Nanopartículas quitosano-albumina bovina cargadas con curcumina mejoran clearance amiloide-β42 y modulan polarización macrófagos en Alzheimer

Resumen

La enfermedad Alzheimer (EA) sigue siendo el trastorno neurodegenerativo principal en adultos mayores, pero terapias efectivas están limitadas por barrera hematoencefálica (BHE), pobre clearance amiloide-β (Aβ) y neuroinflamación crónica. Diseñamos nanopartículas (NPs) quitosano (CS)–albumina sérica bovina (BSA) para entregar curcumina —polifenol potente antiinflamatorio y anti-amiloideogénico— directamente al cerebro. NPs curcumina-cargadas CS-BSA lograron 95,4 % eficiencia encapsulación, 143,5 nm diámetro medio y carga superficial negativa –10,8 mV, asegurando estabilidad y permeabilidad BHE favorable. Modelos BHE in vitro mostraron 60,2 % penetración NPs tras 3 h, marcadamente superior a curcumina libre (29,8 %). Estudios captación celular revelaron niveles intracelulares curcumina aumentados en macrófagos RAW 264.7, que a su vez incrementaron fagocitosis Aβ42. Mecánicamente, NPs suprimieron eje TLR4-MAPK/NF-κB, down-regulando citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6) y desplazando macrófagos de fenotipo neurotóxico M1 a protector M2. Estos hallazgos demuestran que NPs curcumina-cargadas CS-BSA potencian clearance Aβ42 mientras modulan neuroinflamación, ofreciendo plataforma nanomedicina prometedora para terapia EA.

Introducción

EA se caracteriza por declive cognitivo progresivo y depósito característico fibrillas Aβ42 extracelulares. Mientras Aβ42 monomérico es fisiológicamente benigno, agregados oligoméricos son altamente neurotóxicos e impulsan progresión enfermedad. Dirigir agregación Aβ42 y promover su clearance son por tanto centrales a estrategias terapéuticas. Células microgliales, macrófagos residentes del cerebro, reconocen Aβ via receptores toll-like (TLRs) y fagocitan péptido. Sin embargo, activación crónica polariza microglia hacia fenotipo proinflamatorio M1, exacerbando lesión neuronal. Promover desplazamiento a fenotipo antiinflamatorio M2 ha emergido como enfoque modificador enfermedad viable.

Curcumina, derivada cúrcuma (Curcuma longa), exhibe propiedades anti-amiloideogénicas, antioxidantes y quelantes metal. Puede modular polarización macrófagos inhibiendo cascada señalización TLR4-MAPK/NF-κB. Desafortunadamente, pobre solubilidad curcumina, metabolismo rápido y permeabilidad BHE limitada curtan su utilidad clínica.

Portadores nanopartículas pueden superar estas barreras. CS es polisacárido catiónico, biocompatible, capaz formar complejos estables con proteínas aniónicas como BSA. BSA es abundante en plasma, no inmunogénica, y confiere características liberación sostenida a nanopartículas. Combinando CS y BSA, fabricamos NPs cargadas curcumina optimizadas para traversia BHE y entrega dirigida a microglia.

Materiales

CS (desacetilación 80 %, ~400 kDa) provino Haixin Biological Product Co., Ltd. BSA (Sigma-Aldrich), curcumina (Dalian Meilun Biotechnology), y Aβ42 marcado FITC (Chinese Peptide Co.) se compraron comercialmente. Líneas celulares RAW 264.7 (monocito-macrófago ratón) y hCMEC/D3 (endotelial microvascular cerebral humano) se cultivaron en DMEM suplementado 10 % suero fetal bovino y antibióticos. LPS (1 µg/ml) usó para polarizar RAW 264.7 a fenotipo M1, imitando activación microglial en EA.

Preparación NPs curcumina-cargadas CS-BSA

CS disolvió en ácido acético 0,1 % (0,5 mg/ml). Curcumina (0,05 mg/ml en 100 µl DMSO) mezcló en solución CS bajo agitación magnética temperatura ambiente. Solución BSA (1,0 mg/ml) añadió gota a gota, produciendo suspensión opalescente que condensó en nanopartículas sólidas via interacción electrostática. Tamaño partícula, potencial zeta y morfología caracterizaron por dispersión luz dinámica y TEM. Liberación in vitro evaluó en salino fosfato-amortiguado (pH 7,4) a 37 °C, y eficiencia encapsulación (EE) calculó como EE % = (W_total – W_libre)/W_total × 100 % donde W_total cantidad curcumina inicial y W_libre sobrenadante.

Evaluación apoptosis celular por MTT

NPs CS-BSA blancas (0–2,0 mg/ml) incubaron con RAW 264.7 (M1) y hCMEC/D3 24 h para evaluar citotoxicidad via ensayo MTT.

Estudios penetración usando modelo BHE in vitro

Monocapa células hCMEC/D3 (TEER > 300 Ω) cultivó en inserts Transwell. Curcumina libre o NPs curcumina-cargadas CS-BSA (equivalente curcumina 100 µg/ml) añadieron cámara superior. Tras 3 h incubación 37 °C, intensidad fluorescencia curcumina (excitación 425 nm, emisión 530 nm) cámara inferior midió. Ratio fluorescencia relativa (RFR %) cuantificó eficiencia penetración. Inhibidores endocíticos (clorpromazina, genisteína, citochalasina D, azida sódica) aplicaron para elucidar mecanismos transporte.

