto de Biología Celular de Shanghai, Academia China de Ciencias. Cultivo en DMEM con 10 % FBS y 1 % penicilina-estreptomicina, 5 % CO₂, 37 °C.

Ratones Balb/c nu/nu (hembras, ~5 semanas) de Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Beijing, China). Modelo tumoral SK-OV-3: 1×10⁶ células inyectadas subcutáneamente en flanco derecho. Procedimientos según directrices de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Academia de Ciencias Médicas de Sichuan, aprobados por su Comité de Ética.

Liberación de Cur desencadenada por pH/LIFU

Solución acuosa FA-FCP dividida en cuatro porciones en bolsas de diálisis (MW 5000), dializadas contra 10 ml PBS pH 5,0 y 7,4. Tras 3 h, irradiación con o sin LIFU (7 W, 5 min, ciclo de trabajo 50 %, modo pulso). En tiempos determinados, 1 ml de dializado retirado y repuesto con igual volumen y pH de solución blanca. Cur medido por espectrómetro UV-Vis.

Propiedades ADV e imagen por ultrasonido de FA-FCP

FA-FCP a pH 5,0 y 7,4 irradiado con LIFU de distinta potencia (5, 6, 7 W) y duración (3, 4, 5 min) en modelo de gel de agarosa. Imágenes US observadas con equipo Esaote Mylab 90 (Italia), frecuencia 5–12 MHz, índice mecánico 0,06. Intensidad US en región de interés analizada con software ImageJ.

Capacidad de direccionamiento de FA-FCP

Para demostrar direccionamiento in vitro, FITC usado para marcar nanopartículas. 1 mg FITC en 1 ml DMSO mezclado con FCP y FA-FCP 30 min con agitación suave. Diálisis nocturna en agua desionizada para eliminar FITC y DMSO libres, obteniendo nanopartículas marcadas con FITC. Células cultivadas 24 h, luego incubadas con nanopartículas marcadas 3 h. Lavado con PBS (3×), tinción con DAPI 5 min, LysoTracker Red 10 min, fijación con paraformaldehído 4 % 15 min. Observación por microscopio confocal láser. Señales de fluorescencia intracelular medidas y analizadas por citometría de flujo.

Circulación sanguínea y acumulación tumoral de FA-FCP

Cur libre y FA-FCP (misma concentración de Cur) inyectados por vía intravenosa en ratones normales. Sangre recogida en plexus orbitario en distintos tiempos, lisada. Concentración de Cur en sangre por espectros de absorbancia UV-Vis, expresada como % dosis inyectada por gramo de tejido (ID%/g).

Contenido de FA-FCP en tumor en ratones portadores de tumor. Tras 0, 1, 6, 12, 18, 24 h post-inyección IV, tejidos tumorales recogidos, pesados, digeridos con agua regia 24 h. Cur medido por UV-Vis, expresado como ID%/g.

Eficacia anticancerígena in vitro e in vivo

In vitro: células tratadas con PBS, Cur, FA-FCP, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU (misma dosis Cur 5 mg/kg) 3 h, luego irradiadas con LIFU (5 min, 7 W). Incubación 21 h más. Viabilidad por ensayo CCK-8.

In vivo: ratones portadores de tumor divididos aleatoriamente en 5 grupos (n=6), inyección IV de suero salino (control), Cur libre, FA-FCP, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU. Durante 24 días, volumen tumoral y peso corporal monitorizados cada 3 días. Volumen tumoral = largo×ancho²/2. Crecimiento tumoral mostrado como volúmenes relativos V/V₀ (V₀ volumen inicial).

Evaluación de bioseguridad

Células SK-OV-3 en placa 96 pocillos (1×10⁴ células/pocillo) 24 h. Concentraciones varias (0, 20, 40, 100, 200, 500 μg/ml) de FA-FRT-PFH cultivadas con células. Tras 24 h, medio DMEM con 10 % CCK-8 20 min en incubadora. Absorbancia a 450 nm por lector multimodo (Thermo Scientific) para viabilidad celular. Órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) de ratones sanos a 25 días post-inyección IV de FA-FCP, recogidos y analizados por tinción hematoxilina-eosina (H&E). Imágenes H&E observadas por microscopía óptica.

