Nanopartículas de quitosano-albúmina de suero bovino cargadas con curcumina potencialmente mejoraron la fagocitosis de Aβ 42 y la polarización de macrófagos modulada en la enfermedad de Alzheimer

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo marcado por un inicio insidioso y una progresión en el deterioro cognitivo. Histopatológicamente, amiloide-β (Aβ) 42 como un péptido que contiene 42 aminoácidos se agrega en filbrils de amiloide β-péptido caracterizados por “placas seniles” extracelulares en la EA, induciendo así la apoptosis neuronal y la pérdida de sinapsis [1,2,3] . Generalmente, los monómeros Aβ 42 son fisiológicamente solubles y no tóxicos, mientras que sus oligómeros son más tóxicos in vitro e in vivo [4, 5]. Por lo tanto, intervenir en la agregación de Aβ 42 mediante la eliminación del monómero Aβ 42 se considera ampliamente como el objetivo terapéutico más apropiado para la EA [6, 7, 8, 9]. Es bien sabido que los péptidos Aβ pueden desencadenar la activación microglial al interactuar con varios receptores tipo Toll (TLR), incluido TLR4, y también promueven la fagocitosis dependiente de CD14, TLR4 o TLR2 y el aclaramiento de Aβ 42 [10, 11,12]. Aunque la activación microglial puede promover el aclaramiento de Aβ 42, las células microgliales, un tipo de macrófago mononuclear, posiblemente estén sobreactivadas y polarizadas al fenotipo M1 (caracterizado por la liberación de factores solubles potencialmente neurotóxicos y citocinas proinflamatorias), lo que lleva a a la muerte neuronal y exacerbando el desarrollo de EA. Por el contrario, algunas células microgliales son del fenotipo clásicamente activado (M2) caracterizado por la producción de citocinas antiinflamatorias; estos mejoran la disfunción cognitiva en la EA [13,14,15,16]. Por lo tanto, la proporción de macrófagos de tipo M1 / ​​M2 puede afectar significativamente la progresión de la EA [17, 18]; Además, la regulación positiva necesaria para convertir los macrófagos proinflamatorios M1 en antiinflamatorios M2 mostrará un potencial prometedor en la prevención y el tratamiento de la EA.

La curcumina, que se origina a partir de un componente de la cúrcuma de la India (Curcumin longa), un tipo de jengibre, es un potente agente antiinflamatorio que puede reducir la inflamación e incluso puede desempeñar un papel en el tratamiento de la EA [19]. En años recientes, se encontró que la curcumina posee propiedades anti-amiloidogénicas, antiinflamatorias, antioxidantes y quelantes de metales que pueden tener efectos neuroprotectores potenciales [20, 21]. La curcumina modula la polarización de los macrófagos a través de la inhibición de las vías de la proteína quinasa activada por mitógenos del receptor 4 (TLR4-MAPK) / NF-κB [22,23,24]. Sin embargo, la escasa estabilidad y biodisponibilidad de la curcumina limitan su aplicación clínica. Además, la presencia de la barrera hematoencefálica (BHE) también previene la penetración de la curcumina en el tratamiento de la EA [25,26,27].

Para mejorar el transporte de fármacos desde la sangre al cerebro, las nanopartículas (NP) con superficie funcionalizada con péptidos [28] y anticuerpos [29] ayudan a la liberación de fármacos a través de la BBB y la eficiencia de penetración de la BBB podría mejorarse significativamente mediante mecanismos de transporte activo. que la simple difusión pasiva [30]. Las NP de quitosano (CS), un nanoportador para asociarse con Aβ, pueden penetrar en la BHE y no son inmunogénicas [31]. Además, se encontró albúmina sérica en el plasma circulante del cuerpo humano en concentraciones de 50 g / L de suero, y no era tóxica y bien tolerada por el sistema inmunológico [32, 33]. También se informó que las nanopartículas derivadas de albúmina de suero bovino (BSA) tienen propiedades de liberación sostenida que pueden aumentar la vida media del fármaco, disminuyendo así la frecuencia de administración y aumentando el cumplimiento del paciente [34]. Por lo tanto, usamos CS y BSA como los dos biomateriales para preparar NP de CS-BSA cargados con curcumina para lograr la mejor penetración de BBB. Se investigaron los efectos de la curcumina sobre la fagocitosis de Aβ 42, la secreción de citocinas inflamatorias y la regulación de las vías TLR4-MAPK / NF-κB para confirmar aún más el mecanismo molecular de la curcumina sobre la polarización de los macrófagos.

