Detección colorimétrica ultra-sensible de tuberculosis usando complejos antígeno-anticuerpo ESAT-6 y nanopartículas de oro

Resumen

La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa principal de mortalidad mundial, impulsada por el factor de virulencia ESAT-6, objetivo antigénico secretorio temprano de Mycobacterium tuberculosis. La detección rápida, a baja concentración, de ESAT-6 es esencial para intervención temprana y contención de la enfermedad. Presentamos un ensayo colorimétrico basado en anticuerpos, de un solo paso, que emplea nanopartículas de oro (GNPs) de 15 nm y un mecanismo de agregación inducido por sal para lograr límite de detección de 1,25 pM. El método explota el desplazamiento espectral rojo de GNPs dispersas cuando está presente el complejo ESAT-6/anticuerpo, manteniendo estabilidad en presencia de proteínas no específicas como proteína de filtrado de cultivo 10-kDa (CFP-10). La concentración óptima de anticuerpo se determinó en 60 nM; exceder este umbral causó pérdida de sensibilidad 680-veces por apiñamiento estérico. Este ensayo demuestra alta especificidad, biofouling mínimo y ofrece lectura visual rápida apta para diagnóstico point-of-care de TB.

Antecedentes

TB es causada por Mycobacterium tuberculosis y representa amenaza severa para salud global. Infección temprana latente puede progresar a enfermedad activa cuando inmunidad huésped decae, enfatizando necesidad de diagnósticos rápidos y sensibles en etapa latente. Pruebas convencionales —tuberculina cutánea, ensayos liberación interferón-γ, radiografía tórax, citología esputo y cultivo— son laboriosas, costosas y a menudo retrasadas por meses. Así, una estrategia de detección simple, asequible y rápida es urgentemente requerida.

Sensores colorimétricos basados en nanopartículas oro (GNP) han emergido como herramientas poderosas para diagnóstico de enfermedades debido a su fuerte resonancia plasmónica superficial y propiedades ópticas ajustables. GNPs monodispersos 15 nm exhiben tono rojo característico que cambia a azul tras agregación desencadenada por iones divalentes, como NaCl. Este cambio color, impulsado por desplazamiento espectral rojo, forma base de muchos ensayos rápidos para virus, bacterias y moléculas pequeñas. Sin embargo, el rendimiento de ensayos GNP basados en DNA o aptámeros puede verse limitado por interacciones electrostáticas e incompatibilidades sonda-objetivo, especialmente con secuencias ácido nucleico largas.

Para superar estos desafíos, desarrollamos un ensayo colorimétrico basado en anticuerpos, de un solo paso, que objetivo la proteína ESAT-6 6 kDa. Pre-complejando ESAT-6 con su anticuerpo policlonal específico antes de exposición a GNPs, prevenimos unión no específica y habilitamos plataforma de detección visual altamente sensible. La Figura 1 ilustra flujo trabajo ensayo y controles especificidad usando CFP-10.

Métodos

Reactivos y Biomoléculas

ESAT-6 y CFP-10 10-kDa se compraron de Sino Biological Inc. (Beijing, China). Anticuerpo policlonal anti-ESAT-6 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (USA). GNPs 15 nm citrato-capped se obtuvieron de Sigma Aldrich (USA). Todos los reactivos se usaron sin purificación adicional.

Optimización Iones Divalentes para Agregación GNP

Para identificar concentración óptima NaCl para inducir agregación GNP, rango NaCl (50–800 mM) se añadió a volumen fijo GNPs (1 O.D.). Tras 15 min, cambio color se registró y espectro absorbancia (400–800 nm) midió usando Nanofotómetro.

Evaluación Biofouling ESAT-6 en Superficie GNP

Para evaluar adsorción no específica ESAT-6 en GNPs, concentraciones variables (1,5–100 nM) incubaron con GNPs seguido adición NaCl óptimo. Cambios colorimétricos y espectrales se observaron. CFP-10 usó para confirmar especificidad.