Análisis estadístico

Datos como media ± desviación estándar. Procesados con SPSS 22.0. Test t de Student para significancia entre dos grupos. p < 0,05 diferencia significativa.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de FA-FCP

El Esquema 1 ilustra la síntesis de FA-FCP y su aplicación en imagen por ultrasonido (US) y quimioterapia combinada US in vitro e in vivo. FA-FCP se preparó mediante autoensamblaje simple y biocompatible. Imágenes TEM y AFM muestran estructura esférica (Fig. 1a, recuadro y Archivo adicional 1: Fig. S1). DLS: diámetro medio ~47 nm, potencial zeta medio ~-37 mV en agua (Fig. 1a, b). Tras 4 semanas en agua, PBS, suero salino y FBS, FA-FCP mostró estabilidad en tamaño (Fig. 1c), indicando estabilidad fisiológica favorable, probablemente por recubrimiento PEG y naturaleza de FRT. Espectro UV-Vis-NIR de FA-FCP muestra pico de absorción de Cur, confirmando su presencia. Ratio de carga de Cur: 125,8 ± 2,1 %.

Liberación de Cur desencadenada por pH/LIFU

Fig. 2 muestra perfil de liberación de Cur de FA-FCP a diferentes pH con/sin LIFU. Sin LIFU, liberación a pH 5,0 ~30 % en 24 h, significativamente mayor que a pH 7,4 (5,3 %). Con LIFU (7 W, 4 min), liberación en ambos pH aumenta bruscamente, pero a pH 5,0 (50 %) es claramente superior en 24 h. Esto hace a FA-FCP muy útil en el microambiente tumoral. La excelente liberación se debe a: (1) FRT en medio ácido se desensambla y abre la nanocaja liberando Cur cargado; (2) LIFU induce transición de fase instantánea permitiendo que Cur escape de la cáscara porosa expandida de forma sostenida.

Efecto ADV in vitro de FA-FCP

FA-FCP expuesto a LIFU (5, 6, 7 W) durante 3–5 min a pH 7,4 o 5,0 para evaluar mejores condiciones. Intensidad US representa efecto ADV. Según imágenes US (Fig. 3a, b) y valores medios de escala de grises (Fig. 3c, d), el efecto ADV muestra tendencia dependiente de tiempo/potencia a pH 7,4, con pico a 7 W durante 5 min. A pH 5,0, pico a 7 W durante 4 min. Parámetros inferiores a 5 W/3 min: burbujas insuficientes para optimizar imágenes US; superiores a 7 W/4 min: la mayoría de burbujas colapsan y desaparecen. Resultados indican que estimulación cierta es esencial para activar ADV de FA-FCP: 7 W y 4 min a pH 5,0.

Capacidad de direccionamiento de FA-FCP

Colorante clásico FITC usado para marcar nanopartículas. Archivo adicional 1: Fig. S2 muestra que intensidad de fluorescencia de FCP y FA-FCP marcados con FITC a misma concentración no difiere significativamente, indicando que diferencia en cantidad de FITC marcado no influye en experimento de captación celular. Imágenes de fluorescencia y análisis FCM: algo de FCP entra en células (ratio captación 19,5 %) (Fig. 4a, b), posiblemente por receptores de ferritina en superficie celular. Tras conjugación con FA, FA-FCP muestra alta señal fluorescente en células con ratio captación 44,3 %, que colapsa a 13,8 % si células pretratadas con FA libre (Fig. 4a, b). Esto indica que conjugación FA aumenta 크게 la captación por endocitosis mediada por receptor FA.

Localización orgánulo: tinción específica lisosomas (LysoTracker Red). Fig. 4c: células tratadas con FA-FCP y LysoTracker Red muestran fluorescencia verde y roja intensa en citoplasma. Tras fusión, fluorescencia amarilla intensa visible, indicando que FA-FCP se reubica en lisosomas (pH ≈ 5,0), beneficioso para desencadenar liberación de fármaco intracelular.

Circulación sanguínea y acumulación tumoral de FA-FCP

Fig. 5a: vida media de FA-FCP ~7,31 h (aumento 8 veces) vs Cur libre, probablemente por recubrimiento PEG y encapsulación FRT. Vida media prolongada en torrente sanguíneo beneficia retención del fármaco en circulación sistémica, facilitando acumulación en tumor. Fig. 5b: acumulación dinámica de Cur libre y FA-FCP en tumor 0–24 h post-inyección. FA-FCP muestra máxima acumulación a 18 h; Cur libre a ~1 h. FA-FCP tiene acumulación significativamente mayor en tejido tumoral, posiblemente por efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) y direccionamiento activo mediado por receptor FA.