Materiales

Se adquirió CS con un grado de desacetilación del 80% y un peso molecular de aproximadamente 400 kDa de Haixin Biological Product Co., Ltd. (Ningbo, República Popular de China). BSA se compró a Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.), Y la curcumina se compró a Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, República Popular de China). El FITC-β-amiloide (1–42) se compró a Chinese Peptide Co., Ltd. (Hangzhou, República Popular de China). Los otros productos químicos adquiridos eran de grado analítico y se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co.La línea celular de macrófagos, RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de monocitos leucémicos de ratón) y la línea celular endotelial microvascular cerebral (hCMEC / D3), que sirvió como modelo de la BBB humana, fueron establecidas por el Instituto de Biología Celular de Shanghai, Academia de Ciencias de China, Shanghai (República Popular de China). Ambas celdas se mantuvieron a temperaturas de 37 ° C y con un 5% de CO ₂ atmósfera, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (volumen / volumen) y antibióticos (100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). Se informó que las células RAW 264.7 tratadas con lipopolisacárido (LPS) recapitulan aspectos de las células microgliales observadas en enfermedades neurodegenerativas ejemplificadas por la EA [35, 36]. Por lo tanto, se aplicaron células de la línea celular de macrófagos RAW 264.7 polarizadas al fenotipo M1 por lipopolisacárido (LPS; 1 μg / ml) para simular células microgliales en la EA.

Preparación de NP CS-BSA cargados con curcumina

Según nuestro informe anterior [37], bajo una interacción electrostática, CS con carga positiva podría conjugarse con BSA con carga negativa para formar NP. El método de preparación fue el siguiente:se usó ácido acético al 0.1% para disolver CS para obtener una solución a 0.5 mg / mL de CS y se agregaron 100 μL de DMSO que contenían 0.05 mg / mL de curcumina a la solución CS para mezclar completamente bajo presión magnética. agitando a temperatura ambiente. Como cantidad apropiada de solución de BSA, se vertió lentamente 1,0 mg / ml en la mezcla de CS y curcumina; en este punto, apareció el fenómeno de opalescencia y las NP de CS-BSA se condensaron aún más en partículas sólidas. Además, se investigó el tamaño, la polidispersidad, el potencial zeta y la morfología de los NP. La liberación de fármacos in vitro a partir de NP se estimó utilizando un método informado anteriormente [37]. La eficiencia de encapsulación (EE,%) de la curcumina en NP se calculó utilizando la siguiente ecuación.

\ (\ mathrm {EE} \% =\ frac {W _ {\ mathrm {total}} - {W} _ {\ mathrm {gratis}}} {W _ {\ mathrm {total}}} \ times 100 \% \ )

W _total fue la cantidad de curcumina agregada inicialmente, W _gratis fue la cantidad de curcumina que quedó en el sobrenadante.

Evaluación de la apoptosis celular por MTT

Para determinar la seguridad de las NP de CS-BSA en la apoptosis celular, se utilizó un ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular. De acuerdo con el protocolo de nuestro estudio anterior, se utilizaron diferentes cantidades de NP de CS-BSA en blanco para tratar células RAW 264.7 (fenotipo M1) y células hCMEC / D3 durante 24 ha 37 ° C para su posterior análisis.