Optimización Concentración Anticuerpo Anti-ESAT-6 en Superficie GNP

Concentraciones anticuerpo anti-ESAT-6 (30–500 nM) mezclaron con GNPs, incubaron 30 min, y desafiaron con NaCl creciente para identificar nivel anticuerpo que maximiza estabilidad dispersión.

Detección ESAT-6 vía Desplazamiento Espectral Rojo Colorimétrico Basado en Anticuerpo

1 µL 1 µM ESAT-6 (final 500 nM) mezcló con 1 µL concentración anticuerpo optimizada. Tras 30 min, 20 µL GNPs añadieron e incubaron otro 30 min. NaCl añadió a concentración final 800 mM, y espectro absorbancia (400–800 nm) registró. Dilución serial ESAT-6 (0–500 nM) usó para determinar límite detección, abarcando rangos picomolar a nanomolar.

Resultados y Discusión

El ensayo aprovecha el desplazamiento espectral rojo que ocurre cuando GNPs agregan en presencia del complejo ESAT-6/anticuerpo. En ausencia ESAT-6, el anticuerpo recubre superficie GNP, preservando tono rojo incluso tras adición NaCl, mientras presencia ESAT-6 desencadena agregación y cambio azul.

Optimización NaCl

GNPs permanecieron rojos a concentraciones NaCl bajo 100 mM, pero comenzaron agregar a 100 mM, produciendo desplazamiento espectral rojo centrado ~600 nm. Para sensibilidad máxima, 800 mM NaCl seleccionado para asegurar agregación completa en ausencia cobertura anticuerpo.

Optimización Concentración Anticuerpo

A 30 nM anticuerpo, GNPs aún agregaron incluso con 800 mM NaCl, indicando cobertura superficial insuficiente. Desde 60 nM, GNPs mantuvieron color rojo bajo mismo desafío sal, demostrando dispersión efectiva. Concentraciones arriba 60 nM no proveyeron beneficio adicional y arriesgaron apiñamiento anticuerpo.

Detección ESAT-6 y Validación Biofouling

ESAT-6 (hasta 100 nM) no unió a GNPs, previniendo falsos positivos/negativos. Cuando pre-complejado con 60 nM anticuerpo, ensayo mostró cambio color claro rojo a azul a tan bajo 0,5 nM ESAT-6, con saturación completa observada entre 15–500 nM. Espectras confirmaron desplazamiento rojo hacia 600 nm a concentraciones arriba 1,25 pM.

Límite Detección

Titulando ESAT-6 1,25 pM a 5 nM, ensayo mantuvo cambio color azul claro y desplazamiento espectral ~600 nm. Límite detección (LOD) establecido 1,25 pM, superando muchos diagnósticos colorimétricos TB existentes.

Confirmación Especificidad

Usando 75 nM anticuerpo, LOD aumentó rango nanomolar, confirmando papel crítico concentración anticuerpo. CFP-10, a pesar ser antígeno TB, no desencadenó agregación, validando especificidad ensayo.

Conclusiones

Este estudio demuestra ensayo colorimétrico rápido, single-step, basado en nanopartículas oro, que alcanza límite detección 1,25 pM para antígeno TB ESAT-6. La alta especificidad del método, confirmada por controles CFP-10, y su dependencia en anticuerpo/antígeno pre-complejado reducen biofouling y aumentan sensibilidad. La simplicidad del ensayo, lectura visual y requisitos mínimos equipamiento lo hacen candidato fuerte para screening TB point-of-care, especialmente en entornos recursos limitados. Trabajos futuros explorarán extender esta plataforma a otros biomarcadores proteína pequeña e integrarla en dispositivos diagnósticos portátiles.

Abreviaturas

CFP-10:

Proteína filtrado cultivo 10 kDa

DNA:

Ácido desoxirribonucleico

ESAT-6:

Objetivo antigénico secretorio temprano 6 kDa

GNP:

Nanopartícula oro

NaCl:

Cloruro sodio

O.D.:

Una densidad óptica (unidad concentración GNP)

RNA:

Ácido ribonucleico

TB:

Tuberculosis

UV:

Ultravioleta