Imagen por ultrasonido in vivo

Tumores de ratones nu en 4 grupos (control + LIFU, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU, FA-FCP sin LIFU) observados con/sin exposición a LIFU (7 W, 4 min) para explorar potencial ADV in vivo. Fig. 6a: sin señal US obvia en control bajo LIFU. A 18 h post-inyección, señal US significativamente más fuerte en tumor en grupo FA-FCP + LIFU vs FCP + LIFU y FA-FCP sin LIFU (Fig. 6a, b). FA-FCP + LIFU mejora contraste de imagen US del tumor.

Terapia anticancerígena in vitro e in vivo

Citotoxicidad in vitro por CCK-8 (Fig. 7a). Viabilidad celular en todos los grupos muestra patrón dependiente de concentración de Cur. Sin LIFU, FA-FCP muestra mayor inhibición que Cur libre a todas las concentraciones, posiblemente por efecto direccionamiento FA. Sin embargo, FA-FCP + LIFU inhibe significativamente más que FP + LIFU, FCP + LIFU y FA-FCP sin LIFU, indicando que FA-FCP combinado con LIFU ofrece mejor eficiencia anti-tumoral. Debido a presencia de LIFU y ambiente ácido lisosomal, ambos inducen liberación de fármaco y efecto cavitación, y efecto direccionamiento FA.

Efecto anticancerígeno in vivo en ratones nu portadores de tumor. Según acumulación tumoral, LIFU aplicado 18 h post-inyección IV cada 2 días, 3 veces total desde día 1. Fig. 7b, c: volumen tumoral relativo en grupo FA-FCP + LIFU disminuye significativamente vs control, Cur, FA-FCP, FP + LIFU, FCP + LIFU tras 24 días. Peso tumoral en grupos FA-FCP y FCP + LIFU significativamente menor que control y Cur, aún más inhibido en FA-FCP + LIFU. Sin pérdida significativa de peso corporal en ningún grupo (Fig. 7d). El brillante efecto anti-tumoral de FA-FCP + LIFU se debe a agregación dirigida en tumor y capacidad de liberación de fármaco responsiva a acústica/pH. Además, eficacia terapéutica mejorada podría explicarse por retención retrasada de nanopartículas en tumor debido a vida media prolongada de FA-FCP en sangre.

Biocompatibilidad in vitro e in vivo

Evaluada por CCK-8 y tinción H&E. Fig. 8a, b: viabilidad celular de FA-FP portador de fármaco y potencia LIFU 0–8 W todas > 90 %, indicando no citotoxicidad significativa in vitro. Fig. 8c: imágenes H&E de órganos principales de ratones tratados con FA-FCP + LIFU, sin cambios histológicos vs grupo control. Resultados demuestran alta biocompatibilidad de FA-FCP in vitro e in vivo.

Conclusión

En resumen, se preparó una FA-FCP multifuncional cargada con fármaco anticancerígeno Cur y molécula diana FA, usando nanocajas de ferritina, resultando en capacidad de imagen US con contraste mejorado y direccionamiento preciso en quimioterapia. FA-FCP muestra alta biocompatibilidad in vitro e in vivo. Además, exhibe excelente capacidad de direccionamiento tumoral, liberación de Cur desencadenada por acústica/pH, y transición de fase responsiva a acústica por LIFU para imagen US. Dadas estas propiedades únicas, FA-FCP puede aplicarse como factor significativo de inhibición tumoral sin toxicidad sistémica. Se espera que esta novedosa y biocompatible nanoplataforma teranóstica integre imagen por ultrasonido con eficacia terapéutica mejorada, proporcionando un paradigma prometedor para el tratamiento del cáncer.

Disponibilidad de datos y materiales

Las conclusiones de este manuscrito se basan en los datos (texto principal y figuras) presentados y mostrados en este artículo.

Abreviaturas

US:

Ultrasonido

FA:

Ácido fólico

FRT:

Ferritina

PFH:

Perfluorohexano

LIFU:

Ultrasonido focalizado de baja intensidad

ADV:

Vaporización de gota acústica

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

CCK-8:

Kit de conteo celular-8

FBS:

Suero fetal bovino

EDC:

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

NHS:

N-hidroxisuccinimida

Cur:

Curcumina