Estudios de penetración utilizando un modelo BBB in vitro

Un cultivo transwell monocapa que utiliza la línea celular endotelial microvascular del cerebro, hCMEC / D3, es un modelo común de BBB in vitro que se utiliza para estudiar la liberación cerebral de NP. La mezcla de células hCMEC / D3 (en 0.5-1.0 mL de volumen total) se agregó al inserto en la cámara superior de una placa transpocillo de 12 pocillos para cultivo celular monocapa con una resistencia eléctrica transendotelial> 300 Ω; Se añadió PBS a un nivel de pH de 7,4 en la cámara inferior. La curcumina libre y la suspensión de NP de CS-BSA cargadas con curcumina se colocaron en la cámara superior para la incubación continua durante 3 h en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ . Posteriormente, la curcumina libre y las NP de CS-BSA cargadas con curcumina se transfirieron a través de las células y se introdujeron en la cámara inferior. La cuantificación de los NP penetrados se detectó utilizando un lector de microplacas (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) Comprobando la intensidad de fluorescencia de la curcumina, que se excita a 425 nm y se emite a 530 nm. La relación de fluorescencia relativa (RFR,%), que representa las tasas de penetración de las NP, se calculó determinando la relación entre la intensidad de fluorescencia de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina penetradas en la cámara inferior y la de la curcumina añadida inicialmente. cargados NP de CS-BSA en la cámara superior. Diferentes inhibidores endocíticos, como clorpromazina (que inhibe la captación mediada por clatrina) a 10 μg / mL, genisteína (captación mediada por caveolas) a 1 μg / mL, citocalasina D (30 μM, macropinocitosis) y 20 μg / mL de sodio azida (un inhibidor de la energía), se utilizaron para determinar varias vías endocíticas implicadas en los diversos mecanismos de penetración. La tasa de penetración relativa se determinó comparando las tasas de penetración de NP tratadas con inhibidores con las de NP tratadas con no inhibidores.

La absorción celular de NP CS-BSA cargados con curcumina

La distribución y ubicación de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina en células RAW 264.7 (fenotipo M1) se observó mediante microscopía de barrido láser confocal (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokio, Japón). La mezcla de células hCMEC / D3 (en 0.5-1.0 mL de volumen total) se agregó al inserto en la cámara superior de la placa Transwell de 12 pocillos para cultivo celular monocapa con una resistencia eléctrica transendotelial> 300 Ω. Se sembraron células RAW 264.7 (fenotipo M1) en la cámara inferior. Se colocó curcumina libre y una suspensión de NP de CS-BSA cargadas con curcumina en la cámara superior para la incubación continua en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ . A intervalos predeterminados, se observaron las distribuciones celulares de curcumina libre y NP de CS-BSA cargadas con curcumina en células RAW 264.7 (fenotipo M1) mediante la detección de la fluorescencia verde emitida por la curcumina mediante microscopía de barrido láser confocal.

Detección de la fagocitosis de Aβ 42 inducida por curcumina libre y NP CS-BSA cargadas con curcumina

Se sembraron células RAW 264.7 (fenotipo M1) en medio de crecimiento completo en una placa de 12 pocillos (1 × 10 ⁵ células / pocillo) y se trató con curcumina libre y NP de CS-BSA cargados con curcumina durante 24 ha 37 ° C. Para eliminar la curcumina no internalizada y las NP CS-BSA cargadas con curcumina, se usó agua destilada para lavar las células en poco tiempo dos veces. Se encontró que la curcumina y las NP de CS-BSA cargadas con curcumina se eliminaron por completo del medio, y no hubo riesgo obvio de que las células del agua destilada indujeran una baja osmolaridad porque la morfología de las células lavadas con agua destilada estaba intacta y no había explosión de células. fue observado. Finalmente, se añadió Aβ 42 libre marcado con FITC disuelto en PBS (pH 7,4) a la placa para incubación continua durante 3 h. La fagocitosis de Aβ 42 marcado con FITC en células RAW 264.7 (fenotipo M1) se representó detectando la fluorescencia verde emitida por FITC. La fagocitosis intracelular y la ubicación de Aβ 42 dentro de las células se estudiaron más a fondo mediante microscopía de barrido láser confocal (FluoView FV10i; Olympus Corporation).