Captación celular NPs curcumina-cargadas CS-BSA

Microscopía confocal láser (CLSM) evaluó distribución intracelular curcumina en RAW 264.7 (M1) tras exposición curcumina libre o NPs cargadas via sistema Transwell. Fluorescencia verde curcumina monitorizó a intervalos 6, 12 y 24 h.

Detección fagocitosis Aβ42 inducida curcumina libre y NPs curcumina-cargadas CS-BSA

RAW 264.7 (M1) pretratados curcumina libre o NPs cargadas incubaron con Aβ42 marcado FITC 3 h. Fagocitosis cuantificó por fluorescencia CLSM y citometría flujo.

Ensayo Western blot

Niveles expresión TNF-α, IL-6, TLR4 y estados fosforilación ERK, JNK, p38, IκBα, NF-κB examinaron por Western blot para elucidar impacto NPs curcumina-cargadas en eje TLR4-MAPK/NF-κB.

Resultados

Caracterización NPs curcumina-cargadas CS-BSA

Dispersión luz dinámica reveló diámetro medio 143,5 nm, potencial zeta –10,8 mV, índice polidispersidad 0,021. Imágenes TEM confirmaron partículas esféricas, monodispersas (Figura 1). Eficiencia encapsulación alcanzó 95,4 %. Perfil liberación mostró ráfaga inicial 11,3 % dentro 3 h, seguida liberación sostenida 48 h, indicando protección efectiva curcumina durante circulación.

Penetración modelo BHE in vitro

Penetración curcumina libre: 12,3 % (1 h), 20,3 % (2 h), 29,8 % (3 h). NPs curcumina-cargadas: 37,7 %, 45,6 %, 60,2 % mismos puntos tiempo, respectivamente (Figura 2). Experimentos inhibición endocitosis demostraron NPs dependieron vías dependientes energía, mediadas caveolae y macropinocitosis, mientras curcumina libre entró células primariamente por difusión pasiva.

Evaluación citotoxicidad

Ensayos MTT confirmaron NPs CS-BSA blancas no citotóxicas RAW 264.7 (M1) y hCMEC/D3 concentraciones hasta 2,0 mg/ml (Figura 3).

Captación celular

Imagen CLSM mostró acumulación tiempo-dependiente curcumina dentro RAW 264.7 (M1). NPs curcumina-cargadas produjeron fluorescencia intracelular marcadamente mayor que curcumina libre, indicando entrega mejorada (Figura 4).

Fagocitosis Aβ42 mejorada

Co-localización curcumina (rojo) y FITC-Aβ42 (verde) demostró NPs curcumina-cargadas aumentaron presencia intracelular Aβ42 en RAW 264.7 (M1), evidenciado mayor densidad fluorescencia verde (Figura 5). Sugiere curcumina intracelular elevada aumenta capacidad fagocítica microglial.

Análisis Western blot

Comparado controles no tratados, RAW 264.7 (M1) polarizados LPS exhibieron TNF-α, IL-6, TLR4 elevados y aumento fosforilación ERK, JNK, p38, NF-κB. NPs curcumina-cargadas redujeron marcadamente marcadores proinflamatorios y eventos señalización, subrayando capacidad inhibir polarización M1 (Figura 6).

Discusión

Nuestros resultados confirman nanopartículas CS-BSA mejoran significativamente entrega curcumina a través BHE, primariamente vía caveolae- y macropinocitosis-mediadas. Mejor penetración cerebral se traduce en concentraciones intracelulares curcumina mayores, que a su vez aumentan fagocitosis Aβ42 microglial y reducen carga patológica placas amiloides.

Efecto antiinflamatorio NPs curcumina-cargadas es evidente mediante supresión cascada TLR4-MAPK/NF-κB y down-regulación TNF-α, IL-6, TLR4. Esta modulación citoquinas re-polariza macrófagos fenotipo neurotóxico M1 hacia estado antiinflamatorio M2, estrategia terapéutica cada vez más reconocida para modificación enfermedad EA.

Colectivamente, estos hallazgos posicionan NPs curcumina-cargadas CS-BSA como plataforma nanomedicina multifacética que simultáneamente aborda entrega fármaco, clearance amiloide y neuroinflamación —obstáculos clave tratamiento EA.

Conclusión

Nanopartículas curcumina-cargadas CS-BSA penetran efectivamente BHE, aumentan acumulación intracelular curcumina y promueven fagocitosis Aβ42 por microglia. También mitigan neuroinflamación inhibiendo vía TLR4-MAPK/NF-κB y favoreciendo polarización M2 macrófagos. Estos atributos colectivamente subrayan promesa terapéutica esta nanoplataforma para enfermedad Alzheimer.

Abreviaturas

EA

Enfermedad Alzheimer

BHE

Barrera hematoencefálica

BSA

Albumina sérica bovina

CS

Quitosano

LPS

Lipopolisacárido

NPs

Nanopartículas

TLRs

Receptores toll-like