Ensayo de transferencia Western

Para explorar el posible mecanismo molecular de la polarización de macrófagos mediada por la curcumina, examinamos los niveles de expresión de citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF) -α y la interleucina (IL) -6, y los niveles de fosforilación de ERK, JNK , p38 y NF-κB mediante Western blot para obtener efectos específicos de estudios adicionales de la curcumina en la vía de señalización TLR4-MAPK / NF-κB.

Resultados

La caracterización de NP CS-BSA cargadas con curcumina

Se investigaron las características de las NP para determinar su tamaño de partícula, potencial zeta y morfología utilizando un Zetasizer (Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) y un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (Jeol, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 200 kV. Los resultados mostrados en la Fig. 1 indicaron que las NP de CS-BSA presentaban un tamaño medio a 143,5 nm, un potencial zeta negativo a - 10,8 mV y una polidispersidad a 0,021, respectivamente. Se observó que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina tenían forma esférica y estaban monodispersas. La suspensión resultante que contenía NP de CS-BSA cargadas con curcumina se centrifugó para obtener una solución sobrenadante para determinar la absorbancia de curcumina y calcular el contenido de curcumina libre en la solución sobrenadante de acuerdo con la curva estándar. La eficiencia de encapsulación (EE,%) de curcumina en NP se valoró en 95,4%. En términos del proceso de liberación del fármaco de las NP, las NP CS-BSA cargadas con curcumina mostraron un patrón de liberación bifásica en el medio con un nivel de pH de 7,4. Aproximadamente el 11,3% de todos los fármacos se liberaron dentro de las primeras 3 h, lo que indica que cuando los NP entraron en la circulación sanguínea antes de alcanzar la BBB, la curcumina estaba bien protegida y encapsulada en el núcleo de los NP. Además, algunos fármacos se filtraron de los NP y se liberaron a la sangre en las primeras 3 h. La mayoría de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina podrían transportarse alrededor de la BBB y mejorar la concentración del fármaco alrededor del cerebro.

Caracterización de NP CS-BSA cargadas con curcumina. un Imagen TEM de NP CS-BSA cargadas con curcumina. b Análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina obtenidas. c Análisis de potencial zeta de las NP CS-BSA cargadas con curcumina obtenidas. d El perfil de liberación in vitro de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina obtenidas en solución salina tamponada con fosfato con un pH de 7,4 a 37 ° C durante 48 h

Estudios de penetración utilizando un modelo BBB in vitro

Las tasas de penetración de la curcumina libre y los NP se evaluaron verificando la intensidad de fluorescencia de la curcumina en la cámara inferior utilizando un lector de microplacas (Synergy-2; BioTek Instruments), y se calcularon determinando la proporción de la intensidad de fluorescencia de la curcumina penetrada. NP CS-BSA cargados en la cámara inferior a la de los NP CS-BSA cargados con curcumina inicialmente añadidos en la cámara superior. Los resultados (Fig. 2) mostraron que el proceso de penetración de curcumina libre y CS-BSA NPs cargados con curcumina siguió patrones dependientes del tiempo, y la tasa de penetración aumentó con el tiempo. Esto sugirió que la tasa de penetración de la curcumina libre fue del 12,3% a la 1 h, del 20,3% a las 2 hy del 29,8% a las 3 h. En comparación con la curcumina libre, se mejoró la eficiencia de penetración de los CS-BSA NP cargados con curcumina, como lo representa el aumento de las tasas de penetración; las tasas de penetración aumentaron al 37,7% a la 1 h, al 45,6% a las 2 hy al 60,2% a las 3 h. Esto indicó que la curcumina libre puede encontrar dificultades para penetrar a través de las células y mostró poca permeabilidad a la BBB [38, 39]. Esta observación también indicó que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina podrían promover eficazmente la penetración del fármaco a través de las células, lo que sugiere el papel que desempeñan varias vías endocíticas. Una prueba de inhibición de la endocitosis mostró que, en consonancia con los informes anteriores [40], la curcumina libre dependía de la difusión pasiva para la penetración y que no había una variación obvia en la eficacia de penetración de la curcumina libre, independientemente de si se añadió o no un inhibidor. Por el contrario, la penetración de las NP dependía de la energía y la proporción relativa de penetración tratada con azida sódica era del 55,6%. Además, tanto las caveolas como la macropinocitosis mediaron principalmente las vías endocíticas de las NP. En comparación con el tratamiento con no inhibidores, las proporciones relativas de penetración en las células tratadas con genisteína y citocalasina D fueron 67,8% y 60,3%, respectivamente.

Análisis del mecanismo de penetración de curcumina libre y NP de CS-BSA cargadas con curcumina a través de células hCMEC / D3. un Análisis del espectro de fluorescencia de las tasas de penetración de curcumina libre y NP CS-BSA cargadas con curcumina. Los resultados se expresan como medias ± desviación estándar ( n =3). * P <0.05, ** P <0,01 frente a las tasas de penetración de la curcumina libre a 1 h. ^## P <0,01 frente a las tasas de penetración de las NP de CS-BSA cargadas con curcumina a 1 h. b Efectos de los inhibidores endocíticos sobre la capacidad de penetración de la curcumina libre y las NP CS-BSA cargadas con curcumina. Los resultados se expresan como medias ± desviación estándar ( n =3). ^## P <0,01 frente a la relación de penetración relativa de NP de CS-BSA cargadas con curcumina tratadas con clorpromazina

Evaluación de la apoptosis celular por MTT

Los efectos citotóxicos de las NP de CS-BSA en blanco contra células RAW 264.7 (M1) y hCMEC / D3 se estimaron in vitro mediante un ensayo MTT. Las células se trataron con diversas concentraciones de NP de CS-BSA que oscilaron entre 0 y 2,0 mg / ml. Un ensayo de viabilidad celular en la Fig. 3 mostró que no se observaron actividades citotóxicas obvias en células RAW 264.7 y células hCMEC / D3 cuando se trataron con NP de CS-BSA en blanco [37].

Viabilidad de células RAW 264.7 (M1) y células hCMEC / D3 después de la incubación con diferentes cantidades de NP de CS-BSA desnudas durante 24 h ( n =3)

Distribución y captación celular de NP

Se usaron curcumina libre y CS-BSA NP cargados con curcumina que contenían la misma cantidad de curcumina a 100 μg / ml para tratar células RAW 264.7 (M1), y la distribución y absorción celular de curcumina se observaron mediante microscopía de barrido láser confocal (FluoView FV10i; Olimpo). Puede verse en la Fig. 4 que la distribución intracelular de curcumina libre y NP de CS-BSA cargadas con curcumina siguió un patrón dependiente del tiempo y que la fluorescencia verde de la curcumina se había acumulado dentro de la célula y se había dispersado por todo el citoplasma. Con el paso del tiempo, se potenció la intensidad de la fluorescencia verde dentro de las células. Esto demostró que la fluorescencia verde emitida por la curcumina libre dentro de las células era muy débil, lo que indicaba que la mayor parte de la curcumina libre no era absorbida por la línea celular de macrófagos, RAW 264.7. Como las NP podrían tener un potencial prometedor para la administración intracelular de fármacos de alta eficiencia [41, 42], se observó que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina mostraron una mayor intensidad de fluorescencia en comparación con las células tratadas con curcumina libre, lo que sugiere que las NP de CS-BSA podrían mejorar la captación celular de curcumina. En este documento, esta observación indicó que los NP de CS-BSA podrían promover eficazmente la acumulación de fármacos dentro de las células.

La absorción de curcumina libre y curcumina cargó NP de CS-BSA en células RAW 264.7 (M1) durante 6 h. La curcumina mostró un color verde fluorescente e indicó la ubicación intracelular de la curcumina libre y las NP de CS-BSA cargadas con curcumina. El núcleo se tiñó con Hoechst (azul) durante 15 min a 37 ° C. La barra de escala es de 50 μm y se aplica a todas las partes de la figura

Fagocitosis de Aβ 42 inducida por curcumina libre y NP de CS-BSA cargados con curcumina

Como se muestra en la Fig. 5, la curcumina mostró fluorescencia roja a una longitud de onda de excitación de 550 nm y una longitud de onda de emisión de 570 nm. Además, también mostró fluorescencia verde en las longitudes de onda de excitación y emisión de FITC. Por lo tanto, una vez que Aβ 42 marcado con curcumina y FITC se fagocitó en células RAW 264.7 (M1), todas mostraron fluorescencia verde en las longitudes de onda de excitación y emisión de FITC. En el experimento de co-localización, la fluorescencia roja y la fluorescencia verde (que representa la curcumina) se fusionaron y los puntos amarillos representaron la existencia intracelular y la ubicación de la curcumina; algunos puntos verdes no se ubicaron conjuntamente con los puntos fluorescentes rojos, lo que representa la existencia y fagocitosis de Aβ 42 marcado con FITC en células RAW 264.7 (M1). Se observó que pocas cantidades de Aβ 42 fueron fagocitadas por microglia [43], lo cual fue probado por la observación intracelular de fluorescencia verde en las células. Como se muestra en la imagen superpuesta en la Fig.5, en comparación con la curcumina libre, se habían acumulado más puntos fluorescentes amarillos de curcumina dentro de las células, lo que sugiere que una gran cantidad de NP de CS-BSA cargadas con curcumina, representadas por fluorescencia amarilla intensidad, se había acumulado en las células debido a la interacción entre las NP y las células RAW 264.7 (M1). Esto indujo concentraciones intracelulares más altas de curcumina, lo que condujo a un aumento de la fagocitosis de Aβ 42 [44], representado por la mayor intensidad de fluorescencia verde. Se suponía que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina inducían la polarización de los macrófagos, así como los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores contribuían al aumento de la fagocitosis.

Fagocitosis de Aβ 42 inducida por curcumina libre y NP de CS-BSA cargados con curcumina. La barra de escala es de 50 μm y se aplica a todas las partes de la figura

Ensayo de transferencia Western

Para explorar los posibles mecanismos moleculares de la polarización de macrófagos mediada por la curcumina, examinamos los niveles generales de TNF-α, IL-6 y TLR4, así como los niveles de fosforilación de p38, ERK, JNK e IκBα mediante Western Blot para estudiar más a fondo la efectos específicos de la curcumina en la vía de señalización TLR4-MAPK / NF-κB.

La Figura 6 mostró que, en comparación con las células RAW 264.7 normales como grupo de control, las células RAW 264.7 (fenotipo M1) liberaron más factores solubles potencialmente neurotóxicos y citocinas proinflamatorias caracterizadas por niveles más altos de expresión de TNF-α e IL-6, lo que conduce a la muerte neuronal y exacerba el desarrollo de la EA. En comparación con la curcumina libre y de control, las NP de CS-BSA cargadas con curcumina parecieron inhibir la polarización de macrófagos M1 e indujeron la expresión más baja de TNF-α e IL-6 en células RAW 264.7 (fenotipo M1). Además, las NP de CS-BSA cargadas con curcumina también disminuyeron la expresión de TLR4, que regulaba la polarización de los macrófagos M1 y la fosforilación de ERK, JNK, p38 y NF-κB pareció reducirse. Esto sugiere que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina promovieron eficazmente la acumulación de curcumina, y su posterior concentración intracelular, dentro de las células, mejorando así sus efectos de bloqueo en la vía de señalización de TLR4-MAPK / NF-κB e inhibiendo aún más la polarización de macrófagos M1.

Análisis de transferencia Western de los niveles de expresión de TNF-α, IL-6, TLR4 y fosforilación de ERK, JNK, p38 y factor nuclear (NF) -κB en células RAW 264.7 (fenotipo M1) después de tratamientos con curcumina y curcumina libres NP CS-BSA cargados

Discusión

La EA es uno de los trastornos neurodegenerativos más comunes y la principal causa de muerte en los países desarrollados. Con respecto al tratamiento de la EA, la capacidad de la BBB para prevenir la entrada de la mayoría de sustancias exógenas en el cerebro fue el principal obstáculo que impedía su uso. Para abordar este problema, diseñamos NP CS-BSA para mejorar el transporte de curcumina a través del BBB. Los resultados demostraron que, en consonancia con el estudio anterior [45], la curcumina libre penetró con dificultad a través de las células y llegó a cruzar la BBB, lo que resultó en efectos de menor penetración. Las NP de CS-BSA cargadas con curcumina podrían promover eficazmente la penetración del fármaco a través de la BBB con la mediación de vías mediadas por caveolas y micropinocitosis. La neuroinflamación inducida por la agregación de Aβ es uno de los factores críticos que subyacen a los mecanismos patológicos de la EA [46]. Los niveles de Aβ en el cerebro están determinados por el equilibrio dinámico entre la generación y el aclaramiento de Aβ; por lo tanto, la eliminación de Aβ también es importante para determinar su nivel en el cerebro. La capacidad de fagocitosis de la microglía mostró una importancia fisiológica importante en la prevención de la EA. La microglía fue la principal responsable de la eliminación de Aβ-objetivo y tendió a agregar predominantemente alrededor de la zona de deposición de Aβ 42, evitando así la acumulación de Aβ 42 por fagocitosis [47, 48]. Los resultados mostraron que los efectos de fagocitosis de las células RAW 264.7 tratadas con CS-BSA NPs cargadas con curcumina (fenotipo M1) en Aβ 42 aumentaron y que la acumulación y deposición de Aβ 42 se redujeron, lo que puede mejorar el desarrollo de EA.

La microglía (fenotipo M1) libera factores solubles potencialmente neurotóxicos y citocinas proinflamatorias como TNF-α e IL-6, lo que conduce a la muerte neuronal y exacerba el desarrollo de EA [49]. Se encuentra que la polarización de macrófagos M1 depende de la activación de la vía de señalización TLR4-MAPK / NF-κB y que el bloqueo de la vía de señalización TLR4-MAPK / NF-κB podría inhibir la polarización de macrófagos M1 y promover la polarización de macrófagos del tipo M1 al tipo M2 [50]. Nuestros resultados mostraron que la curcumina como componente de la especia india, la cúrcuma (Curcumin longa), un tipo de jengibre, era un potente agente antiinflamatorio que podría reducir la inflamación e incluso podría desempeñar un papel en el tratamiento de la EA. Los NP de CS-BSA sirvieron como herramientas poderosas para la penetración eficiente de curcumina dirigida a BBB. En comparación con la curcumina libre, las NP de CS-BSA cargadas con curcumina indujeron efectos de fagocitosis y las células RAW 264.7 fagocitaron una mayor cantidad de Aβ 42. Además, las NP de CS-BSA cargadas con curcumina indujeron niveles más bajos de expresión de proteínas de TNF-α, IL-6 y TLR4 que la curcumina libre, y también se inhibió la fosforilación de ERK, JNK, p38 y NF-κB. Indicó que las NP de CS-BSA cargadas con curcumina pueden mejorar la fagocitosis de macrófagos inducida por curcumina al inhibir la polarización de macrófagos M1 mediante el bloqueo de la vía de señalización TLR4-MAPK / NF-κB, promoviendo así los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores de la curcumina.

Conclusión

Nuestros datos sugirieron que la curcumina podría usarse como agente terapéutico en el tratamiento de la EA. Las NP de CS-BSA cargadas con curcumina desencadenaron la fagocitosis inducida por células RAW 264.7 de Aβ 42 mediante la penetración mejorada de BBB de la curcumina y una mayor concentración de fármaco intracelular. Además, las NP de CS-BSA cargadas con curcumina indujeron efectos antiinflamatorios y neuroprotectores al inhibir la polarización de macrófagos M1 y bloquear la vía de señalización de TLR4-MAPK / NF-κB. En conjunto, los NP de CS-BSA cargados con curcumina demostraron su potencial para mejorar el tratamiento de la EA.

Abreviaturas

AD:

Enfermedad de Alzheimer

BBB:

Barrera hematoencefálica

BSA:

Albúmina de suero bovino

CS:

Quitosano

LPS:

Lipopolisacárido

NP:

Nanopartículas

TLR:

Receptores tipo peaje

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